Survivin反义寡核苷酸对人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤生长的影响与机制

目的探讨survivin反义寡核苷酸（ASODN）在活体内对人卵巢癌细胞种植性转移能力和腹腔移植瘤形成的影响,分析其
可能的作用机制。方法构建人卵巢癌SKOV3细胞株裸鼠腹腔移植瘤模型,实验组给予survivin ASODN腹腔注射,同时对照
组给予生理盐水腹腔注射,比较两组动物腹腔移植瘤形成和生长情况的改变,并通过蛋白印迹法检测两组腹腔移植瘤组织中白
细胞介素6（IL-6）、信号转导与活化因子3（STAT3）、磷酸化的信号转导与活化因子3（p-STAT3）、survivin蛋白表达的改变。结
果Survivin ASODN 组人卵巢癌细胞裸鼠腹腔移植瘤数量和重量都较对照组明显减小（P<0.05）,IL-6、STAT3、p-STAT3、
survivin蛋白表达均明显下降（P<0.05）。结论Survivin ASODN在活体内能有效降低人卵巢癌细胞侵袭和种植性转移能力,能
有效抑制卵巢癌腹腔移植瘤的生长,这些作用是通过抑制IL-6/STAT3信号通路的活性来完成的。靶向survivin基因的反义核
苷酸治疗将成为临床防治卵巢癌复发和转移重要手段,有重要的临床价值。
     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

脐带间充质干细胞对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：观察脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)抑制人卵巢癌SKOV3细胞增 殖及促进其凋亡的作用。方法：采用Transwell共培养观察UC-MSCs向卵巢癌细胞靶向归巢的作用;MTT 实验检测UCMSCs 条件培养基抑制SKOV3细胞增殖情况;Annexin V-FITC/PI双染法检测其凋亡率;实时PCR检测与SKOV3细胞增殖 和凋亡相关基因Ki-67,Bax,Bcl-2的表达。结果：UC-MSCs体外向SKOV3细胞靶向归巢。MTT 结果显示UC-MSCs条件 培养基明显抑制SKOV3细胞的增殖(P<0.01)。Annexin V-FITC/PI双染法提示75%条件培养基组的凋亡率明显高于对照 组(P<0.05)。实时PCR发现增殖相关基因Ki-67的表达明显下降(P<0.01),凋亡相关基因Bcl-2的表达明显降低(P<0.01), Bax的表达明显增加(P<0.01)。结论：UC-MSCs体外能向卵巢癌细胞靶向归巢,通过调节增殖相关基因Ki-67的表达, 抑制SKOV3细胞增殖;通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax的表达,促进SKOV3细胞凋亡。     

RNAi沉默EGFR基因在卵巢癌裸鼠移植瘤的成瘤抑制作用

目的:探讨应用RNA干扰技术沉默EGFR基因对卵巢癌SKOV3细胞成瘤力的抑制作用.方法:构建针对EGFR序列特异性dsRNA的表达载体,用脂质体转染SKOV3细胞及G418筛选阳性克隆.建立裸鼠移植瘤模型,分为阳性干扰组、阴性对照组、空白对照组.监测瘤体积,测量瘤质量,采用RT-PCR、Western Blot、免疫组化检测移植瘤EGFR基因的表达.结果:阳性干扰组成瘤力明显降低,EGFR mRNA和蛋白的抑制率分别为78.8%和76.4%.结论:动物实验证实RNAi沉默EGFR基因可明显抑制卵巢癌的成瘤力.     

