原子力显微镜观察间充质干细胞向成骨细胞系分化过程中的表征变化

目的 通过对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stcm cell，MSC)向成骨细胞系转化过程中表征变化进行观察，以期更全面地了解MSC在体外的成骨分化过程。方法 将羊MSC进行体外诱导分化，进行组织学、免疫组化、X线衍射分析等检测及原子力显微镜观察。结果 诱导后的MSC碱性磷酸酶染色阳性率达90％以上，Ⅰ型胶原免疫组化和钙结节染色均呈阳性；诱导后细胞形成的结节样物中主要由羟基磷灰石组成；原子力显微镜观察见诱导后的MSC具有成熟的成骨细胞特性。结论 体外培养的MSC能被诱导成骨；运用原子力显微镜可以清晰地看到MSC在向成骨细胞分化过程中表征的变化。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞的分化

目的 对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)进行分离培养与鉴定,并使其诱导分化为神经细胞.方法 采用密度梯度离心和贴壁培养相结合的方法分离培养BMSCs,观察细胞形态变化及生长、增殖情况;对细胞进行表面标志物CD14、CD34、CD44、CD29免疫荧光染色及向骨、软骨和脂肪分化能力的鉴定;选用第3代细胞,经全反式维甲酸(retinoic acid,RA)和脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophy factor,BDNF)联合诱导后,免疫荧光染色检测神经前体细胞标记物Nestin及神经细胞标记物NSE的表达情况.结果 体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,CD44和CD29的阳性率在90%以上,具有明显的向骨、软骨和脂肪分化的能力,经诱导后可分化为神经细胞.结论 成功建立了体外分离扩增BMSCs的培养体系,所获得的细胞纯度高、生物学特征稳定,并可在体外诱导分化为神经细胞,从而为下一步细胞移植治疗脑缺血动物模型提供种子细胞.     

骨髓间充质干细胞体内诱导分化为心肌细胞的初步实验观察

目的：初步观察MSCs墨体内诱导分化为心肌细胞的能力。方法：从大鼠双侧股骨骨髓获得MSCs，在体外纯化、扩增后，DAPI进行细胞标记，然后注射到急性心肌梗塞模型鼠和正常大鼠的心肌组织内，饲养2～4周后，处死动物在注射点获取心肌标本，初步采用肛染色和电镜观察形态学的方法对分化的心肌细胞进行鉴定，并用免疫组化法从组织学上对转化心肌细胞进行心肌特异性抗原的检测。结果：MSC进行DAPI的标记效率高，电镜观察与宿主心肌细胞问形成了闰盘，组化检测有心肌特异性抗原的出现。结论：在宿主心肌组织内，MSCs具有分化为心肌细胞的能力。     

骨髓间充质干细胞成神经分化中的FTH1基因表达

目的 明确骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成神经分化对细胞内铁蛋白重链(ferritin heavy chain 1,FTH1)基因表达的影响,探讨FTH1报告基因成像检测定向分化细胞的可行性.方法 以慢病毒为载体将FTH1基因转入MSCs中,利用全反式维甲酸和神经细胞诱导液对其诱导分化,Western blot检测分化前后细胞内FTH1的表达,MRI观察细胞T2WI信号变化,普鲁士蓝染色和透射电镜检测细胞内FTH1表达所引起的聚铁效应.结果 携带FTH1基因的MSCs(MSCs-FTH1)成功分化为神经元样细胞(Neurons-FTH1).Western blot检测显示MSCs-FTH1及Neurons-FTH1细胞中FTH1均明显表达;在500 μmol/L枸橼酸铁铵的培养条件下,两种细胞MRI检查均发现T2WI信号明显降低;普鲁士蓝染色和透射电镜证实细胞内较多铁颗粒聚集.结论 MSCs成神经分化对细胞内FTH1基因的表达无明显影响,基于FTH1的MRI报告基因成像可用于MSCs神经分化后的检测.     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的实验研究

