厌氧菌介导的肿瘤靶向自杀基因系统对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤作用研究

目的 构建婴儿双歧杆菌介导的胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)肿瘤基因治疗系统,探讨该系统对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外杀伤效应.方法 构建重组质粒pGEX-CD,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆菌,然后加入5-FC厌氧培养,24 h后取其上清液,作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,采用MTT法检测细胞存活率,并观察细胞形态学改变.结果 成功构建出婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统.与空白对照组和pGEX组相比,CD组肿瘤细胞发生了明显的形态学改变,细胞存活率明显降低.结论 婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的体外杀伤效应.     

厌氧菌介导的CD/5-FC系统对鼠黑色素瘤的杀伤效应

目的 构建婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统,探讨该系统对小鼠黑色素瘤细胞B16-F10的体外杀伤效应. 方法 构建重组质粒pGEX-CD,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选阳性克隆菌,然后加入5-FC厌氧培养,24h后取其上清,作用于小鼠黑色素瘤B16-F10细胞,采用MTT法检测细胞存活率,并观察细胞形态学改变. 结果 成功构建出婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC肿瘤基因治疗系统.与对照组和pGEX组相比,CD组的肿瘤细胞发生了明显的形态学改变,细胞存活率明显降低. 结论 婴儿双歧杆菌介导的CD/5-FC系统对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞具有明显的体外杀伤效应.     

婴儿双歧杆菌介导的CD／UPRT双自杀基因系统对黑色素瘤细胞的杀伤作用

目的探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因（UPRT）对胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因系统抗瘤作用的增强效应。方法构建重组质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法转化婴儿双歧杆菌,筛选出阳性克隆菌,加入5-FC厌氧条件下培养24h后取其上清,加到B16-F10细胞培养液中,采用MTT法检测细胞生存率,并观察细胞形态学改变。结果阳性克隆菌可正确表达UPRT基因。与对照组比较,CD组、UPRT组及CD／UPRT组细胞存活率均明显下降;与CD组及UPRT组比较,CD／UPRT组细胞存活率明显降低。且CD／UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,而CD组、UPRT组变化不如前者。结论婴儿双歧杆菌介导的UPRT基因可明显增强CD／5-FC系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用。     

携带重组胞嘧啶脱氨酶基因的婴儿双歧杆菌对鼠黑色素瘤B16-F10细胞的杀伤效应研究

目的将携带胞嘧啶脱氨酶(CD)基因的重组婴儿双歧杆菌应用于肿瘤的基因导向酶前药物疗法，利用厌氧菌趋低氧代谢的特性构建一种全新的肿瘤靶向基因治疗系统。方法PCR扩增CD目的基因、酶切后连接目的基因与质粒片段，电穿孔法将重组体转染婴儿双歧杆菌，筛选阳性克隆抽提质粒，酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定，并体外检测CD基因的表达。结果携带自杀基因CD的重组载体成功地被转染进婴儿双歧杆菌，并能表达CD酶活性，当加入CD酶底物5-FC后，显示出对小鼠黑色素瘤B16-F10细胞明显的杀伤效应。结论成功构建了携带自杀基因CD的重组婴儿双歧杆菌，重组菌在体外显示出对B16-F10肿瘤细胞有明显的抑制效应。     

婴儿双歧杆菌介导的CD和UPRT联合5-FC基因疗法对黑色素瘤的体外治疗实验研究

目的 采用婴儿双歧杆菌为载体,探讨尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因(UPRT)对胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)自杀基因系统抗瘤作用的增强效应.方法 构建原核表达质粒pGEX-UPRT,以电穿孔法将该质粒转化入婴儿双歧杆菌,筛选阳性重组菌并鉴定.采用MTT法检测表达的UPRT是否可以与CD产生抗瘤协同作用,并观察细胞形态学改变.结论 重组婴儿双歧杆菌可以正确表达UPRT.体外MTT检测显示CD UPRT组细胞存活率低于对照组(P＜0.01),且可使B16-F10鼠黑色素瘤细胞对5-FC的杀伤敏感性(IC50＝0.015 μmol/mL)提高,是CD组(IC50＝0.127 μmol/mL)的8.5倍.形态学观察CD UPRT组肿瘤细胞显示出明显的损伤性改变,细胞生长受到明显抑制,而UPRT组和CD组变化明显不如前者.结论 婴儿双歧杆菌联合转导UPRT基因可明显增强CD/5-FC自杀基因系统对鼠黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用.     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体，PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型，观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后，肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00），腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04），优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌，融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用，其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

