蝎毒素BmK M2的分离鉴定及其电生理活性研究

从东亚钳蝎蝎毒中分离鉴定出新型的Na⁺通道毒素,采用Sephadex-G-50分子筛、高效液相色谱、多肽指纹图谱及氨基酸测序等技术从野生东亚钳蝎毒液中分离鉴定了一种长链多肽毒素BmK M2,其相对分子质量为7 235.5,由64个氨基酸组成,包含4对二硫键。序列比对显示,BmK M2的序列与已发现的Na⁺通道毒素BmK M1、BmK M3、BmK M9等具有较高的序列和结构相似性,是一种潜在的新型Na⁺通道调节剂。全细胞膜片钳实验结果显示,BmK M2可显著增强电压门控Na⁺通道Nav1.7的激活,延迟Nav1.7的稳态失活及关闭状态失活,但对Nav1.8无活性。实验结果表明BmK M2可作为一种新型的Na⁺通道探针,用于Nav1.7结构功能研究以及靶向药物的开发。     

酶联免疫吸附法检测雨生红球藻超临界提取物中微囊藻毒素含量

建立酶联免疫吸附法检测雨生红球藻超临界提取物中微囊藻毒素含量方法,并进行了方法学验证,标准曲线为y=-2．5032x＋2．504,R2=0．9994,检测范围0．1ng／mL～2ng／mL,平均加样回收率为93．3％,结果表明该方法准确可靠。运用该方法对10批20个样品进行了微囊藻毒素含量检测,均未检出囊藻毒素,表明采用超临界方法提取的雨生红球藻产品未受到微囊藻毒素污染,可以安全食用。     

黄曲霉毒素B1快速检测方法的研究进展

黄曲霉毒素B1是黄曲霉毒素系列中毒性、危害性、污染性最大的一种,且分布广,对世界范围内的大多数食品原料及成品均有不同程度的污染,严重威胁人类健康。目前,国内外对于黄曲霉毒素B1的检测要求越来越高,新发展起来的快速分析技术也逐渐应用于黄曲霉毒素B1的检测,除了常规的液相色谱法、薄层层析法、胶体金法、酶联免疫吸附法得到更充分的研究和应用外,时间分辨荧光免疫法等新兴免疫学快速检测方法以及具有创新意义的ELISA-TLC组合分析法也已初步建立,这些为实现快速筛查、现场快检,提高检测效率、降低检测成本提供了很好的思路;同时也为更好地维护人民群众饮食安全提供重要支撑。本文就黄曲霉毒素B1的快速检测方法做一综述,以期为进一步提高对黄曲霉毒素B1的监控水平和效率提供参考。     

全蝎新型炮制与传统炮制的对比研究

目的:对比新型炮制方法酒炙烘干与传统盐水煮烘在全蝎药材出干率、水与醇浸出物含量、元素含量等方面的差异,为确定新型加工方法提供理论依据。方法:分别用酒炙烘干、盐水煮烘2种方法对全蝎进行加工,测定其出干率、水与醇浸出物含量、各种元素含量等指标,并依据上述指标对2种加工方法进行综合评价。结果:盐全蝎出干率优于酒全蝎(P<0.05);两种方法的水浸出物含量无显著性差异(P>0.05),醇浸出物含量则酒全蝎明显优于盐全蝎(P<0.01);酒全蝎的宏量元素Ca、Mg和微量元素Fe、Cu的含量与盐全蝎无明显差异(P>0.05);酒全蝎的微量元素Zn、Pb、Mn的含量明显高于盐全蝎(P<0.05)。结论:采用酒炙烘干进行全蝎加工在药物品质方面优于传统盐水煮烘,且酒炙后能除腥和引药上行,值得推广使用。     

炭吸附法清除破伤风毒素的动物实验研究

目的探讨炭肾血液灌洗对破伤风毒素的清除能力,建立破伤风毒素的实验室检测方法.方法厌氧培养破伤风梭菌,制取破伤风毒素;将破伤风毒素静脉注入兔子体内以制备破伤风动物模型,发病后以炭肾行血液灌洗.采用本研究建立的SABC-ELISA法检测炭肾灌洗前后血液中破伤风毒素的含量变化.结果建立起了间接双抗体夹心ELISA法检测破伤风毒素的实验室方法,检测下限可达破伤风梭菌培养上清的最大稀释度1:50000左右,灵敏度极高.使用炭肾灌洗血液后,实验兔血清中破伤风毒素的含量下降80%以上.结论炭肾灌洗能有效清除血液中的破伤风毒素.并建立起了检测破伤风毒素的实验室方法.     