小鼠白介素-12在人卵巢癌SKOV3中的抗肿瘤作用

目的观察转染至SKOV3卵巢癌细胞中小鼠IL-12全长基因的质粒能稳定表达相关细胞因子基础上,在脾细胞存在的情况下对SKOV3肿瘤细胞的杀伤作用.方法MTT方法检测对SKOV3卵巢癌细胞增殖的影响,免疫组化法检测SKOV3卵巢癌细胞表面IL-12蛋白的表达.结果转染后癌细胞免疫组化可见IL-12表达,在脾细胞的作用下,MTT结果显示IL-12对SKOV3卵巢癌细胞有抑制其增殖的作用,P＜0.05.结论成功地将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞中并稳定表达相关细胞因子,在脾细胞存在情况下对SKOV3细胞有抑制其增殖作用,从而杀伤卵巢癌细胞,具有抗肿瘤作用.     

mIL-12基因转染人卵巢癌SKOV3细胞株抗肿瘤免疫作用研究

目的 观察含mIL-12全长基因的质粒转染到SKOV3卵巢癌细胞中,在脾细胞存在的情况下相关细胞因子的表达及免疫抗肿瘤作用.方法 脂质体转染技术将基因转染至SKOV3卵巢癌细胞中(SKOV3/IL-12),同时以空质粒载体转染SKOV3细胞(SKOV3/neo)作为对照,描绘生长曲线,ELISA方法检测IL-12及INF-γ的表达,MTT方法检测对SKOV3卵巢癌细胞的抑制率.结果 转染48、60h SKOV3/IL-12细胞中IL-12蛋白表达量与SKOV3/neo及SKOV3组比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);SKOV3/IL-12细胞增殖能力降低,抑制率63.71%与SKOV3/neo及SKOV3细胞比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).在脾细胞作用下产生INF-γ,以作用后24h表达量高,约(173±17.8)pg/mL,较未转染组高,比较有统计学意义(P＜0.05);在脾细胞的作用下,IL-12对SKOV3卵巢癌细胞有抑制其增殖的作用.结论 ①可以将IL-12基因转染至SKOV3卵巢癌细胞中并表达IL-12.②IL-12基因转染在效应细胞作用下能够明显降低 SKOV3细胞株的增殖能力.     

yrdC靶向RNA干扰抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤的实验研究

目的检测胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达yrdC靶向RNA干扰的重组腺病毒,转染人胃癌细胞株BGC-823,检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化,转染后细胞移植裸鼠体内成瘤,观察yrdC沉默后移植瘤生长的变化。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法,检测7例胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达针对人yrdC的si RNA的重组腺病毒,重组腺病毒Ad-shyrdC转染BGC-823细胞,Western blot检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化。裸鼠分3组,分别皮下移植转染Ad-shyrdC、空病毒Ad-Null及未转染的BGC-823细胞（1&#215;107/只）,5周后检测裸鼠肿瘤的体积及质量,肿瘤HE染色及yrdC、PCNA、TUNEL免疫组化染色,观察各组yrdC蛋白表达、细胞增殖能力及细胞凋亡的变化。结果胃癌组织中yrdC mRNA及蛋白表达量均比癌旁组织增高。成功构建表达抑制yrdC基因的重组腺病毒Ad-shyrdC,腺病毒介导的yrdC靶向RNA干扰能特异性抑制BGC-823中yrdC蛋白的表达,Ad-shyrdC组肿瘤细胞yrdC蛋白水平明显下降。转染BGC-823细胞后移植裸鼠体内,5周后成瘤体积及质量较Ad-Null组及PBS对照组明显减小（P〈0.05）;yrdC蛋白表达减少,PCNA染色提示肿瘤细胞增殖活性受抑,TUNEL染色显示凋亡明显增多（P〈0.01）。结论腺病毒介导的RNA干扰能有效抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤,yrdC基因有可能成为胃癌基因治疗的靶点。     

