可分解草酸小鼠肠干细胞群的构建

目的 通过提取草酸分解菌的分解草酸功能基因frc和oxc,转染小鼠肠干细胞群使之获得草酸分解功能.方法 (1)构建能同时表达oxc和frc基因的双表达载体质粒pIRES-oxc-frc.(2)分离培养小鼠肠干细胞群,并了解其生长分化功能.(3)将pIRES-oxc-frc通过脂质体转染至小鼠肠干细胞群中,经过G418筛选后,了解验证转基因肠干细胞群生长、分化及基因表达状况.(4)用离子色谱法测定转基因后细胞培养液中草酸浓度,鉴定其草酸分解功能.结果 oxc和frc基因片段与GenBank提供的序列比较有极高的同源性.带有oxc和fre基因片段的重组质粒能顺利转染小鼠肠干细胞群,并能在后者中表达.转基因小鼠肠十细胞群培养液中草酸浓度[(2.48±0.03)g/L]低于普通小鼠肠干细胞群和空白对照组[(2.69±0.01)、(2.69±0.01)g/L,P<0.01].结论 产甲酸草酸杆菌分解草酸的重要功能基因oxc和frc基因能在体外转入小鼠肠十细胞群,并使后者具有草酸分解功能;原核细胞的多个基因能在一定条件下通过基因工程技术转入真核细胞.     

小鼠神经干细胞的分离培养

目的 探讨小鼠神经干细胞的体外分离培养方法。方法 采用贴壁培养法,从成体小鼠大脑皮层分离并体外培养成体小鼠大脑皮层细胞,制成细胞悬液后将其置入DMEN/F12(1:1)液(包括15％FCS,bFGF20ng/ml,青霉素100u/ml和链霉素100u/ml)培养,获得细胞克隆。应用免疫组织化学技术检测克隆细胞巢蛋白(Nestin)的表达。结果原代及传代培养的细胞均可持续分裂增殖形成细胞克隆;克隆细胞表达巢蛋白(Nestin)。结论 分离的细胞在体外具有很强的增殖能力和自我更新能力,表达Nestin的为中枢神经系统的干细胞。     

小鼠胚胎干细胞培养条件的探索

目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的培养特点及生物学特性,为ES细胞的应用研究奠定基础.方法: 小鼠胚胎成纤维细胞原代培养,3～5代的细胞作为饲养层细胞培养ES细胞.另在无饲养层细胞、明胶包被培养皿、培养液中含白血病抑制因子条件下培养小鼠ES细胞,观察2种情况下ES细胞的生长情况.结果: 小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,ES细胞在2种条件下均能呈克隆状生长,且保持未分化状态,碱性磷酸酶(AKP)染色呈阳性.结论: 2种条件下ES细胞均能良好生长.     

肠辐射损伤模型鼠的间充质干细胞移植研究

目的:探讨脐带间充质干细胞(MSC)治疗急性肠型放射病的实验理论依据。方法:体外分离培养人脐带间充质干细胞,移植入肠辐射损伤模型鼠,对肠道放射损伤模型鼠移植CM-DiI荧光标记后的人间充质干细胞,利用人β2-微球蛋白PCR技术及激光共聚焦显微镜观察供体细胞在模型鼠肠道粘膜及组织中的定位,DAI评分和体重变化评价小鼠一般状态,组化染色观察肠道粘膜的病理变化。结果:模型鼠的一般状况在移植MSC 5周明显改善,组织病理学观察也明显好转,组织PCR结果显示MSC除定向分布到辐射损伤部位小肠,在骨髓、肝脏、肺脏、脾脏也有一定的分布。结论:脐带间充质干细胞移植有助于肠辐射损伤模型鼠的恢复,有望用于人急性肠型放射病的治疗。     

基于肠干细胞治疗脓毒症肠屏障功能障碍的研究进展

脓毒症是急危重症领域的常见病和多发病,肠屏障功能障碍(intestine barrier functional disturbance,IBFD)是脓毒症患者最常见且严重的并发症,脓毒症相关IBFD主要是由肠上皮细胞损伤及肠道缺血、血流灌注不足引起的。肠干细胞(intestinal stem cell,ISCs)是一种未分化的细胞,是体内平衡损伤后新上皮细胞的来源,因其具有增殖、再生、转化为分化细胞和修复受损组织的能力,对于治疗IBFD具有重要意义。本文聚焦于在治疗脓毒症相关IBFD中扮演重要角色的ISCs,旨在挖掘基于ISCs治疗脓毒症相关IBFD的方法及机制,探究现阶段治疗措施,希望对未来脓毒症患者的研究和治疗提供新思路。     

