EBV转化B淋巴细胞的差异基因筛选

目的 通过全基因组芯片筛选正常人外周血淋巴细胞(PBLs)和EB病毒(EBV)转化B淋巴细胞株CGM1中的差异基因,探讨EBV转化B淋巴细胞的机制.方法 分离培养正常人外周血淋巴细胞(PBLs),通过原位杂交检测PBLs和CGM1细胞中EBER表达情况;提取2株细胞RNA,利用人全基因组寡核苷酸基因表达谱芯片筛选2株细胞之间差异表达基因,并通过生物信息学对差异表达基因进行GO pathways和KEGG pathways分析.结果 EBER原位杂交结果显示PBLs EBER(-),CGM1 EBER(+);CGM1细胞与PBLs之间差异有统计学意义的基因有1587个,其中上调基因897个,下调基因690个,这些基因主要涉及P53、PI3K-Akt、Ras、MAPK、Toll-like receptor、WNT、TNF和JAK-STAT等信号通路,与细胞周期调节,B细胞增殖、活化、分化和细胞因子产生,DNA复制、损伤修复,病毒与宿主相互作用及病毒致癌作用等相关.结论 EBV通过细胞周期调节、细胞活化与分化、DNA复制和损伤修复、病毒与宿主相互作用等多个环节参与B淋巴细胞转化.     

EB病毒对人胃上皮细胞易感性及细胞周期素D1表达的影响

①目的探讨EB病毒（Epstein—Barrvirus,EBV）对人胃上皮细胞GES-1易感性及细胞周期素D1表达状况的影响。②方法用携带产EBV的B95—8细胞系制备EBV,感染人胃上皮细胞GES-1;用有限稀释法对感染细胞进行克隆,观察细胞的形态。并用PCR法检测未感染及感染细胞中EBV编码核抗原EBNAl、EBNA2、潜伏感染膜蛋白LMPl、LMP2A、裂解感染早期基因BARFl、晚期基因BLLFl及BeLFl的表达状况;用免疫组化法检测未感染及感染细胞中细胞周期素eyclinDl的表达。③结果感染细胞及其克隆细胞形态由原来的梭形变为多形态,检测到EBNAl、BARFl及BcLFl的表达,未检测到EBNA2、BLLFl、LMPl及LMP2A的表达。感粢EBV的GES-1细胞较未感染EBV的GES-1细胞的细胞周期素cyclinDl表达增高。④结论EBV对GES-1细胞易感,并且EBV感染使得细胞周期素cyclinDl过表达。     

EB病毒转化人胃上皮细胞GES-1中bcl-2基因的表达

目的 研究EBV感染人胃上皮细胞系GES-1后bcl-2基因的表达状况,探讨6cl-2基因在EBV相关胃癌发生中所起的作用.方法 采用携带新霉素抗性(NEOr)基因的重组EBV产生细胞系Akata 1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GES-1,经有限稀释法克隆和G418筛选获得感染和转染细胞克隆,用pcDNA3空载体质粒转染的人胃上皮细胞系GES-1细胞作对照:采用免疫细胞化学染色(ICC)法测定EBNA1基因的表达以鉴定EBV感染细胞克隆及测定EBV感染细胞中Bcl-2蛋白的表达.结果 与对照相比较,感染细胞中Bcl-2蛋白的表达阳性.结论 EBV感染可使人胃上皮细胞Bcl-2蛋白表达增高,EBv对人胃上皮细胞的转化作用可能与bcl-2基因的过度表达有关.     

鼻腔非霍奇金淋巴瘤EB病毒感染与Survivin基因表达的关系

目的观察EB病毒(Epstin Barrvirus,EBV)RNA、膜蛋白(LMP1)和凋亡抑制基因Survivin在鼻腔非霍奇金淋巴瘤(non Hodgkin’slymphoma,NHL)中的表达,探讨其相互间的关系及其在鼻腔NHL发生发展中的作用。方法用原位分子杂交技术检测29例鼻腔NHL中EBV编码的RNA(EBER1/2),用免疫组织化学技术(SP法)检测LMP1、Survivin蛋白表达。结果23例(79.31%)EBER1/2阳性,14例(48.28%)LMP1阳性;19例(65.52%)Survivin阳性,Survivin阳性表达在中——高度恶性组(18/23例)与低度恶性组(1/6例)中有显著性差异(P<0.05);EBV阳性组与EBV阴性组之间Survivin表达差异无显著性(P>0.05)。结论鼻腔NHL中有较高比例的EBV感染,Survivin表达阳性率与鼻腔NHL的恶性程度有关,Survivin基因可能通过抑制肿瘤细胞凋亡而参与NHL的发生发展,但未发现EBV感染与Survivin基因表达之间有明显相关性。     

LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响

目的 探讨化学合成小干涉RNA(siRNA)对Epstein-Barr病毒(EBV)潜伏膜蛋白1(LMP1)阳性胃上皮(GT38)细胞LMP1编码基因表达的抑制作用,以及对细胞增殖和凋亡的影响.方法 化学合成靶向LMP1 mRNA不同位点的3对siRNA,分别转染GT38细胞,选择干扰效果最佳的siRNA进行实验研究,行RT-PCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析.结果 RT-PCR结果显示,3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达,以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果最强.Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡.流式细胞分析显示,siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变.RT-PCR检测结果表明,转染siRNA649的靶细胞Bcl-2的表达水平降低.结论 靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达,进而可能通过抑制Bcl-2的表达诱导靶细胞凋亡.GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞.     

EB病毒在老年性EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤中的潜伏感染类型

目的探讨EB病毒(EBV)在老年性EBV阳性弥漫性大B细胞淋巴瘤(EBV+DLBCL)中的潜伏感染类型。方法在前期的基础上,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及免疫组织化学(IHC)分析检测13例EBV+DLBCL病例EBV潜伏感染类型。结果 qRT-PCR显示,相对于阴性对照组,7例表达LMP1(7/13,53.8%),3例阴性(3/13,23.1%),3例由于RNA质量问题,未能决定其表达量;1例表达EBNA2(1/13,7.7%),9例阴性(9/13,69.2%),3例由于RNA质量问题,未能决定其表达量。IHC显示,9例表达LMP1(9/13,69.2%),4例阴性(4/13,30.8%);1例表达EBNA2(1/13,7.7%),12例阴性(12/13,92.3%)。综合分析,7例EBV+DLBCL患者EBV潜伏感染类型为Ⅱ型(7/13,53.8%),2例潜伏感染类型为Ⅰ型(2/13,15.4%),1例为III型(1/13,7.7%),3例由于qRT-PCR未能决定其目的基因表达量,归为Ⅱ/Ⅲ或Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型。结论本文显示,EBV在老年性EBV+DLBCL中的潜伏感染类型大部分为Ⅱ型,但因本研究病例数量有限,还需要进一步的研究验证。     

EB病毒拮抗转化生长因子β的抗增生活性但不影响其信号传导

TGF-β诱导凋亡,并抑制EB病毒(EBV)阴性的B淋巴细胞系增生。相反,EBV永生化的B细胞则抵抗TGF-β促凋亡和抗增生活性。 德国的Horndasch M等建立了淋巴母细胞系,应用它可以开始或终止由EBNA2驱动的EBV特异性转录程序。当这些细胞表达EBNA2驱动的表型     

EBV LMP2A对胃癌细胞生物学特性的影响

【目的】探讨EBV LMP2A基因对人胃癌细胞生物学特性的影响。【方法】用包含LMP2A基因的逆转录病毒载体转染人胃癌细胞株(SGC7901),QRT-PCR检测LMP2A基因的表达,CCK8检测细胞增殖情况;流式细胞术检测细胞凋亡;划痕试验和transwell检测细胞迁移能力;克隆形成试验检测细胞成瘤能力。【结果】LMP2A基因转染的胃癌细胞生长速度增快、凋亡减少、迁移能力增强,在平板和软琼脂中集落形成能力增强。【结论】LMP2A基因能明显增强胃癌细胞的恶性生物学行为。     

Immunological Responses to the Combination of EBNA1 and LMP2 in Mice

Epstein-Barr virus (EBV) infection is closely associated with nasopharyngeal carcinoma (NPC)and considered one of the major risk factors[1]. A limited number of viral proteins, such as latent membrane proteins (LMP1, LMP2) and EB nuclear antigen1 (EBNA1), are expressed in NPC cells[2].Recognition epitopes for CD8+and CD4+T cells were included in the LMP2 antigen and EBNA1 C-terminal region (amino acid No. 380-641), respectively[3,4].Both CD4+and CD8+memory T-cell responses were efficiently reactivated by EBNA1 and LMP2[5;6].     

融合基因EBNA1-LMP1重组腺病毒的构建及其免疫学研究

目的 构建EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)EBNA1和LMP1融合基因的重组腺病毒,探究重组腺病毒的免疫学作用.方法 以质粒pCXWB-EBNA1和pMV261-LMP1为模板,通过PCR扩增EBNA1和LMP1基因,并通过linker以重叠延伸PCR的方式构建融合基因EBNA1-LMP1,将其...     

