骨形成蛋白-7对肾小管上皮细胞转分化及结缔组织生长因子表达的影响

目的 观察骨形成蛋白-7(BMP-7)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导人近端肾小管上皮细胞(HK-2)向间充质细胞转分化(EMT)及表达结缔组织生长因子(CTGF)的影响,探讨其抑制、逆转肾间质纤维化的可能机制.方法 将体外培养的HK-2细胞分为对照组,3 ng/ml TGF-β1组,TGF-β1同时加不同浓度BMP-7(100～400 ng/ml)组.相差显微镜观察细胞形态改变;间接免疫荧光测定E-cadherin的表达;RT-PCR和Western印迹分别检测α-SMA、E-cadherin、CTGF mRNA和蛋白的表达.结果 3 ng/ml TGF-β1刺激48 h后,HK-2细胞由立方形铺路石样转变为梭形长条样;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预48 h,可见到大部分细胞逆转回原来的形态.免疫荧光显示,E-cadherin蛋白在正常HK-2细胞质膜高表达;3 ng/ml TGF-β1刺激后,E-cadherin表达明显减弱;去除TGF-β1,再加入200 ng/ml BMP-7干预后,E-cadherin表达重新恢复.RT-PCR及Western印迹显示,3 ng/mlTGF-β1刺激48 h后,α-SMA mRNA及蛋白表达明显上调、E-cadherin mRNA及蛋白表达明显减少,同时CTGF mRNA及蛋白表达明显增加(P<0.01);BMP-7与TGF-β1共同刺激48 h后,BMP-7呈剂量依赖性抑制TGF-β1诱导下α-SMA mRNA及蛋白的表达,并逐渐恢复E-cadherin mRNA及蛋白的表达,同时下调CTGF mRNA及蛋白的表达,400 ng/ml BMP-7组与TGF-β1组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 BMP-7能阻断并逆转TGF-β1诱导的EMT,下调CTGF的表达,这可能是其逆转肾间质纤维化的重要作用机制.     

肝内胆管上皮细胞上皮-间叶转化的实验研究

目的观察人肝内胆管上皮细胞(human intrahepatic biliary epithelial cells,HIBEpiC)上皮-间叶转化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)现象,探讨EMT在胆管周围纤维化中的作用及其可能的分子机制。方法HIBEpiC用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理48、72 h后,用PCR及Western blot技术检测E-cadherin、S100A4和α-SMA的表达,以及与EMT信号通路相关的TGF-β1的表达;同时用紫杉醇、siRNA smad2/3阻断TGF-β1的作用,探讨TGF-β1/smad2/3信号通路在HIBEpiC发生EMT时的可能作用。结果HIBEpiC经LPS处理后,TGF-β1 mRNA表达于48 h达到高峰,72 h后开始下降,但维持较高水平(P<0.01,P<0.05);EMT标志物E-cadherin mRNA和蛋白表达随培养时间的延长逐渐降低(P<0.01),而S100A4、α-SMA mRNA及蛋白表达明显上调(P<0.01,P<0.05)。紫杉醇可使HIBEpiC中LP...     

叉头框蛋白O3a表达下调对人肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:研究叉头框蛋白O3a(forkhead box protein O3a,Fox O3a)下调对人肾小管上皮细胞(HK-2)上皮-间质转化(EMT)的影响和机制。方法:体外培养HK-2细胞,10 ng/m L TGF-β1诱导HK-2细胞建立EMT细胞模型,Western blot检测E-cadherin、α-SMA表达,证明细胞EMT模型建立成功。Western blot检测在EMT细胞和正常细胞中转录因子Fox O3a的表达变化。敲低正常HK-2细胞中的Fox O3a后,Western blot检测细胞的EMT程度。Western blot检测EMT细胞与低表达Fox O3a细胞中β-Catenin的表达变化。结果:TGF-β1处理HK-2细胞作用后E-cadherin表达量显著减少(P0.01),α-SMA蛋白表达量明显增加(P0.05),证明EMT细胞模型建立成功。与正常HK-2细胞相比,EMT细胞中转录因子Fox O3a显著减少(P0.01)。敲低HK-2细胞中的Fox O3a后,E-cadherin表达量显著减少(P0.01),α-SMA蛋白表达量明显增加(P0.05),出现EMT现象。相比于正常细胞,EMT细胞的β-Catenin表达增加(P0.05);Fox O3a敲低的细胞中β-Catenin表达也显著增加(P0.01)。结论:HK-2细胞通过降低转录因子Fox O3a的表达,从而上调β-Catenin,促进细胞上皮-间质转分化。     

