利用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠

目的应用CRISPR/Cas9技术构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。方法针对miRNA-29b1基因设计一段sgRNA,sgRNA和Cas9体外转录后显微注射至C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行测序以鉴定基因型,同时取小鼠心、肝、脾、肺、肾等脏器研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miRNA-29b1在这些脏器中的表达。结果设计了20 bp的miRNA-29b1sgRNA并与Cas9一起进行了体外转录,显微注射小鼠受精卵细胞后获得miRNA-29b1基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有两种基因型,一种为10 bp的缺失突变;另一种为22 bp的缺失突变,同时伴有3 bp的插入突变。与野生型小鼠相比,基因突变小鼠心、肝、脾、肺、肾等组织中miRNA-29b1表达量下降明显。结论应用CRISPR/Cas9技术成功构建miRNA-29b1基因敲除小鼠。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

利用CRISPR/Cas9技术构建Bpi基因敲除小鼠

目的利用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建Bpi基因敲除的小鼠模型,并继续繁殖、鉴定及建立稳定遗传的Bpi基因敲除小鼠品系。方法针对C57BL/6小鼠Bpi基因的第2～3外显子两端设计敲除靶点,筛选高活性gRNA(guide RNA)靶点,体外转录得到sgRNA(small guide RNA)并与Cas9 mRNA一起显微注射到C57BL/6小鼠的受精卵内,经胚胎移植至代孕母鼠体内,获得F0代小鼠后,通过基因型鉴定和DNA测序获得基因突变的阳性子代鼠。结果筛选到高活性gRNA靶点并成功获得体外转录产物sgRNA;与Cas9 mRNA一起通过显微注射的方式获得了64枚状态良好的受精卵并成功移植到2只代孕母鼠体内;获得了22只F0代小鼠,经PCR鉴定和DNA测序后选择一只单链缺失708 bp碱基的阳性小鼠进行扩繁,并在F1、F2代检测到该突变,且F2代成功繁育出纯合子小鼠。结论成功构建Bpi基因敲除小鼠模型,为进一步研究Bpi基因及其表达产物的生物学功能奠定了基础。     

利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠

目的利用双重sgRNAs构建miR-223全基因敲除小鼠。方法针对miR-223基因设计双重sgRNAs,将体外转录的sgRNAs和Cas9 mRNA共同显微注射入C57BL/6小鼠受精卵细胞。小鼠出生后取其基因组DNA进行PCR扩增和测序以鉴定基因型,同时取小鼠肝脏研磨后提取总RNA,通过real-time PCR分析miR-223在肝脏中的表达。结果设计了miR-223基因双重sgRNAs并对其进行了体外转录,纯化后显微注射小鼠受精卵细胞获得miR-223基因突变小鼠。测序结果表明突变小鼠有3种基因型,一种为6 bp的缺失突变,但未对miR-223序列产生影响;另外两种为162 bp和168 bp的缺失突变,完全删除miR-223前体和成熟区序列。与野生型相比,这两种小鼠肝组织中几乎不能检测到miR-223的表达。结论设计双重sgRNAs并应用CRISPR/Cas9技术成功构建miR-223全基因敲除小鼠。     

利用CRISPR/Cas9敲除大鼠胰岛素受体底物1（Irs1）基因

目的为研究胰岛素受体底物1(Irs1)基因与代谢病之间的关系,我们利用CRISPR/Cas9系统敲除大鼠Irs1基因,为研究代谢病提供基因敲除大鼠。方法针对Irs1第一外显子,设计CRISPR/Cas9作用靶点,构建sgRNA表达质粒。利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9。将Cas9 mRNA和sgRNA混合物注射入SD大鼠的受精卵中,实现靶基因敲除。用T7EN1实验初步检测靶基因的修饰情况,再经过测序分析确定突变。结果获得了5个在Irs1基因突变的首建鼠,突变效率为83%。结论得到了稳定遗传的Irs1基因敲除大鼠。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠的实验研究

目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10bp和11bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

应用CRISPR/Cas9技术制备Vasohibin-2基因敲除小鼠模型及验证

目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具?     