目的：对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells ,BMSCs）进行分离、培养与鉴定,并探讨全反式维甲酸（retinoic acid,RA）、碱性成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor,basic, bFGF）和表皮生长因子（ epidermal growth factor , EGF ）联合诱导BMSCs分化为神经细胞的可行性。方法全骨髓贴壁法分离培养BMSCs ,观察细胞形态及生长增殖情况;流式鉴定细胞表面标志物CD29、CD34、CD90;选用第3代细胞,经RA、bF-GF和EGF联合诱导后,细胞免疫化学染色检测神经细胞标志物神经元特异性烯醇化酶（ neuron specific enolasen , NSE）的表达。结果体外培养的BMSCs呈成纤维细胞样,第3、4、5代BMSCs的生长曲线均呈S形,活性无明显差异。 BMSCs的均一性较好,第3代细胞CD29、CD90阳性率均在90％以上,而CD34阳性率仅为0．58％;BMSCs经诱导后分化为神经细胞,并表达神经细胞标志NSE。结论成功建立BMSCs 的体外培养体系,所得细胞纯度高、生物学特征稳定,并可诱导分化为神经细胞,为移植治疗神经系统损伤提供实验基础。     

低氧通路对骨髓间充质干细胞多向分化能力的影响

目的探讨低氧通路中低氧诱导因子1α(H IF-1α)对骨髓间充质干细胞(MSCs)多向分化能力的影响。方法以腺病毒载体Ad-Cre对转基因鼠MSCs的VHL基因进行基因敲除(基因敲除组),设立对照组(感染腺病毒载体Ad-GPF的转基因鼠MSCs),采用Real-Tim e PCR技术检测H IF-1αmRNA表达。两组MSCs分别经成脂肪和成软骨诱导分化培养14 d,成骨诱导分化培养21 d;其中基因敲除组MSCs于5%O2条件下培养,对照组MSCs于20%O2条件下培养。采用Real-Tim e PCR技术检测软骨细胞标志物Ⅱ型胶原(ColⅡ)、脂肪细胞标志物过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)及成骨细胞标志物骨钙素(OC)和碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达;ColⅡ染色和ALP染色光学显微镜观察两组ColⅡ和ALP染色阳性细胞的分布情况。结果基因敲除组H IF-1αmRNA表达显著高于对照组(P<0.05)。5%O2条件下培养的基因敲除组ColⅡ、PPARγ、OC、ALP mRNA表达均显著高于20%O2条件下培养的对照组(P<0.05)。与对照组比较,基因敲除组ColⅡ染色和ALP染色阳性细胞数...     

TGF-β1对rhBMP-2促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响

目的观察转化生长因子β1(TGF-β1)对重组骨形态蛋白2(rhBMP-2)促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的影响。方法分离培养骨髓间充质干细胞,然后加入不同浓度的rhBMP-2,用MTT法检测细胞增殖情况,通过ELISA法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)活性评估其骨向分化能力。同时加入TGF-β1观察其对rhBMP-2协同促进能力。结果不同浓度rhBMP-2对骨髓间充质干细胞(MSCs)进行处理后检测出的吸光度值(D值)及ALP活性检测值均较阴性对照组明显升高(P<0.05),随着浓度增加,其促进作用有所提高。而TGF-β1+rhBMP-2组检测到的吸光度值及ALP活性升高更明显。结论 TGF-β1能够有效促进rhBMP-2对MSCs的增殖和成骨分化作用。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的：探讨成年大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)向神经细胞体外定向诱导分化的条件。方法：从正常SD大鼠骨髓中分离获取MSC,体外培养扩增纯化后传代于塑料培养皿中,采用丁羟茴醚(BHA)和二甲亚砜(DMSO)对传至3～5代的细胞进行体外诱导分化,采用免疫细胞化学对诱导后的细胞进行鉴定。结果：诱导1h、2h、3h后有部分细胞表达神经干细胞标志蛋白nestin,且随诱导时间延长呈下降趋势;诱导5h后,大部分细胞具有典型神经元形态,表达神经元标志物,神经元特异性烯醇化酶(NSE),少部分细胞呈星型胶质细胞状,表达胶质细胞标志物—胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。结论：骨髓间充质干细胞可以在体外培养扩增并诱导成为神经元样细胞和星型胶质样细胞。     