地塞米松对马兜铃酸诱导的人肾小管上皮-间充质转化的作用及可能机制

目的探讨地塞米松(Dex)对马兜铃酸诱导的肾小管上皮-间充质转化(EMT)的影响及可能机制。方法体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为阴性对照组、马兜铃酸(AA,10μg/ml)作用组、Dex(100μmol/L)作用组、AA(10μg/ml)+无水乙醇(100μmol/L)组、AA(10μg/ml)+Dex(100、10、1、0.1、0.01μmol/L)共同作用组,培养细胞48h,应用激光共聚焦显微镜(CFMS)观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)的表达,采用Real-timePCR和WesternBlot方法检测α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad7mRNA和蛋白的表达。结果 AA作用48h后,CFMS观察发现HKC细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强;地塞米松干预后,E-cadherin表达逐渐增强而α-SMA表达减弱,且呈剂量依赖性。Real-timePCR、WesternBlot结果均显示,与阴性对照组相比,AA组α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白表达水平均显著增强,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达均减弱(P0.05)。同AA作用组比较,AA+Dex共同作用组随Dex剂量增加,α-SMA、p-Smad3、TGF-β1mRNA和蛋白的表达逐渐减弱,E-cadherin、Smad7mRNA和蛋白的表达逐渐增强(P0.05),而无水乙醇却无此作用。结论 Dex可抑制AA诱导HKC细胞发生EMT,并同时下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad3的表达、上调Smad7分子的表达,提示TGF-β1/Smad下调可能是Dex抑制EMT发生的机制之一。     

枸杞多糖改善肾小管上皮细胞间质纤维化的研究

目的 探讨枸杞多糖(LBP)对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导肾小管上皮细胞间质纤维化的影响及其作用机制。方法 体外培养人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2),分为对照组、TGF-β1组和LBP+TGF-β1组。TGF-β1组细胞给予10 ng/mL TGF-β1,处理24h; LBP+TGF-β1组细胞给予10 ng/mL TGF-β1处理24 h后,再给予20 mmol/L LBP干预24 h;对照组细胞不做任何处理。通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测Vimentin,纤连蛋白(FN),Snail和E-adherin的mRNA表达水平;通过RT-qPCR和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测胶原蛋白Ⅰ(ColⅠ)和胶原蛋白Ⅲ(ColⅢ)的表达;通过Western blot检测细胞中TGF-β1和smad3的表达水平。结果 RT-qPCR结果表明与对照组相比,TGF-β1组HK-2细胞Vimentin、FN、Snail的mRNA表达水平显著升高(P<0.05),E-adherin mRNA的表达水平显著降低(P<0.05);α-SMA、Col I和Col II...     

The effect and mechanism of dexamethasone on AA induced epithelial-mesenchymal transition in HKC cells