CD/5-FC系统抗肿瘤的作用

胞嘧啶脱氨基酶(cytosine deaminase，CD)／5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine，5-FC)系统是基因介导的酶前药疗法(gene-directed enzyme prodrug therapy，GDEPT)之一，具有选择性和特异性杀伤肿瘤细胞的作用，近年来国内外研究活跃，细胞实验及动物模型研究表明，该系统对全身各系统器官的肿瘤具有不同的作用．     

Survivin启动子介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因的抗肿瘤研究

目的 探讨Survivin启动子介导的CD/5-FC自杀系统的抗肿瘤效果.方法 利用Survivin启动子替换pEGFP-N1载体上的巨细胞病毒(CMV)启动子,构建重组表达载体pSurP-EGFP,通过报告基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达确定Survivin启动子的特异性;将酿酒酵母的胞嘧啶脱氨酶(CD)基因克隆在pSurP-EGFP中,构建成重组载体pSurP-CD,转染肿瘤细胞后利用毛细管电泳仪检测前药5-氟胞嘧啶(5-FC)的转化效率,同时分析肿瘤细胞的凋亡.结果 GFP的表达表明Survivin启动子具有较好的肿瘤靶向性;毛细管电泳检测表明CD能够有效地将5-FC转化为5-FU,显微镜观察和流式分析表明了Survivin启动子介导的CD的抗肿瘤效果.结论 Survivin启动子能有效地介导CD自杀基因的表达,具有较好的靶向性抗肿瘤效果.     

融合自杀基因抑骨肉瘤生长的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶／胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因（HSV-TK／CD）对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法将含TK／CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MC-63细胞,测定感染效率后分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒作用于瘤细胞,测定细胞A值计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342染色法分析其杀伤机制;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后将其分为6组（每组8只）：PBS对照组（A组）;重组腺病毒（Ad）-Lac-Z／GCV＋5-FC组（B组）;Ad-TK／GCV组（C组）;Ad-CD／5-FC组（D组）;Ad-TK／GCV＋Ad-CD／5-FC组（E组）;Ad-TK-CD／GCV＋5-FC组（F组）。各组经治疗后观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG-63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因作用和双基因相加的作用,且有显著性差异（P〈0．05）;杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。裸鼠实验中,B组与A组比较,肿瘤体积与肿瘤坏死程度无明显差异（P〉0．05）;与A、B组相比较,C～F组肿瘤的生长均受到明显抑制（P〈0．05）,且E、F组与C、D比较有显著性差异（P〈0．05）。结论融合自杀基因HSV-TK／CD对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长均有明显的抑制作用。     

恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD/5-FC自杀基因治疗系统的建立

目的 建立针对恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的胞嘧啶脱氨酶／5-氟胞嘧啶（CD／5-FC）自杀基因治疗系统。方法 以大肠杆菌大量扩增制备含有胞嘧啶脱氨酶（CD）基因的pCMVCD质粒并经酶切电泳鉴定。DNA序列测定证实pCMVCD质粒是否含有所需要之CD目的基因。用Lipofectamine2000脂质体介导法将pCMVCD质粒转染进入SHG-44恶性人脑胶质瘤细胞．经G418筛选获得抗性克隆（定名为SHG-44／CD细胞）。结果 pCMVCD质粒经测序证实含有CD目的基因。脂质体介导pCMVCD质粒成功转染了SHG-44细胞。结论 建立了作用于恶性人脑胶质瘤细胞株SHG-44的CD／5-FC自杀基因治疗系统，为后续实验研究打下了基础。     

Gene therapy for melanoma by bifidobacterium infantis-mediated transfer of CD and UPRT genes with 5-FC in vitro]