人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性

目的：研究人骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs)的分化特征及其端粒酶活性。方法：取人胚胎股骨骨髓,分离,培养,扩增MSCs,原位杂交法检测MSCs的端粒酶性。将MSCs种植于裸鼠皮下,4周后观察MSCs的分化情况。结果：人MSCs呈端粒酶反应阳性。植入裸鼠体内后可分化成骨,软骨,脂肪,骨骼肌,肌腱样组织和无髓神经纤维束样结构。结论：人MSCs是一种具有多向分化能力的干细胞,具有较高的端粒酶活性。     

大鼠骨髓间充质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白分布的变化及意义

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞神经分化过程中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)分布的变化及意义.方法 常规体外培养大鼠MSCs,采用β-巯基乙醇诱导MSCs分化为神经细胞.实验分MSCs空白对照组、二甲基亚砜(DMSO)阴性对照组、β-巯基乙醇诱导组、不同浓度雷帕霉素干预组、不同浓度雷帕霉素干预+β-巯基乙醇诱导组.采用免疫荧光法检测诱导前后mTOR在细胞内的分布,激光共聚焦显微镜观察照相;Western blot法检测诱导前后神经细胞相关蛋白和mTOR通路蛋白的表达.结果 ①诱导前mTOR主要在MSCs细胞核内点状分布,细胞质也有少量的分布;诱导后核内荧光信号减弱,mTOR向细胞质转移.雷帕霉素处理后,随着雷帕霉素浓度的提高(10～ 30tμmol/L),mTOR向细胞质转移越明显.雷帕霉素浓度超过50 μmol/L后,细胞形态变圆,部分细胞脱壁,死亡率显著增加(P＜0.05).②β-巯基乙醇可诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,诱导后神经细胞Tau蛋白、MAP-2蛋白表达显著增加.雷帕霉素(10 ～ 30 μmol/L)干预后,随着雷帕霉素浓度(10～20μmol/L)的提高,Tau蛋白、MAP-2蛋白表达逐渐增加,30 μmol/L时Tau蛋白、MAP-2蛋白表达下降(P＜0.05).③Westem blot检测结果提示,诱导前后总mTOR表达不变;磷酸化mTOR、磷酸化p70S6K、磷酸化4EBP1诱导后较诱导前表达下降(P＜0.05),雷帕霉素干预后下调更加显著(P＜0.05).结论 mTOR在MSCs神经分化过程中由细胞核内向细胞质转移,活性下降,表达下调,提示mTOR在MSCs神经分化过程中可能发挥了重要作用.     

低氧对人骨髓间充质干细胞向胆碱能神经元分化的影响

【目的】观察低氧对体外培养的人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）向胆碱能神经元分化的影响。【方法】将对照组和常氧分化组hBMSCs置于常氧（20％O2）环境中培养,低氧分化组细胞置于低氧（3％O2）环境中。采用免疫细胞化学法和高效液相色谱-电化学法,分别检测胆碱能神经元的数量和诱导分化后乙酰胆碱（ACh）的含量。【结果】对照组未见胆碱乙酰化酶（ChAT）阳性神经元,低氧分化组ChAT阳性神经元数量明显增多,约为常氧分化组的4倍（P〈0．01）,并且该组诱导分化后的细胞合成的ACh含量也高于常氧分化组（P〈0．05）。【结论】低氧可促进hBMSCs向胆碱能神经元方向分化,这为临床应用hBMSCs治疗阿尔茨海默病提供了新的思路。     