目的 探讨地塞米松( Dex)对马兜铃酸诱导的肾小管上皮-间充质转化(EMT)的影响及可能机制.方法 体外培养的人肾小管上皮细胞(HKC)分为阴性对照组、马兜铃酸(AA,10μg/ml)作用组、Dex(100μmol/L)作用组、AA(10 μg/ml)+无水乙醇(100 μmol/L)组、AA( 10 μg/ml )+Dex( 100、10、1、0.1、0.01 μmol/L)共同作用组,培养细胞48 h,应用激光共聚焦显微镜(CFMS)观察α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏素(E-cadherin)的表达,采用Real-time PCR和Western Blot方法检测α-SMA、E-cadherin、p-Smad 3、转化生长因子-β1(TGF-β1)、Smad 7 mRNA和蛋白的表达.结果 从作用48 h后,CFMS观察发现HKC细胞E-cadherin表达减弱而α-SMA表达增强;地塞米松干预后,E-cadherin表达逐渐增强而α-SMA表达减弱,且呈剂量依赖性.Real-time PCR、Western Blot结果均显示,与阴性对照组相比,从组α -SMA、p-Smad 3、TGF-β1 mRNA和蛋白表达水平均显著增强,E-cadherin、Smad 7 mRNA和蛋白的表达均减弱(P＜0.05).同AA作用组比较,从+Dex共同作用组随Dex剂量增加,α-SMA、p-Smad 3、TGF-β1 mRNA和蛋白的表达逐渐减弱,E-cadherin、Smad7 mRNA和蛋白的表达逐渐增强(P＜0.05),而无水乙醇却无此作用.结论 Dex可抑制从诱导HKC细胞发生EMT,并同时下调EMT过程中TGF-β1和p-Smad 3的表达、上调Smad 7分子的表达,提示TGF-β1/Smad下调可能是Dex抑制EMT发生的机制之一.     

螺内酯对清蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨螺内酯对人清蛋白诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)发生转分化的影响,以及该过程是否通过转化生长因子β1(TGF-β1)/Smads信号通路发挥作用。方法体外培养HK-2细胞,将其随机分为7组:A组(未加刺激物)、B组(加入10-7 mol/L螺内酯)、C组(加入5mg/mL清蛋白)、D组(加入5mg/mL清蛋白及10-8 mol/L螺内酯)、E组(加入5mg/mL清蛋白及10-7 mol/L螺内酯)、F组(加入5mg/mL清蛋白及10-6 mol/L螺内酯)、G组(先加10μmol/L TGF-β1拮抗剂,30min后加入5mg/mL清蛋白)。采用RT-PCR检测TGF-β1和整合素连接激酶(ILK)的mRNA表达;细胞免疫荧光检测上皮钙黏素(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;ELISA法检测纤维连接蛋白(FN)的蛋白水平。结果 C组ILK mRNA,α-SMA、FN蛋白较其他各组表达明显增高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达明显下降(P<0.05),而TGF-β1mRNA表达高于除G组以外其余各组(P<0.05)。与G组相比,C组TGF-β1mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),而ILK mRNA,α-SMA、FN蛋白表达明显下降(P<0.05),E-cadherin表达明显升高(P<0.05)。D、E、F组TGF-β1、ILKmRNA、α-SMA,FN蛋白表达逐渐下降,组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05);E-cadherin的表达逐渐增高(P<0.05)。结论一定浓度的清蛋白可以诱导体外培养的HK-2细胞发生转分化;螺内酯可抑制人清蛋白诱导HK-2细胞转分化作用,且呈剂量依赖性;TGF-β1/Smads信号通路可能是此过程中的重要通路。     

淫羊藿苷对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化的作用及机制

[目的] 观察淫羊藿苷对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的肾小管上皮-间质转化的作用以及对Smad信号通路的影响。[方法] 将肾小管上皮细胞(HK-2)分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+淫羊藿苷(10、20、40 μmol/L)组。采用CCK-8法检测10、20、40 μmol/L的淫羊藿苷干预10 μg/L TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞的增殖影响; 使用实时定量聚合酶链式反应法检测检测上皮间质转化分管关键因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)mRNA的表达量; 采用Western blot检测α-SMA、E-cadherin、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达量; 划痕实验和侵袭迁移小室法(Transwell小室)分别检测HK-2细胞的迁移和侵袭能力。[结果] 与空白对照组比较, TGF-β1组的HK-2细胞增殖、迁移和侵袭能力显著增高(P<0.05), α-SMA、vimentin蛋白和mRNA以及p-Smad2/3蛋白表达量显著增加(P<0.05), 而E-cadherin、Smad2/3蛋白和mRNA表达量显著降低(P<0.05)。与TGF-β1组比较, TGF-β1+淫羊藿苷(10、20、40 μmol/L)组的HK-2细胞增殖、迁移和侵袭能力显著降低(P<0.05), α-SMA、vimentin蛋白和mRNA以及p-Smad2/3蛋白表达量显著降低(P<0.05), 而E-cadherin、Smad2/3蛋白和mRNA表达量显著增加(P<0.05)。淫羊藿苷对TGF-β1诱导HK-2细胞抑制增殖、迁移和侵袭能力以及上皮间质转化无剂量依赖性。[结论] 淫羊藿苷可以抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的上皮-间质转化的分化, 可能与抑制Smad信号通路有关。     

