骨髓间充质干细胞和心肌组织工程

目前对于心功能不全的治疗包括心脏移植、外科血运重建、机械和人工合成装置的替代以及新陈代谢的调整,这些治疗虽然已在临床应用,但都有局限性和并发症。各学科的发展为组织修复提供了更好的手段,随着工程学、材料学、生物制品的发展,组织工程学在维持和提高受损组织的功能方面也取得很大进步,其中包括心脏组织工程,即血管、心脏瓣膜和心肌组织工程。缺血性心脏病在我国发病率逐年提高,一般认为出生后心肌细胞即失去分裂能力,一旦损伤发生,则只能由成纤维细胞所填充,最终为瘢痕替代,逐步发生心室重构,最终导致心力衰竭。     

骨髓间充质干细胞体外定向诱导心肌样细胞的实验研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞（mensenchymal stem cell,MSC）经5-氮杂胞苷（5-azacytidine,5-aza）诱导在体外定向分化为心肌样细胞形态学及分子生物学特征,为心肌样细胞鉴定提供依据。方法取兔髂骨骨髓,分离并培养骨髓间充质干细胞,用5-氮杂胞苷定向诱导向心肌样细胞分化。相差显微镜、透射电镜观察心肌样细胞形态学变化及超微结构特征,RT—PCR检测心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结果5-氮杂胞苷诱导后,部分细胞体积增大,呈“棒状”或“珠状”结构,有肌管样结构形成,透射电镜下有肌丝、心房颗粒及线粒体等心肌样细胞超微结构形成,RT—PCR检测显示有心房利钠肽、受磷蛋白、β-肌球蛋白重链表达。结论经5-氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞体外可分化为心肌样细胞。     

不同处理方法对骨髓间充质干细胞与小肠黏膜下基质复合效果的影响

［摘要］ 目的 探讨不同处理方法对骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）与小肠黏膜下基质（small intestinal submucosa,SIS）复合效果的影响。 方法 制备MSCs和SIS,将MSCs以不同浓度、不同接种次数与SIS复合,比较复合浓度、复合次数及复合时间对复合效果的影响。SIS用不同预湿方法处理后,将MSCs以2个浓度接种于预湿方法处理后的SIS上,比较不同的预处理方法对复合效果的影响。 结果 MSCs以2×106/mL与新法预处理的SIS复合后黏附率最高。MSCs与SIS复合后光学显微镜下可见SIS黏膜面有较多细胞附着,浆膜面几乎无细胞附着。扫描电镜可见细胞附着在SIS表面,呈长梭形或不规则形状,细胞表面可见颗粒状物及微绒毛。 结论 采用新的预湿方法,MSCs以2×106/mL的浓度与SIS复合1 d后用于移植,复合效果最佳。     

骨髓间充质干细胞体外扩增和向心肌细胞分化的实验研究

①目的 探讨兔骨髓间充质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向心肌细胞诱导分化的条件。②方法 取兔股骨骨髓。利用密度为1．073s／mL的Percoll分离骨髓细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增骨髓间质干细胞。取第二代和第三代的骨髓间质干细胞，以含有不同浓度的5-氮杂胞苷诱导培养基向心肌细胞诱导分化。③结果 诱导后的细胞呈现典型的心肌细胞样改变，免疫组化染色显示其α-横纹肌动蛋白阳性。④结论骨髓间质干细胞在体外具有向心肌细胞分化的潜能。     

髓核去细胞基质复合骨髓间充质干细胞体外构建组织工程髓核的研究?

目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)-髓核去细胞基质支架(NPAMS)复合体(rBMSCs-NPAMS)构建组织工程髓核。方法制备若干 NPAMS,接种 BMSCs 至 NPAMS 体外培养分为 NPAMS 组、实验组和正常对照组(正常髓核)。肉眼及显微镜观察复合体形态变化,并行扫描电镜(SEM)、苏木素-伊红(HE)染色、免疫组织化学、实时定量 PCR(qRT-PCR)、支架的生物力学等检测。结果肉眼下 rBMSCs-NPAMS 形态接近正常髓核;SEM 显示细胞在支架表面大量黏附、并向深部迁移,表面细胞密度比横截面细胞密度大;HE 染色表明随时间延长,rBMSCs-NPAMS 内细胞量递增,分布更广泛;免疫组织化学显示细胞外基质2型胶原(CollagenⅡ)分泌量随时间递增,且实验组 CollagenⅡ表达量大于 NPAMS 组,小于正常对照组;qRT-PCR结果：NPAMS 组未提取到 mRNA,实验组 CollagenⅡ、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA 相对表达量呈时间依赖性递增,但均小于正常对照组(P <0.01),支架与正常髓核在相同位移下的压缩载荷差异无统计学意义(P >0.05)。结论采用髓核体外 NPAMS复合 rBMSCs 可成功构建组织工程髓核。     

骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心肌样细胞的实验研究

目的：研究兔骨髓间充质干细胞（MSCs）的体外分离、培养及向心肌细胞诱导分化的条件。方法：抽取兔髂骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、纯化MSCs，第3代细胞（P3）用流式细胞术检测细胞表面抗原CD34、CD45、CD11b，CD90、CD29。以10μmol／L5-氮胞苷（5-aza）进行诱导分化，4周后，用倒置显微镜、透射电镜观察MSCs形态学变化及超微结构特征，RT—PCR检测心肌特异性β-肌球蛋白重链（β—MHC）、肌钙蛋白I（cTnI）的表达。结果：兔MSCs呈贴壁集落生长，流式细胞术检测显示P3细胞均一性在97％以上，纯度较高。诱导后细胞体积较诱导前增大，更加细长。14天后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致。4周后，透射电镜下有肌丝、心房特殊颗粒及线粒体等心肌细胞超微结构形成。RT—PCR显示B—MHC、cTnI呈阳性反应。结论：MSCs在体外经5-aza诱导可以向心肌细胞进行分化。     

兔骨髓间充质干细胞的生物学特性实验研究

目的 了解兔骨髓闻充质干细胞的生物学特性，为组织工程寻找理想的种子细胞。方法 采用Percoll梯度离心及体外细胞贴壁培养技术对兔骨髓间充质干细胞分离、纯化和原代、传代培养观察。细胞染色。结果 获得的兔自体骨髓间充质干细胞形态均一，传代细胞之间有着不全相同增殖生长特点。细胞染色：PAS、ANAE阳性，AIP、ACP阴性，苯胺蓝染色阴性，胶原I型免疫染色为阳性，胶原Ⅱ型免疫染色则为阴性。结论 骨髓间充质干细胞具有独特生物学特性，将成为组织工程独特的种子干细胞。     

人骨髓间充质干细胞体外培养的实验研究

目的 探讨人骨髓间充质干细胞体外培养的可靠方法.方法 采用人手术切下的骨头标本,运用全骨髓贴壁法分离培养hBMSCs;观察并绘制生长曲线;取生长状态良好的第四代细胞,通过形态学、流式细胞仪检测表面标志物等鉴定hBMSCs;诱导hBMSCs分化为成脂肪细胞,鉴定本实验所分离的hBMSCs是否具有多向分化能力.结果 第四代细胞CD29和CD44阳性表达率分别为100%和99.8%,CD31和C1345阳性表达率分别为0.8%和0.4%.流式细胞仪检测证明本研究分离培养hBMsCs的方法可以获得高纯度的间充质干细胞.hBMSCs体外诱导向脂肪细胞分化16d后,镜下可见胞浆内充满圆形脂滴,油红O染色阳性,诱导成脂肪细胞分化率为85.1±3.2%,证实本实验分离的IiBMSCs具有多向分化能力.结论 采用手术切下的骨性关节炎标本,运用全骨髓贴壁法可获得稳定、均质性良好的hBMScs,并具有多向分化能力.本方法能为临床上分离、培养入骨髓间充质干细胞提供了另一种可靠的路线.     

骨髓间充质干细胞成骨细胞分化研究进展

骨髓间充质干细胞(BMSCs)的基础研究和临床应用广泛,BMSCs具有良好的成骨分化潜能,同时具有多向分化的能力,可向脂肪、骨、软骨细胞分化。BMSCs在合适的生长因子作用下可以快速地向成骨细胞分化和增殖,并且具有容易取材、容易分离、容易扩增、多谱系转化而不发生明显免疫排斥反应等优点,在骨组织工程领域拥有广泛的应用价值。但是,随着使用增多,存在的问题也日益突出,如生物学特性、分离鉴定、诱导分化和临床应用进展等问题还有待进一步解决。     

骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

摘要 心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是心血管疾病中最常见且最严重的疾病,心肌梗死后心肌组织的损伤、 凋亡和不能再生的问题一直无法解决。在组织工程的研究中发现,通过干细胞治疗损伤的心肌组织从而改善心脏功能 是最理想的选择。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymalstemcells,BMSCs)具有自我更新、多向分化、获取容 易、增殖迅速的生物学特性,同时具有旁分泌、抗炎抗纤维化、免疫抑制、促血管生成等作用,因此,BMSCs是治疗心血管 疾病的理想途径。诱导BMSCs向心肌细胞方向分化的方法包括化学、生物、物理等方法。该综述主要对BMSCs的生物 特性、作用机制以及在体外诱导 BMSCs向心肌细胞方向分化的方法进行了总结。     