稳定低表达DNA甲基转移酶3b基因对膀胱癌细胞生长和凋亡的影响

目的探讨稳定低表达DNA 甲基转移酶3b（DNMT3b）基因对人膀胱癌细胞生长和凋亡的影响。方法包装表达
DNMT3b siRNA和阴性对照siRNA的慢病毒,通过慢病毒感染的方法获得稳定低表达DNMT3b的膀胱癌细胞BIU-87及对照
细胞。MTT和流式细胞仪检测DNMT3b稳定低表达对细胞增殖和凋亡的影响;体内裸鼠成瘤实验观察DNMT3b稳定低表达
对肿瘤的抑制效果;荧光定量PCR和Western blot检测DNMT3b稳定低表达对细胞生长和凋亡相关基因表达的影响;甲基化特
异性PCR检测对细胞生长和凋亡相关基因甲基化的影响。结果荧光定量PCR和Western blot检测结果显示,DNMT3b mRNA
和蛋白水平在BIU-87稳定细胞株中稳定低表达;DNMT3b稳定低表达可以抑制BIU-87细胞的生长,并且抑制裸鼠皮下瘤体的
生长;DNMT3b稳定低表达可以促进BIU-87细胞的凋亡;DNMT3b稳定低表达可以增加凋亡及细胞生长相关基因DAPK,Bax
和RASSF1A mRNA和蛋白水平的表达;DNMT3b稳定低表达可以减少凋亡及细胞生长相关基因DAPK,Bax和RASSF1A启
动子区域的甲基化水平。结论DNMT3b稳定低表达可能通过调控凋亡相关基因以及细胞生长相关基因启动子区域的甲基化
水平来影响基因的表达,从而抑制BIU-87细胞的生长,诱导细胞凋亡。
     

告达庭抑制卵巢癌生长及其机制的研究

目的 研究告达庭(caudation)对卵巢癌生长的抑制作用及其机制。方法 细胞实验分为两组,即对照组和告达庭组(30μmol/L告达庭作用卵巢癌细胞SKOV3 24h)。CCK-8法检测细胞增殖;ELISA法检测细胞凋亡;Western blot法检测SKOV3细胞中DNMT1、Axin、Bcl-2、cyclinD1蛋白的表达。观察告达庭对卵巢癌细胞内凋亡相关蛋白的表达作用。建立起裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型,观察移植瘤的生长,实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达。结果 与对照组比较,告达庭可抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖,并促进癌细胞凋亡,呈浓度依赖性;告达庭干预后,DNMT1、Bcl-2及cyclinD1表达均下降,Axin表达上调。在体外移植瘤实验中,告达庭可抑制移植瘤的生长,并抑制卵巢癌组织内DNMT1、Bcl-2及cyclinD1基因表达,上调Axin基因表达。结论告达庭可抑制卵巢癌生长,其机制可能与调控DNMT1/β-catenin信号通路有关。     

漆黄素抗卵巢癌的体内外作用研究

目的 观察漆黄素对人卵巢癌细胞株SKOV3及其移植瘤的抑制作用,探索漆黄素的抗卵巢癌作用。方法 电镜直接观察漆黄素干预人卵巢癌细胞SKOV3前后的形态学变化。不同浓度梯度的漆黄素处理人卵巢癌SKOV3细胞株不同时间后,采用MTT法观察肿瘤细胞存活率,流式细胞术检测凋亡。建立人卵巢癌细胞株SKOV3的裸鼠移植瘤模型,观察漆黄素对移植瘤的生长抑制作用,通过Western blot测定Bcl-2、Bax、聚腺苷二磷酸核糖多聚酶（PARP）等蛋白的表达,探讨漆黄素抑制肿瘤生长的信号通路。结果 电镜下可见漆黄素作用人卵巢癌SKOV3细胞后,细胞染色质聚集和凋亡小体产生。MTT实验显示漆黄素对人卵巢癌SKOV3细胞增殖的抑制作用具有浓度依赖性。流式细胞术显示漆黄素可诱导人卵巢癌SKOV3细胞的凋亡。裸鼠移植瘤模型显示,漆黄素干预后移植瘤体积和质量均明显下降;Western blot结果显示漆黄素作用后,移植瘤内凋亡因子Bax的表达明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达明显下降,凋亡蛋白PARP被明显剪切;上述变化尤以高浓度（400 mg/kg)漆黄素干预组明显。结论 漆黄素可通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡,发挥抗卵巢癌作用,其有望成为一种预防和治疗卵巢癌的安全有效的天然药物。     