小凹蛋白-1在大鼠骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞中的作用

目的 应用RNA干扰(RNA interference)技术,抑制沉默小凹蛋白-1(caveolin-1)基因的表达,观察小凹蛋白-1在骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的作用.方法 构建大鼠caveolin-1 siRNA(small interfering RNA),然后传染大鼠MSCs,诱导分化并在倒置显微镜下进行形态学观察,用MTT比色法检测细胞存活率,采用免疫细胞化学染色法检测Nestin、 NSE(神经元标记物) 、GFAP(神经胶质细胞标记物)的表达,设诱导未传染组和传染对照组作为对照研究.结果 用caveolin-1 siRNA传染MSCs后,caveolin-1基因表达消失,传染后24 h和3 d MSCs细胞存活率下降,与诱导未传染组和传染对照组比较差异有统计学意义(P<0.01),传染caveolin-1 siRNA的MSCs向神经元样细胞分化效率显著提高,诱导24 h后NSE阳性细胞率为(75.5±2.5)%,6 d后达(81.6±3.5)%,且未见GFAP的表达,与诱导未传染组和传染对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论 caveolin-1 siRNA抑制caveolin-1基因的表达,可提高MSCs向神经元样细胞的分化效率. Abstract： Objective To investigate the role of caveolin-1 in bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) differentiating into neuron-like cells by transfecting MSCs with small interfering RNA(siRNA). Methods Construct caveolin-1 siRNA and then transfect into MSCs cultured in vitro. Cell growth was observed by an inverted phase contrast microscope. The survival ratio of MSCs was determined by MTT before transfection,24 hour, 3 days after transfection,respectively. MSCs was induced to differentiate into neuron-like cells by-ME. The neural cell specific marker Nestin,NSE,GFAP were determined by immunocytochemistry stain technique. Results Expresion of caveolin-1 vanished by tranfection of caveolin-1 siRNA,survival ratio of MSCs by transfection decreased and there was significant differences between no-transfection and transfection-controlling group after 24 hours and 3 days of transfection(P<0.01).The differentiation efficiency of MSCs transfected by caveolin-1 siRNA into neuron-like cells and the expression of NSE were increased significantly than no-transfection and transfection-controlling group, The percentage of positive NSE was(75.5±2.5)% after 24 hours and(81.6±3.5)% after 6 days, there was no expression of GFAP. There was significant differences between no-transfection and transfection-controlling group(P<0.01). Conclusions The differentiation efficiency of MSCs increased by suppressing caveolin-1 expression.     

阿魏酸钠诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 探讨阿魏酸钠诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能作用。方法 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用阿魏酸钠对其进行诱导培养，倒置显微镜下观察诱导培养不同时间后细胞的形态变化，并应用免疫细胞化学方法鉴定诱导培养后细胞表面神经细胞特异性标志物神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达。结果 阿魏酸钠诱导培养6h后即可见细胞形态发生明显变化，24h后表现为典型的神经细胞样形态，NF和NSE神经细胞特异性标志物呈阳性表达。结论 初步证实阿魏酸钠具有诱导体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。     

人骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞诱导分化的实验研究

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSCs）向血管内皮细胞（ECs）诱导分化的可行性。方法：用贴壁法从成人骨髓中分离出间充质干细胞,培养扩增后,加入10ng／ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和人血管内皮生长因子（hVEGF）向ECs诱导分化,分别于0、24d流式细胞术检测细胞表型及荧光染色鉴定细胞。结果：hMSCs向ECs诱导分化24d,细胞CD34、KDR转为阳性,CD54、CD106、vWF表达增加。可摄取ac—LDL,并可结合UEA。结论：hMSCs经bFGF和VEGF作用,分化为具有ECs的表型和部分功能的细胞。     

大鼠骨髓间质干细胞的分离培养及生物学特性研究

目的建立大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)最佳的体外分离培养方法,并研究其基本的生物学特性。方法采用密度梯度离心和贴壁培养两种方法分离大鼠的MSCs,进行形态学观察及增殖生长方面的测定;免疫细胞化学染色鉴定表面标志。结果大鼠MSCs体外培养呈梭形;细胞生长曲线为“S”型;密度梯度离心法原代培养15d达到80%～90%的融合,而改良的直接贴壁法只需要5d;细胞周期显示G0/G1期88.29%;免疫细胞化学染色显示CD44表达阳性,CD34、CD45为阴性。结论两种方法均可获得骨髓间质干细胞,但贴壁培养法操作更简便、快速,具有对细胞活性影响较小,更利于其贴壁和增殖的优点。MSCs体外培养条件下生长性状稳定,适于做组织工程的种子细胞。     