用骨髓基质干细胞分化的内皮细胞体外构建组织工程心脏瓣膜

目的:探讨用骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导分化产生的内皮细胞和去细胞异种天然瓣膜支架体外构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)的可行性.方法:以含EGF、bFGF、IGF和肝素的M199培养液培养绵羊原代BMSCs,并以VEGF诱导BMSCs向内皮细胞分化.采用去污剂和酶消化法制作去细胞猪主动脉瓣支架,通过静态种植方法构建TEHV.经H-E染色、免疫组化、扫描电镜及透射电镜检查观察TEHV的组织学和超微结构.结果:诱导分化产生的内皮细胞在去细胞瓣叶支架及整体瓣膜支架上呈单层生长,形成完整的内皮细胞单层.瓣叶表面细胞呈梭形, CD34及Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色阳性.结论:BMSCs诱导分化产生的内皮细胞具有与成熟内皮细胞相同的生物学特性.采用BMSCs诱导分化内皮细胞构建TEHV更为简便可行.     

新型组织工程化人工骨的体外初步构建

目的 应用组织工程学技术，体外初步构建有活性的人工骨。方法 培养，诱导人间充质干细胞向成骨细胞表型转化，制备性能优越的支架材料，将细胞与材料复合构建人工骨，在体外培养一定时间后，扫描电镜观察组织工程化骨的微观结构和消化细胞行碱性磷酸酶染色。结果 L－聚乳酸，聚磷酸钙纤维，I型胶原按一定的方法可构建出新型的骨组织工程复合支架材料，诱导后的间充质干细胞可在材料内良好贴附生长，维持成骨细胞表型。结论 本实验为骨组织工程学的进一步研究与应用提供了新的材料和方法。     

转染VEGF165的鼠膀胱平滑肌细胞种植小肠粘膜下层在大鼠膀胱重建中的应用

目的：了解转染VEGF165的鼠膀胱平滑肌细胞种植小肠粘膜下层在大鼠膀胱重建中的促血管生成作用.方法：将种植了转染VEGF的膀胱平滑肌细胞的小肠粘膜下层（SIS）体外培养后移植至大鼠体内,并以膀胱缺损自然愈合和单纯植入SIS为对照进行观察,于术后10wk内每隔2wk取标本进行组织学和免疫组化检测CD34和VEGFR2的表达,观察支架植入物的组织生长和修复情况.结果：膀胱缺损自然愈合组的大鼠术后1wk时膀胱缺损区已有膀胱移行上皮形成,第2周时新生的膀胱粘膜已覆盖缺损区.在植入SIS的两组动物中,术后1wk时炎性细胞浸润明显,可见膀胱移行上皮形成;术后2wk时炎性细胞减少,单纯SIS植入组和转染VEGF组均可见完整的上皮形成,两组未见明显的差异;此时已有新生毛细血管,VEGF受体的表达呈阳性,且转染VEGF组中新生毛细血管数量和VEGF受体的阳性表达细胞数高于单纯SIS植入组（P〈0.05）;术后4wk时新生毛细血管形成较第2周时明显增多（P〈0.05）,但两组间新生毛细血管数和VEGF受体表达阳性细胞数未见显著性差异,同时两组可见少量平滑肌纤维形成;术后6wk以后平滑肌形成逐渐增多,到第10周时可见明显的平滑肌束,两组间新生毛细血管数和VEGF受体表达阳性细胞数未见显著性差异.结论：转染VEGF165的鼠膀胱平滑肌细胞种植小肠粘膜下层在大鼠膀胱重建4wk内有促血管生成作用,6wk后两组新生毛细血管数和VEGF受体表达阳性细胞数未见显著性差异.     