马齿苋总黄酮的提取工艺研究

目的:研究马齿苋总黄酮的提取工艺。方法:采用正交设计法及聚酰胺吸附分离法,以提取物中总黄酮含量为指标,考察马齿苋的提取工艺;并应用分光光度法测定提取物中总黄酮含量。结果:马齿苋的最佳提取工艺为每次加40倍的70%乙醇溶液,提取2次,每次提取60 min,所得提取液中的总黄酮含量最高;并应用聚酰胺吸附分离其中的总黄酮,以芦丁为标准品,以510 nm为检测波长,用UV法检测马齿苋总黄酮在0.007-0.0764 mg/ml范围内,浓度与吸光度呈良好的线性关系,相关系数R2=0.9991,该法所得提取物中总黄酮的相对含量最高为6.936%。结论:应用醇提、聚酰胺吸附分离法提取马齿苋中的总黄酮,方法简便、准确,为鉴定马齿苋的质量提供了一种可行的方法。     

钠离子荧光探针用于检测雪卡毒素的细胞毒性

目的研究和建立以细胞为基础的结合钠离子荧光探针检测雪卡毒素的方法,为快速、敏感检测雪卡毒素提供科学的实验依据。方法采用雪卡毒素标准品(P-CTX-1)结合乌苯苷和黎芦定处理小鼠脑神经瘤细胞(N-2A),用钠离子荧光探针(CoroNaTM Green)标记细胞,利用多功能酶标仪检测荧光强度,建立雪卡毒素浓度与荧光强度的标准曲线关系式;同时,采用CCK-8法和酶标仪检测毒素处理组细胞的存活率,建立细胞毒性实验的标准曲线关系式;分析比较两种方法的灵敏度。以两种方法分别对采集的33份深海珊瑚鱼样品进行毒素检测,对检测结果作分析比较。结果以细胞为基础的荧光检测法检测样品中毒素的检出限为10-13 g/ml,而细胞毒性试验检测法检测样品中毒素的检出限为10-12 g/ml,其结果具有一定的相关性,且荧光检测法灵敏度比细胞毒性试验高;同时钠离子荧光探针检测法的实验终点比CCK-8法缩短2～4 h。结论以细胞为基础的结合钠离子荧光探针检测法能快速、敏感地检测雪卡毒素,可作为雪卡毒素检测初筛方法推广应用。     

全蝎新型炮制与传统炮制的对比研究

目的：对比新型炮制方法酒炙烘干与传统盐水煮烘在全蝎药材出干率、水与醇浸出物含量、元素含量等力面的差异，为确定新型加工方法提供理论依据。方法：分别用酒炙烘干、盐水煮烘2种方法对全蝎进行加工，测定舅出干率、水与醇浸出物含量、各种元素含量等指标，并依据上述指标对2种加工方法进行综合评价。结果：盐全蝎出干率优于酒全蝎（P〈0．05）；两种方法的水浸出物含量无显著性差异（P〉0．05），醇浸出物含量则酒全蝎明显优于盐全蝎（P〈0．01）；酒全蝎的宏量元素Ca、Mg和微量元素Fe、Cu的含量与盐全蝎无明显差异（P〉0．05）；酒全蝎的微量元素Zn、Pb、Mn的含量明显高于盐全蝎（P〈0．05）。结论：采用酒炙烘干进行全蝎加工在药物品质方面优于传统盐水煮烘，目酒炙后能除腥和引药上行，值得推广使用。     

东亚钳蝎毒素的研究及应用

东亚钳蝎ButhusmartensiiKarsch，（简称BmK）即问荆蝎，广泛分布于我国和东亚地区。用电刺激法将其含毒腺的尾末节剪下研磨萃取即可采得蝎毒。蝎毒包括一系列短链多肽（少于40个氨基酸残基）和长链多肽（60～70个氨基酸残基）。其中长链毒素按作用对象可分为三类：抗哺乳动物神经毒素、抗昆虫神经毒素和抗甲壳纲类动物神经毒素。国内对BmK毒素的研究始于80年代初，目前已取得一些进展。不同BmK毒素的功能有着显著差异，因而是研究结构与功能的理想药物；并且抗昆虫毒素有望成为新型生物杀虫剂。另外，蝎还是一种名贵中药，对一系列神经…     

东亚钳蝎毒素多肽对河豚毒素敏感型钠电流的作用

目的:蝎毒素是一种神经毒素,其对周围神经系统钠通道的作用尚不十分清楚,仍有许多疑题待研究.文中研究东亚钳蝎毒素多肽224(BmK224)对大鼠背根神经节(DRG)神经元电压依赖性河豚毒素敏感型钠电流(TTX-S INa)的影响.方法:分离单个DRG神经元,应用全细胞膜片钳技术观察BmK224对TTX-S INa的影响.结果:BmK224浓度依赖性地抑制TTX-S INa,40μg/ml BmK224使TTX-S INa稳态激活和失活曲线都向超极化方向移动,复活时间延长.可激活通道数增加. 结论:BmK224影响钠通道激活失活过程的作用机制可能是所含的α-蝎毒素使钠通道构象发生改变.     