骨髓间充质干细胞向视网膜神经节样细胞分化过程中的电生理特性

目的：利用乳鼠视网膜细胞条件分化液将骨髓间充质干细胞( BMSCs)分化为视网膜神经节样细胞,比较BMSCs、诱导后的视网膜神经节样细胞以及原代培养的视网膜神经节细胞(RGCs)的电生理特性。方法：取传至第3代的大鼠BMSCs,利用乳鼠视网膜细胞条件分化液作为诱导剂,进行增殖培养、分化诱导;免疫组织化学法观察NF、MA...     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

人胎盘来源间充质干细胞和大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特征比较

目的:从人足月的胎盘羊膜中和Wistar 大鼠股骨及胫骨骨髓中分离、培养间充质干细胞（MSCs）,研究人胎盘来源MSCs（HPMSCs）和大鼠骨髓来源MSCs（BMSCs）的分离培养方法和生物学特征、表面标志及其多分化潜能。方法:将人足月胎盘组织通过胶原酶Ⅱ消化培养获取HPMSCs,采用全骨髓贴壁法从4周龄Wistar大鼠双侧股骨及胫骨中分离、纯化大鼠BMSCs,运用活细胞计数法检测其增殖能力,采用流式细胞术检测2种细胞表面标志物的表阳性率;
用地塞米松、维生素C和β磷酸甘油诱导其向成骨细胞分化,用茜素红染色鉴定;用胰岛素、地塞米松、IBMX和吲哚美辛诱导其向脂肪细胞分化,以油红O染色鉴定。结果:HPMSCs为梭形贴壁细胞,增殖能力较强,CD44和CD34表达阳性率分别为94.45%和1.67%;BMSCs为圆形、梭形和多角形,增殖能力强,CD44和CD34表达阳性率分别为93.11%和2.68%。2种细胞经过成脂诱导液和成骨诱导液诱导后,茜素红和油红O染色结果均为阳性,表明2种细胞均可向脂肪细胞和成骨细胞分化。结论:HPMSCs与大鼠BMSCs的生物学特征相似,同样具有多分化潜能,HPMSCs具有更强的增殖能力。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的实验研究

目的：探讨大鼠骨髓间充质干细胞（mMSCs）在体外定向诱导分化为肝细胞及其方法。方法：采用梯度离心法分离纯化雄性SD大鼠的mMSCs。A组原代培养；B组原代培养分别加刺激因子50ng／ml肝细胞生长因子（HGF）和50ng／ml成纤维细胞生长因子4（FGF-4），倒置显微镜连续观察细胞分化过程的形态学变化。于培养的7、14、21、28d，细胞免疫荧光法检测各组细胞甲胎蛋白（AFP）、白蛋白（ALB）、细胞角蛋白18（CK-18）、细胞角蛋白19（CK-19）的表达。采用过碘酸希夫（PAS）染色法检测各组细胞糖原染色情况。结果：分离纯化B组大鼠的mMSCs，应用HGF和FGF-4诱导10d后变为肝细胞样圆形。细胞免疫荧光测定B组显示，培养第7dAFP即出现阳性，第21d表达明显减弱；第7dCK-19染色阳性，以后增强；第14d白蛋白与CK-18染色开始阳性，以后表达逐渐加强。A组在培养过程中不表达AFP、ALB、CK-18和CK-19。糖原染色显示，B组第14d开始阳性，-直持续到第28d；A组未见阳性染色。结论：大鼠mMSCs在较高浓度的HGF及FGF-4诱导下可分化为肝细胞。