OBJECTIVE: This study was conducted by using Bifidobacterium Infantis as a delivery system to transport suicide gene CD and UPRT to tumors in an attempt to assess the UPRT-enhanced antitumor effect of CD/5-FC. METHODS: The recombinant plasmid pGEX-UPRT was constructed and transfered into Bifidobacterium Infantis by electroporation and then identified. The synergistic antitumor effect of coexpression CD and UPRT was determined by MTT method. And the morphologic changes of B16-F10 cells were observed. RESULTS: Recombinant Bifidobacterium Infantis could express UPRT correctly. The suvival rate of cells administrated CD+ UPRT and 5-FC was significantly lower than that of control (P<0.01), and the 5-FC sensitivity (IC50 = 0.015 micromol/mL) exhibited a 8. 5-fold increase when compared with that of cells administrated CD alone (IC50 = 0.127 micromol/mL). The cells treated with CD+UPRT were remarkably damaged morphologically, and the growth of cells was significantly inhibited as compared with that of other groups. CONCLUSION: Recombinant Bifidobacterium Infantis with UPRT gene can significantly enhance the killing effect of CD/5-FC suicide gene system on melanoma B16-F10 cells of mice.     

脂质体介导的CD/5-FC自杀基因体系协同干扰素体内抑瘤及旁观者效应的观察

OBJECTIVE: To study the antitumor and distant bystander effects of cationic liposome-mediated cytosine deaminase (CD)/5-fluorocytosine (5-FC) suicide gene system combined with interferon-gamma (IFN-gamma) in vivo. METHODS: Murine hepatoma 22 (H22) cells transfected by CD gene were inoculated subcutaneous in Kunming mice in the left axillary region, and the H22 cells without CD gene transfection were inoculated in the right axillary region. The mice were randomly divided into 4 groups and treated with normal saline , 5-FC, IFN-gamma, and 5-FC+ IFN-gamma on a daily basis. The tumor inhibition and distant bystander effects were observed in the mice. RESULTS: Exposure of CD gene-transfected tumor to 5-Fc resulted in obvious tumor growth inhibition with an inhibition rate of 78.38%, which was significantly increased to 93.21% (P<0.01) with 5-Fc +IFN-gamma treatment. A notable distant bystander effect in the CD/5-FC suicide gene system was observed in vivo, with a tumor inhibition rate of was 54.42%; when combined with IFN-gamma, the inhibition rate increased significantly to 87.57% (P<0.05). CONCLUSION: When combined with IFN-gamma, CD/5-FC suicide system has stronger anti-tumor and distant bystander effects. CD/5-FC suicide gene system combined with IFN-gamma may provide a potential therapy for malignant tumors.     

CD/5-FC自杀基因治疗系统体外杀伤恶性人脑胶质瘤细胞作用的研究

目的：探讨胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶（CD/5-FC）自杀基因治疗系统对恶性人脑胶质瘤细胞的杀伤作用。方法：采用Lipofectamine2000脂质体介导法将CD基因转染U251恶性人脑胶质瘤细胞，G418筛选获得抗性克隆（取名为U251/CD细胞），使用不同浓度的5-FC作用于U251/CD细胞，MTT法测定活性细胞比率。采用高效液相色谱法（HPLC）检测5-FC培养液内5-FU的浓度。结果：U251细胞获得了质粒的成功转染。基因转染使G418抗性细胞（U251/CD细胞）对5-FC高度敏感。未转染的U251细胞对5-FC不敏感，IC50 约为6 500 μmol/L，而转染基因后 IC50 约为10 μmol/L。并且加入不同浓度的5-FC后，U251/CD细胞培养液内均能检测到5-FU。结论：5-FC对CD基因修饰U251细胞具有杀伤作用；为胶质瘤基因治疗的在体研究提供依据。     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的 探讨VEGF启动子驱动的CD／TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFp-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用。方法 分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞，给予前药5-FC、GCV，测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应。结果 与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比，Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用，并可见较明显的旁观者效应：而与CMV启动子的双自杀基因相比，其作用无显著性差异。结论 VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用，其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统似。     