Modulation of BmKAS-1 and BmK1-3-2 to sodium channel in rat dorsal root ganglion neurons

Objective To investigate what effects BmKAS-1 (a polypeptide purified from the Chinese sc orpion Buthus martensi Karsch ［BmK］ and named as BmK activator of skeletal -muscle ryanodine receptor) and its upstream mixture BmK1-3-2 have on Na(+) c hannels in dorsal root ganglion (DRG) small diameter neurons.Methods The whole-cell patch-clamp technique was used to investigate the effects of BmKAS-1 and BmK1-3-2 on Na(+) current in rat small diameter DRG neurons.Results About 50% peak Na(+) current was suppressed by 10 μg/ml of BmK1- 3-2. 1.62 μg/ml of BmKAS-1 also blocked 50% peak Na(+) cu rrent, and there was an obvious dose-dependent relationship.Conclusion Both BmK1-3-2 and BmKAS-1 have a blocking effect on Na(+) channels, and this may one of the mechanisms for the analgetic effect of BmK1-3-2 and BmKAS-1.     

Inhibitory effects of recombinant neurotoxin BmK IM on seizures induced by pentylenetetrazol in Rats

Askeyelementsofsignaltransmission ,voltage gatedsodiumchannelsplayacriticalrolebothinactionpotentialpropagationinexcitabletissuesandinneurotransmitterreleasefromnerveterminals Atthesametime ,thesechannelsarealsothetargetsofneurotoxinsfromvariousscorpionspecies Theeffectsofthesetoxinsonsodiumchannelsinvolvemodificationstochannelgatingandmembranepermeability 1,2Ithasbeendemonstratedthatmostscorpionneurotoxinsarelong chainproteinswith 60 -80aminoacids,cross linkedbyfourdisulfidebridges Generally …     

东亚钳蝎毒素多肽纯化组份BmK AS-1对大鼠背根神经节神经元河豚毒素不敏感型钠通道电流的作用

目的 研究国产东亚钳蝎（ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉ Ｋａｒｓｃｈ,ＢｍＫ）毒素多肽的纯化单体组分ＢｍＫ ＡＳ－１对大鼠奶神经节（ＤＲＧ）神经元河豚素不敏感（ＴＴＸ－Ｒ）钠电流的作用。方法 采用膜片箝全细胞记录方法,观察ＢｍＫ ＡＳ－１对单个ＤＲＧ细胞ＴＴＸ－Ｒ钠电流幅值的影响。结果 ＢｍＫ ＡＳ－１剂量依赖地抑制ＴＴＸ－Ｒ钠电流,且高剂量（１０μｇ／ｍｌ）ＢｍＫ ＡＳ－１几乎完全抑制ＴＴＸ－Ｒ     

东亚钳蝎毒素的镇痛作用与吗啡镇痛作用的比较

用辐射热甩尾反射测定大鼠痛阈的方法，观察并比较了东亚钳蝎毒素和吗啡的镇痛作用。结果表明：向侧脑室内注射２μＬ或肌肉注射０．０５μＬ、０．０１％蝎毒液的镇痛作用分别比相同给药途径、同浓度、同剂量吗啡的镇痛作用强，二者差异非常显著，Ｐ＜０．０ｌ。侧脑室内注射０．０３％蝎毒液２μＬ的镇痛作用比同浓度、同剂量吗啡的镇痛作用梢强，但无显著差异，Ｐ＞０．０５。蝎毒经肌肉注射后在较短的时间内即可使大鼠痛阈明显升高。证明蝎毒可通过血脑屏障进入中枢神经系统，产生镇痛作用。     

免疫抑制蝎毒活性肽Im169的重组表达和功能鉴定

目的:筛选鉴定新型蝎毒免疫活性肽。方法:从海南斑等蝎(Isometrus maculates)毒腺组织c DNA文库中筛选和分离蝎毒肽基因,通过GST融合蛋白表达纯化、肠激酶酶切和高压液相色谱(HPLC)分离的方法,获得色谱纯重组蝎毒活性肽,酶联免疫吸附(ELISA)实验检测细胞因子,鉴定免疫调节活性。结果:筛选得到一个新的蝎毒活性肽基因Im169,其编码的成熟肽由29个氨基酸组成,其中含有6个半胱氨酸。Im169多肽对T淋巴细胞IL-2、TNF-α和IFN-γ等细胞因子的分泌具有明显的抑制作用,且作用呈浓度依赖性(P<0.05)。序列分析显示:Im169多肽和蝎钾通道毒素的相似性最高,提示其是一个潜在的钾通道毒素多肽。功能机制分析显示:Im169多肽通过抑制T细胞表面的钾通道,从而发挥免疫抑制功能。结论:发现了一个新的蝎毒免疫调节肽,丰富了对蝎毒活性肽的功能认识,为自身免疫疾病的药物开发提供了新的多肽模板。     