红细胞生成素对人白蛋白诱导肾小管上皮细胞转分化的作用

目的探讨红细胞生成素(EPO)对人白蛋白诱导的正常人近端肾小管上皮细胞(HK-2细胞)转分化的作用。方法将体外培养的HK-2细胞随机分为空白对照组(未加任何刺激物)、EPO诱导组(EPO终浓度为20 U/mL)、白蛋白诱导组(白蛋白终浓度5 mg/mL)、EPO干预组(EPO终浓度分别为5、10、20 U/mL)及转化生长因子β1(TGF-β1)拮抗剂组(SB431542终浓度为10μmol/L,加入SB431542 30 min后加白蛋白,白蛋白终浓度为5 mg/mL),各组均刺激24 h。应用RT-PCR法检测细胞TGF-β1 mRNA的水平;细胞免疫荧光法检测细胞E-钙黏蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的蛋白表达;ELISA法检测上清液纤维连结蛋白(FN)的蛋白表达。结果 RT-PCR结果表明白蛋白诱导组TGF-β1 mRNA较空白对照组显著升高(P<0.05),给予EPO干预后TGF-β1 mRNA显著下调(P<0.05);细胞免疫荧光及ELISA结果显示白蛋白诱导组E-cadherin的蛋白表达较空白对照组显著下降,α-SMA、FN的蛋白表达显著上升(P<0.05),而在EPO干预组及TGF-β1拮抗剂组E-cadherin的蛋白表达较白蛋白诱导组显著上调,α-SMA、FN的蛋白表达显著下调(P<0.05),且与EPO的浓度有关。结论 EPO可抑制白蛋白诱导的HK-2细胞的转分化,从而延缓肾间质纤维化,其机制可能与阻断TGF-β1的作用有关。     

VEGF对上皮间充质转化的抑制与Smad信号途径及SnoN表达的变化

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导HK-2细胞发生肾小管上皮-间充质细胞转化(EMT)的过程中对Smad2/3,Smad7信号途径以及SnoN表达的影响。方法体外培养的HK-2细胞分为:①正常对照组;②TGF-β1(5μg/L)阳性对照组;③VEGF165(100μg/L)作用组;④TGF-β1(5μg/L)+VEGF165(100μg/L)共同作用组。采用WesternBlot法和RT-PCR分别检测各组细胞p-Smad2/3和Smad2/3(共同作用30和60min),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Smad7、SnoN的表达水平(共同作用48h)。结果 TGF-β1组α-SMA蛋白和mRNA表达与正常对照组比较明显增强,TGF-β1与VEGF165共同作用组α-SMA蛋白和mRNA表达与TGF-β1单独作用组比较明显减弱(P0.05)。体外HK-2细胞,TGF-β1组刺激30、60min,与正常对照组比较,(p-Smad2/3)/(Smad2/3)比值明显升高,TGF-β1+VEGF165组与TGF-β1单独作用组相比明显下降,且以30min时下降明显。TGF-β1组作用48h与正常对照组比较,Smad7蛋白和mRNA表达明显下降,VEGF165+TGF-β1组较TGF-β1单独作用组Smad7表达明显升高(P0.05)。VEGF165组与正常对照组相比,α-SMA、(p-Smad2/3)/(Smad2/3)、Smad7蛋白和mRNA表达的差异无统计学意义(P﹥0.05)。TGF-β1组SnoN蛋白表达与正常对照组比较明显增强(P0.05),TGF-β1与VEGF165共同作用组SnoN蛋白表达与TGF-β1单独作用组相比差异无统计学意义(P﹥0.05),各组SnoNmRNA表达差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论 VEGF165抑制TGF-β1诱导HK-2细胞EMT的机制可能与直接抑制Smad2/3磷酸化、上调Smad7信号表达有关,而与调节SnoN表达无关。     