VEGF启动子介导双自杀基因重组腺病毒对LoVo细胞的体外杀伤作用

目的探讨VEGF启动子驱动的CD/TK双自杀基因重组腺病毒(Ad-VEGFp-CDglyTK)对大肠癌LoVo细胞的体外杀伤作用。方法分别用重组腺病毒Ad-VEGFp-CDglyTK、Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK、Ad-CMV-CDglyTK转染大肠癌LoVo细胞,给予前药5-FC、GCV,测定LoVo细胞的集落形成、细胞存活率及该治疗系统的旁观者效应。结果与Ad-CMV-CD、Ad-CMV-TK相比,Ad-VEGFp-CDglyTK系统对LoVo细胞的集落形成、细胞生长均具有更强抑制作用,并可见较明显的旁观者效应。而与CMV启动子的双自杀基因相比,其作用无显著性差异。结论VEGF启动子驱动的双自杀基因治疗系统对大肠癌LoVo细胞有确切的杀伤作用,其作用强度与强启动子CMV驱动的双自杀基因治疗系统相似。     

大肠癌细胞的双自杀基因治疗

目的探讨腺病毒介导的双自杀基因对大肠癌细胞的杀伤作用及其放射增敏作用。方法用重组的腺病毒载体感染大肠癌细胞株SW480,用RT-PCR方法检测CD(cytosine deaminase)-TK(thymidine kinase)融合基因的表达,单独或联合给予前体药物GCV和5-FC后,用MTT法测定双自杀基因对大肠癌细胞的体外杀伤效应,用克隆形成实验分析感染有自杀基因的大肠癌细胞的放射增敏作用。结果感染有自杀基因的大肠癌细胞,在给予前体药物后,细胞的存活率明显下降,联合给予GCV和5-FC细胞的存活率较单独给GCV或5-FC存活率明显降低(χ2=30.371,P<0.01);联合使用5-FC和GCV时,CD-TK自杀基因的旁观者效应最明显(P<0.01);使用GCV和(或)5-FC能增加感染有自杀基因的大肠癌细胞对照射的敏感性,在联合使用前体药物时更为明显(P<0.01)。结论CD-TK双自杀基因体系对大肠癌细胞具有显著的杀伤作用和放射增敏作用,证明双自杀基因系统具有临床应用价值。     

CD-TK融合自杀基因对前列腺癌细胞的杀伤作用

目的：探讨CD-TK融合自杀基因体系对前列腺癌PC-3m细胞的杀伤作用。方法：应用逆转录病毒载体将CD-TK融合基因转染PC-3m细胞，经RT-PCR鉴定后，用MTT法检测丙氧鸟苷(GCV)、5-胞嘧啶(5-FC)前体药物单一或联合应用对转染PC-3m细胞的杀伤作用，以未转染PC-3m细胞为对照。同时应用流式细胞仪、电镜等检测药物作用前后的变化。结果：GCV对转染PC-3m细胞有较强的直接细胞毒作用，而5-FC治疗有显著旁观者效应；联合用药具有协同作用。结论：CD-TK融合基因治疗对前列腺癌细胞具有显著杀伤作用，明显优于单一自杀基因治疗，深入研究意义较大。     

转基因厌氧菌对鼠黑色素瘤的靶向性研究

目的探讨转基因婴儿双歧杆菌对小鼠黑色素瘤的靶向性。方法经小鼠尾静脉注射转基因婴儿双歧杆菌,通过放射性体内参入示踪分析、组织厌氧培养及组织切片方法,观察转基因厌氧菌对黑色素瘤组织的靶向性。结果肿瘤组织的放射性强度逐渐增强,而正常组织放射性强度逐渐减弱;组织厌氧培养可见转基因厌氧菌在瘤组织内集聚增殖,组织切片可见瘤组织中有大量的革兰氏染色阳性的条杆状蓝色深染区域,而正常组织则无。结论婴儿双歧杆菌对小鼠黑色素瘤组织具有良好的靶向性,可将携带的基因靶向转运至实体瘤局部。