慢病毒介导RNA干扰沉默Fas 基因在脐带间充质干细胞中的表达

目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质
干细胞（UC-MSCs）株,为下一步使用低表达Fas 基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas 基因
mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获
得重组慢病毒,通过感染293T 细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染
UC-MSCs,应用Real time- PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测
序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108 TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas
表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。
     

重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10构建及其在HSC中的表达

目的利用AdEasy系统构建重组复制缺陷型腺病毒AdIL-10，并观察其在肝星状细胞(HSC)中的表达。方法从SD大鼠脾脏单核细胞中抽提总RNA，通过RT—PCR获得鼠IL-10 cDNA片段，插人穿梭质粒pAdTrack巨细胞病毒(CMV)启动子下游，构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-IL-10，线性化后与AdEasy-1电穿孔共转化BJ5183，获得重组腺病毒质粒pAdIL-10。pAdIL-10用Lipofectamin包装转染HEK 293细胞，获得重组腺病毒AdIL-10。将AdIL-10体外感染HSC，3d后抽提HSC总RNA，以RT—PCR检测IL-10的表达。结果通过酶切和测序法筛选出pAdIL-10；经293细胞包装，3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达；AdIL-10感染HSC3d后观察到GFP表达，通过RT—PCR可检测到IL-10的表达。结论利用AdEasy系统可制备重组腺病毒AdIL-10；AdIL-10感染HSC后可表达IL-10。     

脐带源间充质干细胞可增强自然杀伤细胞对树突状细胞的杀伤活性

目的观察脐带源间充质干细胞对自然杀伤细胞杀伤树突状细胞的影响,初步探讨其作用机制。方法胶原酶消化整个
脐带组织,体外培养间充质干细胞;分离健康人外周血单个核细胞,磁珠分选树突状细胞。在白介素-4和粒单-集落刺激因子共
同作用下获得大量未成熟树突状细胞,将脐带源间充质干细胞与未成熟树突状细胞共培养2 d,同时加入肿瘤坏死因子α,诱导
树突状细胞成熟。流式细胞术检测诱导后树突状细胞CD11c和CD86的表达,ELISA法检测培养液中白介素-12的含量,乳酸
脱氢酶释放法检测自然杀伤细胞对树突状细胞的杀伤活性,流式细胞术检测树突状细胞表面自然杀伤细胞活化性受体的配体
（MICA/B和ULBP1-3）的表达。结果与单纯细胞因子诱导比较,脐带源间充质干细胞诱导后树突状细胞CD11c的表达无明显
差异,但CD86的表达降低,IL-12的分泌量降低。自然杀伤细胞对脐带源间充质干细胞诱导后的树突状细胞的杀伤效率明显高
于单纯细胞因子诱导后的树突状细胞。与单纯细胞因子诱导比较,脐带源间充质干细胞诱导后的树突状细胞活化性受体的配
体（MICA和MICB）的表达增高。结论脐带源间充质干细胞能增强自然杀伤细胞对树突状细胞的杀伤活性,这可能与脐带源
间充质干细胞抑制树突状细胞成熟,上调树突状细胞表面自然杀伤细胞活化性受体的配体有关。
     