体外培养的神经干细胞的端粒和端粒酶活性

目的了解体外培养的神经干细胞端粒酶活性，观察培养不同时间神经干细胞的端粒酶活性、端粒长度的情况。方法采用无血清培养法从新生大鼠脑皮质分离培养神经干细胞，通过免疫荧光细胞染色鉴定神经干细胞；TRAP-ELISA法测定培养4～12周的神经干细胞的端粒酶活性；Southern-blot法测定培养第1代、第10代时神经干细胞的端粒长度。结果从新生大鼠脑皮质分离培养的神经干细胞具有端粒酶活性；体外培养12周内神经干细胞的端粒酶活性未见变化；神经干细胞具有较长的端粒（23．8～24．3kb），且不随细胞传代而变化。结论大鼠脑神经干细胞具有端粒酶活性，在体外培养过程中，未见活性变化并能维持端粒的长度。     

小鼠支气管肺泡干细胞的分离、鉴定与三维培养体系的构建

目的探讨C57BL6小鼠支气管肺泡干细胞（BASCSs）体外分离、鉴定及其三维培养体系的构建方法,为进一步研究BASCSs的相关特性奠定实验基础。方法选用C57BL6成年雄鼠,完整分离肺组织,1×PBS灌洗后,经支气管分次灌注Elastase酶进行消化,以锐器切碎肺组织,加入DNA酶使细胞更好地分散开。用75 μm细胞筛去除未消化的组织块,所得细胞悬液以荧光标记的CD31、CD34、CD45、SCA-1、EpCAM抗体染色,流式细胞仪分选CD31-CD34-CD45-SCA-1+EpCAM+细胞,细胞与Mlg2908细胞（小鼠肺成纤维细胞株）按（1×103）:（1×106）的比例混合,以Matrigel为基质构建三维培养体系。结果通过Elastase酶消化肺组织,每只成年小鼠可得到有核细胞总数（1.6~1.8）×107个,流式细胞技术结果显示,CD34- CD45- SCA-1+ EpCAM+细胞约占EpCAM+细胞的22%;将支气管肺泡干细胞、Mlg2908细胞和Matrigel混合培养,4d后可见克隆形成。随着培养时间延长,克隆数量逐渐减少。8d后大部分克隆直径达50 μm,形态出现分化,克隆可维持至15d。结论建立了一种简单、高效的分离、鉴定及三维培养小鼠BASCSs的方法。     

躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维组织相容性的研究

目的 探讨体外培养的躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维的相容性.方法 采用神经管植块法培养躯干神经嵴干细胞,并行免疫荧光细胞化学双重染色鉴定,将培养48h的躯干神经嵴干细胞接种在壳聚糖纤维材料上,观察两者的组织相容性.结果 采用神经管植块法培养的神经嵴干细胞,免疫细胞化学染色呈现neatin及P75双阳性,将其接种在壳聚糖纤维支架材料上,可见神经嵴干细胞贴附于壳聚糖纤维上生长;S-100免疫细胞化学染色显示,S-100阳性细胞突起的末端呈扁平状膨大;扫描电镜显示,壳聚糖纤维上的躯干神经嵴干细胞为梭形,呈现"端对端"、"肩并肩"排列,伸出爪形伪足贴附于壳聚糖纤维上.结论 躯干神经嵴干细胞与壳聚糖纤维有良好的组织相容性,并可分化为Schwann细胞.     

肺癌干细胞研究进展

肺癌是当前危害人类生命和健康最严重的恶性肿瘤.据报道,经手术、放化疗等治疗后5年存活率不足15%.随着环境污染的日益加重,1950年代后发病率迅速上升,目前在男性恶性肿瘤中占第一位,女性的发病率也在不断增长,占恶性肿瘤的第二位.肿瘤干细胞（tumorstem cell,TSC）是当前研究的热点,人们希望从肺癌干细胞的角度找到根治肺癌的途径,近年来对肺癌干细胞的研究已经取得了很大进展,笔者就肺癌干细胞的分离、鉴定方法等最新研究进展综述如下.     