EB病毒在不同类型淋巴瘤中的表达及检测方法的比较

目的探讨EB病毒（EBV）在不同类型淋巴瘤中的表达差异及对用于检测EBV表达的3种实验方法（免疫组织化学、原位杂交、PCR）进行比较分析。方法收集明确诊断淋巴瘤石蜡组织57例,包括结外NK／T细胞淋巴瘤（NK／TCL）鼻型12例、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITCL）13例、霍奇金淋巴瘤（HL）12例、弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）20例,应用免疫组织化学（IHC）、原位杂交（ISH）、聚合酶链反应技术（PCR）分别检测淋巴瘤中EBV蛋白（LMP-1）、EBV潜伏相关RNA（EBERl）、EBV（DNA）的表达情况。结果57例淋巴瘤组织中EBV蛋白（LMP-1）、EBER1、EBVDNA总阳性表达率分别为17．5％（10／57）、47．4％（27／57）、50．9％（29／57）。其中NK／TCL鼻型为8．3％（1／12）、83．3％（10／12）、91．7％（11／12）;AITCL为30．8（4／13）、53．8％（7／13）、61．5％（8／13）;HL为33．3％（4／12）、41．7％（5／12）、41．7％（5／12）;DLBCL为5．00％（1／20）、25．0％（5／20）、25．O％（5／20）。PCR及原位杂交检测方法比免疫组化更敏感（P〈0．05）。结论EBV感染在不同类型的淋巴瘤中表达存在差异,3种检测方法之间的阳性表达率也不同且ISI-I和PCR检测方法优于IHC。     

成熟T和NK细胞淋巴瘤与EB病毒感染关系的探讨

目的探讨成熟T和NK细胞淋巴瘤与EB病毒感染的关系。方法用原位杂交法检测121例成熟T和NK细胞淋巴瘤EBV,rt（EB病毒编码的小RNA）表达情况,统计不同类型成熟T和NK细胞淋巴瘤与EB病毒感染相关性。结果121例成熟T和NK细胞淋巴瘤EBER阳性率为63．6％（77／121）,其中结外者EBER阳性表达率为75．9％（60／79）,阳性细胞多为肿瘤细胞,阳性细胞数〉30％;而结内者EBER阳性表达率为40．5％（17／42）,阳性细胞多为母化的肿瘤细胞或反应性B淋巴细胞,阳性细胞数〈10％。结外成熟T和NK细胞淋巴瘤EBER表达率显著高于结内（P〈0．01）。EBER表达与组织学类型有关（P〈0．01）。不同类型淋巴瘤EBER阳性表达率不同：结外鼻型NK／T细胞淋巴瘤（ENKCL）为98．0％（48／49）,EBER阳性细胞数〉30％;血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（AITL）为77．8％（7／9）,阳性细胞数〈10％,阳性细胞多为反应性B细胞;外周T细胞淋巴瘤非特殊型（PT,NOS）为41．5％（17／41）;肠病相关性T细胞淋巴瘤（EATL）为33．3％（2／6）;间变性大细胞淋巴瘤并ALK阳性（ALCL,ALK＋）者为18．2％（2／11）。结论结外成熟T和NK细胞淋巴瘤发生与EB病毒感染密切相关,而结内成熟T和NK细胞淋巴瘤EB病毒感染可能为继发感染。检测肿瘤组织EBER表达有助于成熟T和NK细胞淋巴瘤的诊断和治疗。     

EB病毒感染套细胞淋巴瘤细胞株的表型研究

目的：建立EBV潜伏感染的体外理想模型。方法：我们利用新霉素耐性的重组遗传基因EBV（NeoR EBV）对套细胞的细胞株SP53进行感染，用G418筛选，选出100％EBV阳性的MCL细胞株SP53／EBV。结果：此细胞株表达EBER1、EB．NAs、LMP1，表现出LCL型的EBV潜伏感染的免疫表型．结论：这次我们建立的SP53／EBV细胞株，具有低增殖功能，没有诱导出活性指标等特点，可考虑为机体内EBV休眠期B细胞具有的特征，期待此细胞株可成为研究体内EBV潜伏感染的良好模型。     

脱氧核酶对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1增殖和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein 1,LMP1)基因特异性的脱氧核梅(DNAzyme)对伯基特淋巴瘤细胞P3HR-1的增殖和凋亡的影响。方法:设计合成针对EBV-LMP1基因的DNAzyme(DZ1),在P3HR-1细胞上观察其对细胞增殖活性、细胞周期和细胞凋亡的影响。结果:脱氧核酶DZ1作用于P3HR-1细胞后,可显著抑制EBV-LMP1基因的表达,并呈剂量依赖性。将脱氧核酶DZ1抑制LMP1的表达,进而下调抗凋亡蛋白Bc1-2的表达,诱导细胞色素c释放,从而诱导细胞凋亡。结论:在P3HR-1细胞中,靶向LMP1可能成为潜在的基因治疗的分子靶,靶向LMP1的脱氧核酶可能成为EB病毒相关肿瘤基因治疗实验研究的新的工具。     