三种成体干细胞对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症状态的影响

目的比较人羊膜上皮细胞（（human amniotic epithelial cell, H-AEC））、羊膜间充质细胞（human amniotic mesenchymal
cell, HA-MSC）和脐带间充质细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC）分泌的细胞因子对脂多糖刺激巨噬细胞
系RAW264.7炎症状态的影响。方法将LPS刺激的RAW264.7细胞炎症模型作为对照组,比较H-AEC、HA-MSC、UC-MSC和
RAW264.7共培养或条件培养基培养RAW264.7对RAW264.7炎症状态的影响。比较各组RAW264.7细胞的迁移能力;检测各
组细胞分泌一氧化氮（NO）的水平;用实时定量多聚酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞经典激活的巨噬细胞（classically
activated macrophage, M1 macrophage）相关的促炎基因如白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死基因а（TNFа）、一氧化氮合成酶-2
（NOS-2）以及M2 macrophage相关的抑炎基因如精氨酸酶（Arg-1）、甘露糖受体基因CD206、B类清道夫受体CD36）表达情况。
结果（1）H-AEC、HA-MSC、UC-MSC 处理后RAW264.7 的迁移率分别为14.7%±4.5%、9.6%±0.7%、13.0%±0.9%,与对照组
（31.1%±11.0%）相比,3 种细胞的条件培养基处理后RAW264.7 的迁移率均降低,差异具有显著性（P<0.05）;（2）H-AEC、
HA-MSC、UC-MSC共培养后RAW264.7 细胞分泌NO的水平分别为24.26±0.72、44.52±2.51、42.25±0.76 μmol/L,与对照组
（45.65±1.78 μmol/L）相比,H-AEC组细胞分泌的NO有显著性下降（P<0.05）;（3）促炎基因与抑炎基因的表达改变：（A）H-AEC
处理组促炎基因IL-1β、TNFа、NOS-2、INFβ的表达下调,与对照组相比有显著差别;HA-MSC、UC-MSC处理组促炎基因INFβ表
达下调显著,其余基因均上调表达;抑炎相关基因如Arg-1、CD206、CD36均上调;（B）3组细胞干预后抑炎症相关基因Arg-1、
CD206、CD36表达均上调,与对照组有显著差异。结论人羊膜上皮细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞可以促进巨噬细
胞向M2型分化,但其效果和机制存在不同。
     

脂多糖刺激脐带间充质干细胞上调 IL-1Ra分泌的研究?

目的：探讨脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)激活 Toll 样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)对脐带间充质干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs)分泌白介素1受体拮抗剂(interleukin-1 receptor antagonist,IL-1Ra)的影响。方法采用组织块法从脐带华通胶组织中分离培养 UC-MSCs;流式细胞术检测UC-MSCs表面标志物 CD14、CD34、CD29和 CD105的表达;TLR4配体 LPS 以不同剂量和时间刺激 UC-MSCs,采用 qPCR 法和 ELISA 法检测 IL-1Ra 的 mRNA 和蛋白质表达水平。结果原代组织培养7~10 d,组织周边有贴壁细胞爬出,呈长梭形;UC-MSCs 表面标志物 CD29和 CD105呈阳性表达,而 CD14和 CD34呈阴性表达;LPS 刺激 UC-MSCs 后,IL-1Ra 在基因及蛋白质水平的表达均显著增加,差异有统计学意义(P <0.05),并呈剂量与时间依赖性。结论LPS 刺激 UC-MSCs 可上调 IL-1Ra 的分泌。     

含CEA片段的重组腺病毒转染DCs诱导特异性T细胞对结直肠癌细胞株的体外杀伤作用

目的:探讨人外周血单核细胞来源的树突状细胞转染含CEA片段的重组腺病毒后所诱导的特异性T细胞对直肠癌细胞株LOVO和SW480的体外杀伤作用。方法:抽取HLA表型为A11的健康志愿者外周血,分离单核细胞,体外培养,使用含CEA片断的重组腺病毒转染未成熟DCs,诱导特异性T细胞。检测体外培养的DCs和CTL活性,并使用MTT法检测CTL对LOVO细胞的杀伤作用。结果:转染或未转染的体外培养的成熟DCs高表达CD40、CD86,IL-12,诱导的CTL细胞高表达IFN-γ;转染后DCs诱导特异性CTL可有效识别并杀伤HLA-A11阳性的LOVO细胞。结论:重组腺病毒转染DCs,不明显改变DCs表型和刺激淋巴细胞增殖、分化功能,可诱导自体CTL增殖,含CEA片断的腺病毒转染DCs诱导自体CTL对LOVO细胞有明显杀伤作用。     