丹参酮Ⅱ A对人肾小管上皮细胞TGF-β_1/smad信号通路的干预作用

目的:探讨中药单体丹参酮ⅡA抗肾间质纤维化可能的作用机制。方法:将体外正常培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)随机分为空白对照组、转化生长因子(TGF-β1)组(TGF-β1,10 ng/ml)、丹参酮ⅡA低剂量组(丹参酮ⅡA 1μg/ml+TGF-β110 ng/ml)、丹参酮ⅡA中剂量组(丹参酮ⅡA 5μg/ml+TGF-β110 ng/ml)、丹参酮ⅡA高剂量组(丹参酮ⅡA 10μg/ml+TGF-β110 ng/ml),分别予相应的药物干预后吸取细胞上清液,用ELISA法检测Ⅲ型胶原的含量,细胞裂解后采用Western-blot法检测smad2和smad3的蛋白表达量。结果:与空白对照组比较,TGF-β1组的Ⅲ型胶原表达明显上升,加入丹参酮ⅡA后各剂量组的Ⅲ型胶原表达均下降,且呈剂量效应关系;TGF-β1组能促进smad2、smad3蛋白的表达,加入丹参酮ⅡA后各剂量组的smad2蛋白、smad3蛋白的表达量均低于TGF-β1组,但是无明显的剂量效应关系。结论:丹参酮ⅡA可以抑制TGF-β1诱导的Ⅲ型胶原的分泌,且可抑制由TGF-β1介导的smad2、smad3信号蛋白的表达,表明丹参酮ⅡA可能是通过抑制TGF-β1/smad信号通路中smad2、smad3蛋白的表达发挥其抗肾间质纤维化的作用。     

丹参酮ⅡA对腹膜透析液诱导的人腹膜间皮细胞转分化及致纤维化因子表达的影响

目的腹膜纤维化是长期腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)的常见并发症,也是透析不充分和退出PD的主要原因,研究表明丹参酮ⅡA能改善各种组织中的纤维化。文中研究丹参酮ⅡA磺酸钠注射液对在高糖腹膜透析液(peritonealdialysis fluid,PDF)诱导下体外培养的人腹膜间皮细胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMCs)纤维化及其相关因子表达的影响。方法选择非尿毒症、非糖尿病择期手术患者的大网膜作为HPMCs的来源,将培养的细胞随机分成4组:对照组、PDF组、丹参酮1组(含丹参酮ⅡA浓度为50μmol/L的PDF组)、丹参酮2组(含丹参酮ⅡA浓度为100μmol/L的PDF组),同步培养72h后,应用间接免疫荧光法检测α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、上皮钙黏素(E-cadherin)表达,实时荧光定量PCR检测E-cadherin、α-SMA、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)、Ⅰ型胶原酶(CollagenⅠ)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、smad2、smad7 mRNA表达。结果免疫荧光法发现,丹参酮ⅡA能显著抑制高糖诱导的E-cadherin低表达和α-SMA高表达。Real-time-PCR发现,添加丹参酮ⅡA的PDF组α-SMA、FN、CollagenⅠ、TGF-β1、smad2 mRNA表达与PDF组比较显著下调(P<0.05);E-cadherin、smad7 mRNA表达显著上调(P<0.05)。结论在PDF中添加丹参酮ⅡA可显著减轻PDF导致的HPMCs转分化,从而抑制纤维化相关因子的表达。     