蝎毒抗肿瘤有效成分SVⅡ-A4的提纯及抑瘤活性观察

目的：分离纯化东亚钳蝎原毒,提取活性多肽成分SVⅡ—A4,并观察其抑瘤活性。方法：（1）分离纯化,采用分子筛凝胶柱层析和离子交换柱层析分离纯化蝎毒;（2）纯度分析,用SDS—PAGE电泳和HPLC色谱法对SVⅡ—A4进行纯度分析;（3）活性观察,用MTF法（酶反应比色法）观察比较不同浓度（1、10、100mg／L）的蝎毒及其成分与SVⅡ-A4对4种肿瘤细胞（A549、HL-60、K562／S及K562／ADR）的抑制作用。结果：经过两步的分离纯化获得5个蝎毒多肽成分,其中的蝎毒抗肿瘤有效成分SVⅡ-A4对4种肿瘤细胞的抑制作用与阳性对照组相当。结论：经过优化提纯方法,两步即可从东亚钳蝎原毒中获得色谱纯度达96．73％的抑瘤活性单体成分SVⅡ-A4,初步观察,SVⅡ-A4对4种肿瘤细胞均显示出明显的抑制作用及一定的剂量-效应关系,而且它对布耐药细胞株（K562／ADR）的抑制作用较阳性对照组强有进一步开发利用的价值。     

融合蛋白DT389-hIL-13的克隆表达及其抗胶质瘤作用的初步研究

目的　构建白喉毒素N端 389个氨基酸 (DT389)与人白细胞介素 13(hIL 13)的融合蛋白DT389 hIL 13,并检测其生物学活性。方法　通过聚合酶链反应 (PCR)扩增得到hIL 13的cDNA ,将序列正确的hIL 13及DT389的cDNA片段串联插入表达载体pET30a ,构建表达质粒pET30a/DT389 hIL 13,并对表达产物进行鉴定及初步纯化。该融合蛋白加入培养的U2 51胶质细胞中 ,应用MTS方法检测其对多型性胶质母细胞瘤细胞的杀伤作用。结果　得到序列正确的融合蛋白DT389 hIL 13的表达质粒pET30a/DT389 hIL 13,该质粒在大肠杆菌成功表达 ,经初步纯化后 ,十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺 (SDS PAGE)凝胶电泳及Western印迹分析表明 ,该融合蛋白对白喉毒素多克隆抗体及hIL 13多克隆抗体都有很好的免疫反应性 ,相对分子质量约为 5 5 0 0 0 ;进一步活性检测发现 ,该融合蛋白对多型性胶质母细胞瘤细胞系U2 5 1的生长有较强的抑制作用 ,且作用存在剂量相关性 ,其半数抑制浓度(IC50 )约为 5× 10 -11mol/L。结论　成功构建了融合蛋白DT389 hIL 13的表达质粒 ,在细胞水平对表达产物进行了初步的活性检测 ,为进一步研制特异性的抗胶质瘤药物打下了基础。     

单克隆抗体在ELISA法检测B型肉毒毒素中的应用

于ELISA—双夹心法系统中采用B型肉毒毒素单克隆抗体作为包被抗体,可检出B型肉毒类毒素4—31ng/ml,与A型交叉最低浓度为4—8μg/ml,特异性比值为250—1,000;可检出B型肉毒毒素16ng/ml(4LD_(50)/ml) A型大于32μg/ml(大于301LD_(50)/ml),特异性比值大于2,000;检出污染食物标本中的B型肉毒毒素最低浓度为0.67—7.8LD_(50)/ml,与A型间未见交叉现象。其敏感度接近RPHA,特异性明显优于RPHA。     

东亚钳蝎毒BmK-9-(2)对豚鼠心室肌细胞钠通道的影响

目的 :观察东亚钳蝎毒 Bm K- 9- (2 )对豚鼠心室肌细胞钠通道的作用。方法 :采用全细胞膜片钳方法。结果 :Bm K- 9- (2 )使钠通道峰值电流增加 2 7%。峰值钠电导增加 1 7%。钠通道未失活成分增加 8%。 Bm K- 9- (2 )对心肌细胞钙通道没有明显影响。结论 :Bm K- 9- (2 )可激活钠通道并使钠通道失活过程延长