中线T细胞淋巴瘤的免疫表型及其与EB病毒感染的相关性

目的:探讨中线T细胞淋巴瘤(MTL)的免疫表型特征及其与EB病毒(EBV)感染的关系。方法:采用免疫组织化学方法检测41例MTL组织CD45RO、CD3ε、CD56、CD20、TIA-1、Granzyme B以及EBV潜伏膜蛋白(LMP-1)的表达,原位杂交技术检测EBV转录产物RNA(EBER1/2)。结果:①CD45RO阳性41例(100%),CD3ε、TIA-1阳性25例(60.98%),Granzyme B阳性22例(53.66%),CD56阳性21例(51.22%),CD20全部阴性。②EBER1/2阳性29例(70.73%),LMP-1阳性17例(41.46%);NK/T细胞淋巴瘤(21/25)明显高于外周T细胞淋巴瘤(8/16)的EBER1/2阳性表达(P<0.05)。结论:MTL以NK/T细胞淋巴瘤为多见,EBV感染与MTL关系密切,EBV感染率与MTL的免疫表型有关,EBV感染在MTL的发生发展中可能起重要作用。     

EB病毒LMP2-LMP1Δ融合基因免疫效果的初步研究

目的构建EBV LMP2-LMP1Δ融合基因,初步观察融合基因体内诱导EBV特异性细胞免疫应答的效果。方法 （1）应用PCR方法构建包含EBV-LMP2全长和去除致癌基因的EBV-LMP1Δ融合基因,并将融合基因插入到pcDNA3.1（＋）-his真核表达载体中,构建重组表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ,Western blot和免疫荧光方法检测融合蛋白的表达。（2）使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ及携带LMP1Δ和LMP2基因的重组腺病毒单独或联合免疫Balb/c小鼠,末次免疫1周后应用IFN-γELISPOT方法检测小鼠脾淋巴细胞中EBV特异性CTL水平。结果 （1）真核表达质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ能够在293细胞中表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,融合蛋白分子量大小正确,具有免疫原性。（2）重组质粒pcDNA-LMP2-LMP1Δ免疫小鼠能够诱导出EBV特异性的CTL,但诱导的CTL水平很低,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数只有12个,远远低于LMP1Δ、LMP2重组腺病毒平均495个斑点数的免疫结果。但使用pcDNA-LMP2-LMP1Δ和重组腺病毒联合免疫,与只使用重组腺病毒相比,诱导的EBV特异性CTL水平能够显著提高,1×106小鼠脾淋巴细胞中平均斑点数可达1 001个（P〈0.01）。结论构建的EBV LMP2-LMP1Δ融合基因能够有效表达LMP2-LMP1Δ融合蛋白,并能够在小鼠体内诱导出EBV特异性的CTL反应,与重组腺病毒联合使用,可以提高特异性CTL应答水平。     

两种不同来源的EBV LMP1基因在Balb/c 3T3细胞中的表达

【目的】研究来源于鼻咽癌细胞株SUNE1及EBV标准株B95 - 8细胞中两种EBVLMP1基因在真核细胞Balb/c3T3中的表达 ,为进一步研究EBVLMP1基因的核酸疫苗打基础。【方法】将两种不同来源EBVLMP1基因的真核表达质粒 ,经脂质体法转染Balb/c 3T3细胞后 ,用Westernblot、免疫组化及PCR的方法检测不同转染细胞中EBVLMP1蛋白的表达及核酸片段。【结果】PCR结果表明在两种不同来源LMP1转染细胞中均有EBVLMP1基因序列 ,并均能表达 6 3ku的蛋白质 ,经Westernblot和免疫组化结果证实均为EBVLMP1蛋白。【结论】来源于B95 8细胞及鼻咽癌细胞SUNE1的两种EBVLMP1基因均能在真核细胞Balb/c 3T3中表达。     

胃癌患者EBV感染潜伏基因产物表达的研究

目的:研究EBV阳性胃癌中潜伏基因产物EBV编码的小RNA(EBER1)及潜伏膜蛋白LM P1的表达状况。方法:原位杂交法检测胃癌患者石蜡包埋组织标本中EBER1;免疫组化法检测EBV阳性胃癌中LM P1。结果:217例胃癌患者癌组织标本中检测到23例EBER 1;EBV阳性胃癌中无潜伏感染膜蛋白LM P1表达。结论:EBV阳性胃癌中缺乏潜伏感染膜蛋白LM P1的表达。