转化生长因子β1对L929细胞增殖转分化及细胞外基质代谢的影响

目的 探讨转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)对L929细胞增殖的影响,为体外研究预防食管内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection,ESD)术后狭窄提供理论基础.方法 实验分为两组,①空白对照组:L929细胞不做处理;②TGF-β1组,用10 ng/mL TGF-β1 持续刺激L929细胞,依据刺激时间不同又分为24、48、72、96、120 h 5个亚组.观察各组对细胞增殖的影响.用CCK-8法检测细胞增殖,qPCR检测α-SMA及Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原、MMP1、TIMP1 mRNA 表达,Western blot检测α-SMA、MMP1、TIMP1蛋白水平,ELISA检测Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原合成.结果 与空白对照组比较,TGF-β1组细胞增殖能力显著增高(P＜0.05),TGF-β1组α-SMA、Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原、MMP1、TIMP1 mRNA表达均显著升高(P＜0.05);TGF-β1刺激24 h组Ⅰ型前胶原合成增加(P＜0.05),TGF-β1组Ⅲ型前胶原合成增加(P＜0.05);TGF-β1组MMP1、TIMP1蛋白表达增加(P＜0.05).结论 TGF-β1能促进L929细胞增殖,并诱导L929细胞向肌成纤维细胞转分化,同时促进Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原以及MMP1、TIMP1合成.     

TGF-β1诱导Ⅱ型肺泡上皮-间充质转化及ERK1/2信号系统的变化

目的探讨转化生长因子β1（TGF-β1）对Ⅱ型肺泡上皮-间充质转化的作用及与胞外调节激酶1/2（ERK1/2）信号系统的关系。方法体外培养人Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞,分为阴性对照组和TGF-β1处理组（0.05、0.5、5、10μg/L,作用时间48 h）。免疫荧光及Western blot方法检测各组细胞E钙粘素（E-cad）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、波形蛋白（Vim）和纤维连接蛋白（Fn）的表达。在TGF-β1作用不同时间,采用Western blot及RT-PCR方法检测各组细胞α-SMA、E-cad、Vim、Fn、ERK1/2和p-ERK1/2的表达。结果与阴性对照组比较,TGF-β1组（5μg/L）α-SMA、Vim、Fn蛋白表达显著升高,而E-cad表达显著降低（P〈0.05）。作用6 h后,TGF-β1组出现α-SMA mRNA表达显著升高,E-cad显著下降（P〈0.05）。作用48 h后,TGF-β1组出现Vim、Fn蛋白表达显著升高,E-cad显著下降（P〈0.01）。作用30 min后,TGF-β1组ERK/2磷酸化水平显著升高（P〈0.05）。结论 TGF-β1可在体外以浓度和时间依赖方式的诱导A549细胞发生上皮-间充质转化,其机制可能与上调ERK1/2信号转导通路有关。     

miR-205通过下调ZEB1和ZEB2表达抑制肾小管上皮细胞转分化

目的 探讨miR-205在肾小管上皮细胞转分化的作用机制.方法 将miR-205 mimics和scrambled control分别转染HK-2转分化细胞株,采用real-time qPCR检测miR-205和ZEB1、E-cadherin、α-SMA mRNA的表达水平;运用Western blotting检测ZEB1、ZEB2、E-cadherin、α-SMA的表达水平.通过细胞免疫组化检测β-catenin的异位表达情况和E-cadherin的表达情况.结果 miR-205 mimics转染HK-2转分化细胞株后,ZEBl和ZEB2的表达水平较高糖组得到大幅下调(P＜0.01),而E-cadherin的表达水平较高糖组显著提高(P＜0.01),同时间质细胞特征分子α-SMA的表达水平显著降低(P＜0.01).miR-205mimics也显著抑制了HK-2转分化过程中β-catenin异位表达,在维持上皮细胞的形态方面也起着重要的作用.结论 miR-205可通过下调ZEB1和ZEB2的表达,抑制了肾小管上皮间质转分化进程.     