人骨髓间充质干细胞的分离及鉴定

［摘 要］ 目的：建立分离并鉴定人骨髓间充质干细胞（HMSC）的方法。 方法：联合应用Percoll（1.073 g•L^-1）密度梯度离心和贴壁筛选的方法分离HMSC进行体外培养,利用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段对体外培养的HMSC进行鉴定。 结果：HMSC具有独特的表型特征,即CD29、CD44阳性和CD34、CD45阴性。细胞糖原反应（PAS）阳性、苏丹黑反应（SB）阴性。电镜观察结果提示细胞较幼稚。 结论：利用密度梯度离心和贴壁筛选的方法可以分离HMSC,联合应用免疫细胞化学、细胞化学和电镜等技术手段鉴定HMSC的方法有效。     

三种不同型别小鼠骨髓来源间质干细胞的生物学特性分析

【目的】间质干细胞(MSC)是一种间质来源的多潜能基质细胞,目前人和多种动物来源的MSC均已被成功分离鉴定。然而由于小鼠骨髓MSC的分离相对人和其他物种更为困难,关于小鼠骨髓MSC的克隆分析结果也相对有限且结果不尽一致。为此,本研究拟进一步探讨小鼠MSC的体外分离方法,并对MSC克隆形成单位进行生物学特性分析。【方法】 取C57BL/6小鼠,冲洗股骨骨髓腔获得骨髓单个核细胞悬液,低密度接种培养,并通过有限稀释克隆挑选获得三种形态、生长特点不同的克隆形成单位(CFU)。采用流式分析技术对三种类型的CFU进行表型分析,并用油红O和茜素红分别进行成脂和成骨分化诱导鉴定。【结果】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术成功获得C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞,并观察到偏圆形(MSC1)、长梭形(MSC2)以及纺锤形、多边形(MSC3)三种贴壁形态细胞类型;免疫表型分析显示,三种细胞均强表达Sca-1,不表达CD11b、CD45,部分表达CD90.2;体外诱导分化实验证实,MSC1仅具有向脂肪细胞分化的潜能,MSC2仅具有向成骨细胞分化的潜能;MSC3则具有成骨、成脂双向分化能力。【结论】 低密度培养并结合克隆化培养分离技术可成功分离小鼠骨髓间充质干细胞;小鼠MSCs是一种高度异质性的细胞群,其中可能含有多能MSC或单一分化方向的前体细胞等处于不同分化阶段的细胞类型。     

免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

目的：探讨用免疫磁珠分离法（magnetic activated cell sorting,MACS）从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法：收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为（41.56±18.77）%,MACS分选CD117细胞纯度（88.68±4.74）%,纯化前后有明显差异（P〈0.05）。结论：MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。     

小鼠胚胎干细胞制备嵌合体的方法——聚合法初探

目的利用胚胎干细胞株E14．1及新建立的C57BL／6J小鼠胚胎干细胞，采用聚合法进行嵌合体的构建。方法以E14．1及C57BL／6J干细胞为供体细胞，分为由5-10、10-15、15-20、20-25个单细胞组成的干细胞团。分别与C57BL／6J及ICR的8-16细胞期胚胎细胞聚合共培养24h再进行胚胎移植。结果E14．1与C57BL／6J胚胎的聚合及C57BL／6J与ICR胚胎的聚合均以10-15个单细胞组成的干细胞团产生的嵌合体效果最好，分别得到嵌合体小鼠11只和5只，嵌合率分别为27．50％和16．13％。结论使用聚合法成功构建嵌合体，为嵌合体的制备提供了一种简单易行的方法。     

人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

[目的]探索体外定向诱导胚胎干细胞(ES细胞)分化为表皮样干细胞的条件,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础.[方法]将小鼠胚胎干细胞单独(对照组)或与人羊膜共培养4～5 d,观察其形态分化,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化.[结果]与人羊膜共培养4～5 d后,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞,细胞排列紧密,呈多边形,免疫组织化学染色后,多数细胞呈现β1整合素阳性,对照组大量细胞死亡,未见β1整合素阳性细胞;流式细胞仪检测结果显示实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为81.4%和8.4%,两者比较差异显著,Z检验P<0.01.[结论]人羊膜组织可在体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞.     