利用软骨细胞外基质来源的多孔支架与骨髓基质干细胞体外长期培养组织工程化软骨的试验研究

研究背景 关节软骨损伤临床常见,但损伤后自我修复能力极差,目前的修复方法均有其局限性。在先前的研究中,我们研制了关节软骨细胞外基质来源的多孔支架（Cartilage ECM-derived porous scaffold, CEDPS）并观察了并在裸鼠体内异位构建软骨。但在进一步可能的临床应用之前,应进一步评估其体外培养组织工程软骨的特点及可行性。 方法 本研究利用关节软骨细胞外基质来源的支架及骨髓基质干细胞体外长时间培养构建软骨组织。粉碎人关节软骨,脱细胞处理后差速离心法收集细胞外基质悬液,采用冷冻干燥技术制备三维多孔支架。扫描电镜及Micro-CT观察其微观结构,并进行细胞毒性试验,组织学观察,生化成分定量检测其胶原、氨基葡聚糖（GAG）、DNA含量,生物力学方法测量其干性及覆水状态下压缩弹性模量;骨髓基质干细胞经含TGF-β1, bFGF的条件培养基成软骨诱导后鉴定,种植到支架上,荧光显微镜及扫描电镜观察细胞黏附情况,Dead/Live免疫荧光染色观察支架内部细胞活性,体外培养1,3周后观察大体形态和组织学形态变化,同时行II型胶原免疫组织化学分析。 结果 制备的CEDPS支架无细胞碎片残留,软骨细胞外基质特异性染色阳性,具有相互贯通的三维孔隙结构;支架生化成分定量检测：总胶原含量为708.2?44.7μg/mg,GAG含量为254.7?25.9μg/mg;支架纵向压缩弹性模量E = 1.226?0.288MPa,覆水后压缩弹性模量E = 0.052?0.007MPa。体外培养的BMSCs-CEDPS复合体形成了类软骨样组织,Dead/Live染色表明支架内部均为活细胞,电镜检查结果表明细胞广泛均匀的分布在支架内部,呈圆形或椭圆形,在支架上增殖显著,细胞基质分泌明显。组织学结果表明蕃红花“O”、Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,表明随着培养时间的增加,细胞在支架中增殖显著,细胞外有大量基质分泌。 结论 CEDPS支架在生化组成和结构上与软骨细胞外基质成分类似,去细胞彻底,具有良好的生物力学特性,是一种较为理想的软骨组织工程支架载体;成软骨诱导的BMSCs与CEDPS支架在体外可初步构建类软骨样组织。     

In vitro cartilage production using an extracellular matrix-derived scaffold and bone marrow-derived mesenchymal stem cells

Background Cartilage repair is a challenging research area because of the limited healing capacity of adult articular cartilage.We had previously developed a natural,human cartilage extracellular matrix （ECM）-derived scaffold for in vivo cartilage tissue engineering in nude mice.However,before these scaffolds can be used in clinical applications in vivo,the in vitro effects should be further explored.Methods We produced cartilage in vitro using a natural cartilage ECM-derived scaffold.The scaffolds were fabricated by combining a decellularization procedure with a freeze-drying technique and were characterized by scanning electron microscopy （SEM）,micro-computed tomography （micro-CT）,histological staining,cytotoxicity assay,biochemical and biomechanical analysis.After being chondrogenically induced,the induction results of BMSCs were analyzed by histology and Immunohisto-chemistry.The attachment and viability assessment of the cells on scaffolds were analyzed using SEM and LIVE/DEAD staining.Cell-scaffold constructs cultured in vitro for 1 week and 3 weeks were analyzed using histological and immunohistochemical methods.Results SEM and micro-CT revealed a 3-D interconnected porous structure.The majority of the cartilage ECM was found in the scaffold following the removal of cellular debris,and stained positive for safranin O and collagen Ⅱ.Viability staining indicated no cytotoxic effects of the scaffold.Biochemical analysis showed that collagen content was （708.2±44.7）μg/mg,with GAG （254.7±25.9） μg/mg.Mechanical testing showed the compression moduli （E） were （1.226±0.288） and （0.052±0.007） MPa in dry and wet conditions,respectively.Isolated canine bone marrow-derived stem cells （BMSCs） were induced down a chondrogenic pathway,labeled with PKH26,and seeded onto the scaffold.Immunofluorescent staining of the cell-scaffold constructs indicated that chondrocyte-like cells were derived from seeded BMSCs and excreted ECM.The cell-scaffold constructs contained pink,smooth and translucent cartilage-like tissue after 3 weeks of culture.We observed evenly distributed cartilage ECM proteoglycans and collagen type Ⅱ around seeded BMSCs on the surface and inside the pores throughout the scaffold.Conclusion This study stuggests that a cartilage ECM scaffold holds much promise for in vitro cartilage tissue engineering.     