低氧对人脐带间充质干细胞活性和内皮分化能力的影响及VEGF的干预作用

目的: 探讨低氧对人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的活性及向内皮细胞分化能力的影响,并进一步探索外源性VEGF对低氧损伤的保护作用。方法: 在体外对hUC-MSCs进行分离培养。对hUC-MSCs的形态学和表型特征进行分析。在添加/不添加50 ng/mL VEGF的情况下,对hUC-MSCs分别进行不同时间的低氧诱导后,对细胞凋亡率、ROS生成及细胞增殖能力进行检测,并对hUC-MSCs的内皮分化能力进行评估。结果: 低氧诱导早期(6, 12 h),hUC-MSCs的凋亡及ROS生成显著增加,增殖能力显著下降;晚期(24,72 h),细胞的增殖及凋亡水平与对照组间无明显差异;高浓度(50 ng/mL)外源性VEGF抑制低氧诱导早期出现的凋亡增加及增殖下降;外源性VEGF存在的情况下,低氧诱导14 d,hUC-MSCs表达早期内皮细胞表型,并能获得部分内皮细胞功能。结论: 低氧早期造成hUC-MSCs急性损伤,晚期通过逐步适应恢复细胞活性并保持了其分化潜能。VEGF能够保护急性缺氧对细胞的损伤,并能诱导其向内皮样细胞分化。     

重组人白细胞介素10基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的：克隆编码人白细胞介素10（hIL-10）基因的全长cDNA,构建真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中进行表达.方法：应用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）技术,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出hIL-10 cDNA,将测序正确的hIL-10 cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3构建重组表达载体.采用磷酸钙法转染CHO细胞,用ELISA法检测hIL-10基因的表达,用单四唑（MTT）检测hIL-10蛋白的活性.结果：RT-PCR产物插入Teasy载体,经序列测定证实hIL-10基因全序列克隆成功.在CHO细胞培养上清中有hIL-10的表达,该产物能抑制淋巴细胞转化.结论：成功构建了真核表达质粒pcDNA3-hIL-10,为进一步研究hIL-10在自身免疫、移植免疫及炎症性疾病中的作用打下了基础.     

脐带间质干细胞移植对G raves病小鼠调节性B细胞的影响

目的：探讨脐带间质干细胞（UC-MSCs）治疗Graves病（GD）小鼠的作用机制。方法32只小鼠随机分为正常对照组（G0组）、GD对照组（G1组）和UC-MSCs治疗组（G2组）。留取小鼠血清,化学发光法检测血清游离甲状腺素（FT4）水平,酶联免疫吸附法检测甲状腺刺激抗体（TSAb）浓度。取甲状腺,制备石蜡切片行苏木精-伊红染色。取脾脏,部分制成单个核细胞悬液,行三标记免疫荧光染色、流式细胞分析CD1dhiCD5＋CD19＋Bregs比例;部分脾脏提取总RNA ,实时荧光定量PCR检测Bregs相关细胞因子白细胞介素-10（IL-10）mRNA和转化生长因子-β（TGF-β）mRNA的表达水平。结果26周时G2组血清中 TSAb浓度与脾脏组织中CD19＋B细胞较G1组明显降低（P＜0．05）,B细胞中CD1dhiCD5＋CD19＋ Bregs所占比例和脾组织IL-10 mR-NA、TGF-βmRNA表达量较G1组却明显上升（P＜0．05）,且在移植前、后血清TSAb浓度差与脾脏中CD1dhiCD5＋ CD19＋ Bregs所占比例变化呈显著负相关,与IL-10、TGF-βmRNA的表达量变化呈显著正相关。结论 UC-MSCs可能通过上调Bregs表达而发挥治疗作用。