发酵红参总皂苷对高糖诱导大鼠肾小管上皮细胞间充质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨发酵红参总皂苷（FRGTS）对高糖诱导下肾小管上皮细胞发生上皮细胞-间充质转化（EMT）的抑制作用,并阐明其作用机制。 方法 将大鼠肾小管上皮NRK-52E细胞分为正常对照组（5.5 mmol·L^－1 D-葡萄糖）、高糖组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖）、沉默信息调节因子1（SIRT1）抑制剂EX527组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋10.0 μmol·L^－1.EX527）、FRGTS组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋25 mg·L^－1FRGTS）和EX527+FRGTS组（30.0 mmol·L^－1 D-葡萄糖＋10 μmol·L^－1 EX527＋25 mg·L^－1FRGTS）。采用免疫荧光法检测各组细胞中E-钙黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）蛋白表达水平,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测各组细胞中E-cadherin、α-SMA和SIRT1 mRNA表达水平,ELISA法检测培养上清液中Ⅰ型胶原（ColⅠ）水平,Western blotting 法检测各组细胞中SIRT1、转化生长因子β1（TGF-β1）和Smad3 蛋白表达水平。 结果 高糖培养48 h后,与正常对照组比较,高糖组NRK-52E细胞中E-cadherin 蛋白表达水平和mRNA表达水平降低（P<0.01）,α-SMA 蛋白表达水平和mRNA表达水平升高（P<0.01）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平升高（P<0.01）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平升高（P<0.01）;与高糖组比较,FRGTS组NRK-52E细胞中E-cadherin mRNA表达水平升高（P<0.01）,α-SMA mRNA表达水平降低（P<0.05）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平降低（P<0.05）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平降低（P<0.05或P<0.01）;与FRGTS组比较,EX527+FRGTS组NRK-52E细胞中E-cadherin mRNA表达水平明显降低（P<0.01）,α-SMA mRNA表达水平明显升高（P<0.05）,NRK-52E细胞上清液中ColⅠ水平升高（P<0.05）,SIRT1 mRNA和蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,TGF-β1和Smad3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。 结论 FRGTS可通过上调SIRT1表达,进而抑制TGF-β1/Smad信号通路,有效抑制肾小管上皮细胞发生EMT。     

转化生长因子β1/结缔组织生长因子通路在强直性脊柱炎中的表达

目的:了解强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)骶髂关节中转化生长因子β1(transforming growthfactor beta 1,TGF-β1)/结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)通路的主要分子表达情况,探讨TGF-β1/CTGF通路与AS关节纤维化的关系。方法:30例AS患者均通过酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosor-bent assay,ELISA)法检测血清TGF-β1、CTGF水平,通过免疫组织化学方法检测TGF-β1、p-smad3、smad7、CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达。结果:与正常对照相比,AS骶髂关节组织可见TGF-β1、CTGF高表达,主要在骨髓及血管翳中炎症细胞的胞浆中表达;smad7明显低表达,p-smad3则主要表达于骨髓及血管翳中炎症细胞的细胞核中,提示smad3已被激活;Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原大量沉积,但血清中的TGF-β1和CTGF的水平与正常对照组间差异无统计学意义。结论:AS骶髂关节存在TGF-β1的过高表达,smad信号通路的激活,samd7的低表达,导致CTGF高表达,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原大量沉积。     

黄芪注射液对肾小管上皮细胞转分化的影响

目的观察黄芪注射液对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的体外培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化(EMT)过程的影响,揭示黄芪注射液治疗肾间质纤维化(RIF)的具体作用机制。方法以正常培养的HK-2细胞为正常组,TGF-β1(8×10-9mg/L)刺激48 h为模型组,TGF-β1(8×10-9mg/L)与黄芪注射液(8×10-6mg/L)共培养48 h为治疗组。倒置相差显微镜下观察细胞形态变化,免疫组化染色法观察细胞内E-钙依赖黏附素(E-cadherin)和a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达变化。结果倒置相差显微镜下观察发现模型组细胞形态经历了由上皮细胞样转变为成纤维细胞样的改变,而治疗组中成纤维细胞数目较模型组减少,并可见大量的上皮样细胞;免疫组化显示模型组细胞中a-SMA的表达较正常组增多,E-cadherin的表达减少,而治疗组细胞中E-cadher-in的表达较模型组增多,a-SMA的表达降低。结论黄芪注射液可在一定程度上抑制由TGF-β1诱导的体外培养HK-2细胞的表型改变,减少细胞内a-SMA的表达,增加E-cadherin的表达,阻断或逆转其EMT的进程。