肿瘤干细胞与结直肠癌肿瘤干细胞

肿瘤干细胞是一类未分化的原始肿瘤细胞,具有三大显著的生物学特性即自我更新的能力、无限增殖的能力及多分化潜能性。它是肿瘤不停生长的罪魁祸首。分离、鉴定包括结直肠癌在内的各种肿瘤干细胞以及寻求针对肿瘤干细胞的治疗措施将是肿瘤研究的新方向。     

肿瘤干细胞与肝癌关系的相关研究进展

肿瘤干细胞学说对肿瘤起源的传统理论提出了质疑,并已获得较多的证据支持,正逐渐被人们所接受。肿瘤干细胞学说为恶性肿瘤的基础研究及临床治疗指明了一个新的方向。原发性肝癌在我国的发病率较高,且呈上升趋势。近年来研究发现,肝癌细胞中存在着一群具有特异性的肿瘤细胞,称为肝癌干细胞,其发现促使人们对原有的关于肝癌形成、发展及治疗理论进行重新审视。该文试从干细胞的概念、肿瘤干细胞学说的形成及其生物学特性、肝癌干细胞的来源及表面标志物的研究进展等方面作一综述。     

成神经细胞分化的骨髓间充质干细胞向干细胞因子的趋化性迁移

目的研究成神经细胞分化不同阶段的骨髓间充质干细胞（BMSCs）向干细胞因子（SCF）的趋化性迁移。方法 Percoll密度梯度离心法分离培养SD大鼠BMSCs,体外传代并扩增纯化,通过免疫荧光染色及多向分化对其进行鉴定。采用碱性成纤维生长因子（bFGF）、丁羟基茴香醚（BHA）联合诱导剂对BMSCs进行成神经细胞诱导,观察分化各时期的细胞形态变化。利用Dunn chamber研究SCF对不同分化阶段BMSCs趋化性迁移的影响。结果 Dunn chamber迁移实验显示,SCF诱导实验组细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组（P〈0.05）,表明SCF对BMSCs具有趋化作用。此外,分化不同状态的BMSCs向SCF的趋化迁移程度也不同。结论 BMSCs可以分化为神经样细胞,其对SCF的趋化性迁移与分化状态密切相关。     

褪黑激素对新生大鼠神经干细胞向神经元样细胞分化的影响

【目的】探讨褪黑激素对体外培养新生大鼠神经干细胞分化的影响。【方法】从新生SD大鼠室管膜下区分离依赖碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)和表皮细胞生长因子 (EGF)生存的神经干细胞进行培养 ,原代及子代细胞鉴定后用于实验。实验细胞均在无生长因子而含 10mL/L胎牛血清条件下培养 ,经褪黑激素或Luzindole作用 1周后做免疫组织化学染色 ,比较Map2阳性细胞出现率。【结果】①依赖bFGF和EGF生长的神经干细胞体外呈集落样生长 ,表达抗原蛋白巢蛋白(Nestin) ,无生长因子培养基中可分化形成胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)、S10 0蛋白、微管相关蛋白 (Map2 )阳性细胞。②褪黑激素能够提高Map2阳性细胞生成率 (2 3 4 5 % ,2 1 82 % ) (P <0 0 1)。③褪黑激素膜受体竞争性阻断剂Luzindole可阻断高浓度 (10 0 μmol/L)褪黑激素促神经干细胞分化作用 ,但不能抑制低浓度褪黑激素 (10nmol/L)的作用。【结论】褪黑激素能促进神经干细胞向神经元样细胞分化 ,不同浓度褪黑激素可能存在不同的作用机制。     

间充质干细胞通过旁分泌效应激活心脏干细胞迁移(英文)

目的:探索移植到心梗部位的间充质干细胞是否通过其旁分泌效应促进心脏干细胞迁移至心梗部位。方法:间充质干细胞(MSC)特征经流式细胞术鉴定其表面标志物特征及多向诱导分化实验确认其干性。经体外Transwell分析心脏干细胞迁移特征,利用VEGF,HGF及SDF-1α等受体特异阻断剂观察其在心脏干细胞迁移中的作用。在体利用左冠状动脉前降之结扎法复制心肌梗死模型。心梗后7 d,植入MSC到心梗及周边部位。细胞移植7 d后,流式细胞术分析其外周血中c-kit阳性的干细胞含量,免疫荧光组织化学技术分析心梗部位c-kit阳性的干细胞数目,同时行Western Blot分析心脏VEGF,HGF及SDF-1α的表达,一月后心导管技术测量心功能及胶原染色和HE染色确定梗死面积。结果:移植的MSC增加了心梗部位VEGF,HGF及SDF-1α的表达,并动员c-kit阳性的干细胞迁移至心梗部位。与对照组相比,MSC移植组明显降低了心梗面积,显著增加了血管密度,明显改善了左室心脏功能。体外迁移实验发现MSC条件培养基能够诱导心脏干细胞迁移,这个过程能被VEGFR、CXCR4及c-Met等受体特异阻断剂所阻断,且c-Met可能起主要作用。结论:移植的MSC通过其旁分泌效应激活c-kit阳性的干细胞迁移至心梗部位修复受损的心脏。