大鼠骨髓间充质干细胞与脱细胞脊髓支架体外共培养

目的 评价脱细胞脊髓支架在大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养中的作用,探索最佳接种浓度.方法 分离、培养及鉴定SD大鼠BMSCs,诱导BMSCs向神经元样细胞分化.制备脱细胞脊髓支架,将第3代BMSCs同脱细胞脊髓支架共培养,MTT法检测细胞增殖活性,比较与普通培养的差异;取第3代BMSCs以不同浓度[(0.5、1、2、3、4)×106/mL]接种于支架(脊髓支架修整0.5 cm小段),检测细胞在支架上的粘附率及上架细胞数,建立接种浓度与细胞粘附率、上架细胞数的关系回归方程;扫描电镜观察脱细胞脊髓支架形态以及细胞与支架的粘附情况.结果 成功实现BMSCs的分离及培养,BMSCs流式鉴定CD29、CD90阳性表达,向神经元诱导胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、巢蛋白(Nestin)呈阳性表达;与普通培养相比,BMSCs在支架上细胞增殖活力显著提高(P＜0.05);细胞与支架的粘附率在接种浓度为2×106/mL最高,达到(79.6±2.7)％,单位体积上架细胞数达到(1.364±0.047)×106/cm3;扫描电镜观察支架空间结构良好,细胞与支架粘附良好,共培养第3天较第1天细胞数量明显增加.结论 脱细胞脊髓支架具有多通道的空间结构,适合BMSCs粘附、存活、增殖,该支架是良好的天然脊髓组织工程材料.当粘附率及细胞上架数基本达到最大时的最佳接种浓度为2×106/mL.     

血红素加氧酶-2基因敲除对Fe2+诱导的小鼠脑氧化应激损伤中基底节细胞的保护作用

目的:以人体骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞,以去细胞猪主动脉瓣为支架,体外三维构建组织工程心脏瓣膜(TEHV).方法:以胸外科术中切除的肋骨为骨髓来源,采用1.073 g/ml的Percoll梯度分离液离心法获取BMSCs,体外培养扩增、鉴定;以0.05%胰酶 0.02?TA消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架,将体外培养扩增的BMSCs种植于支架上,体外三维培养,应力环境下构建TEHV,观察TEHV细胞分泌的一氧化氮(NO)及内皮素(ET-1)水平、免疫组化特征及光镜和电镜下的结构.结果:人BMSCs为梭形,α-SMA及Vimentin染色阳性,CD-31及Ⅷ因子染色阴性,其分泌NO及ET-1分别为(104.1±5.9)μmol/L及(40.9±7.6)ng/L,明显较正常人血管内皮细胞低(P＜0.01);猪去细胞瓣膜支架去细胞完全,弹力纤维及胶原纤维保持完整;应力条件下体外三维构建的TEHV上活细胞数较静态下构建明显增多(P＜0.01),H-E染色示人BMSCs在支架上生长良好,形成完整的细胞层,扫描电镜示瓣膜表面细胞层完整,细胞呈梭形生长.结论:人BMSCs作为种子细胞已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可作为一种有前途的种子细胞构建自体TEHV;体外三维应力条件下构建TEHV效果明显优于静态培养.     

骨髓间充质干细胞在心脏组织工程中的应用

骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多向分化潜能，体外可诱导分化为心肌细胞，采用组织工程学技术可在体外构建组织工程化心肌组织。文章从心脏组织工程的角度对BMSCs作一概述。     

EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的初步研究

目的探讨EphB6在小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSC)成骨分化中的作用及其可能机制。方法将BMSC通过双相接种法接种于脱钙骨基质,分为4组:成骨诱导5、14 d(A、B组),普通培养5、14 d(C、D组),茜素红染色检测钙结节,定量检测各组碱性磷酸酶活性,Runx2、Osterix和EphB6的mRNA表达,采用游离态配体ephrinB1-Fc激活EphB6并重复检测上述指标。结果 ALP活性、Runx2和Osterix在A、B组增高,且B组检测到最高的ALP活性[(7.32±2.02)金氏单位/100 ml]、Runx2(3.442 6±0.258 5)倍和Osterix(2.482 3±0.329 2)倍。EphB6的表达水平在A、B组降低,且在B组最低(0.754 3±0.023 5)倍。以ephrinB1-Fc激活EphB6后,茜素红染色显示钙结节明显减少,ALP活性显著下降(P<0.05),在高浓度配体作用后ALP活性[(12.20±1.30)金氏单位/100 ml]较低浓度配体[(15.40±1.03)金氏单位/100 ml]有进一步下降(P=0.008)。配体作用后,BMSC成骨分化中Runx2和Osterix的表达显著下降。结论 EphB6通过调控Runx2和Osterix抑制BMSC成骨分化。