应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA-301a敲除小鼠

目的 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立miRNA敲除小鼠模型.方法 根据miRNA基因序列,设计针对miR-301a的gRNA引物序列(双靶点),PCR扩增获得针对miR-301a的体外转录模板DNA和构建Cas9体外转录模板,然后进行Cas9和gRNA体外转录.利用体外转录的gRNA/Cas9 mRNA对小鼠受精卵显微注射,并利用T7E1酶切和基因测序对miR-301a突变进行检测和鉴定.结果 PCR扩增、凝胶电泳和基因测序鉴定证实,获得序列正确的用于体外转录的模板DNA;体外转录获得gRNA/Cas9 mRNA,顺利完成对小鼠受精卵的显微注射;利用T7E1酶切对miR-301a突变进行检测,发现8只新生小鼠中有7只(87.5％)被鉴定在miR-301a位点携带突变;基因测序结果显示,各小鼠均有不同程度的碱基插入或缺失突变,其中缺失碱基数目最多的4号小鼠产生31个碱基缺失.结论 成功建立miR-301a基因高效敲除小鼠模型.     

利用CRISPR/Csa9技术构建溶酶体运输调节因子基因缺陷C57BL/6小鼠

目的获得自然杀伤(NK)细胞缺陷的小鼠动物模型,并研究溶酶体运输调节因子(Lyst)基因的功能。方法采用CRISPR/Cas9技术敲除C57BL/6小鼠的Lyst基因:针对小鼠Lyst基因编码区第50个外显子,设计CRISPR/Cas9靶点引物(sgRNA),并重组构建pUC57-Lyst-sg RNA载体。将重组质粒体与Cas9质粒分别利用T7 RNA聚合酶体外转录为mRNA,并按比例显微注射入小鼠受精卵,将受精卵移植到受体动物。获得子代小鼠后,利用PCR扩增和测序方法筛选Lyst基因发生改变的动物个体。结果显微注射移植后获得7只F0代基因敲除小鼠,且毛色均发生了明显的变化。结论利用CRISPR/Cas9技术可以构建Lyst基因缺陷小鼠,外观表型与已有的文献报道一致。     

基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73(GP73)基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法：利用非同源末端连接(NHEJ)修复引入突变的方式,造成GP73基因蛋白读码框移码,使其功能缺失,针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点,体外转录获得sgRNA,与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠,通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠(GP73^-/-小鼠)。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73 mRNA表达,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清GP73蛋白水平。结果：与野生型(WT)小鼠相比,GP73^-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73 mRNA及蛋白表达水平降低,血清GP73蛋白水平降低(均P<0.05)。结论：基于CRISPR/Cas9技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。     

CRISPR技术发展及其在骨和软骨组织工程中的应用

由Cas9核酸酶和单向导RNA（sgRNA）组成的CRISPR/Cas9系统,可对sgRNA靶向的DNA序列进行缺失、插入和点突变等基因重编程操作,是新兴的基因编辑技术。此外,CRISPR/dCas9（Cas9核酸酶活性丧失的突变体）,仍保留sgRNA靶向结合DNA的能力,dCas9蛋白融合转录激活物（CRISPRa）后可激活目标基因表达,也可通过融合转录阻遏物（CRISPRi）抑制目标基因表达。CRISPR/Cas9系统的高效输送是限制其临床广泛应用的主要问题之一。病毒载体被广泛用于递送CRISPR/Cas9元 件;但就安全性、简便性和灵活性而言,非病毒载体研究更具吸引力。本文主要总结了CRISPR技术的原理和研究进展,包括CRISPR/Cas9的递送载体,递送模式以及递送过程的障碍,并回顾基于CRISPR技术在骨和软骨组织工程中的研究进展,讨论CRISPR技术在骨和软骨组织工程应用中面临的挑战和未来。     

利用CRISPR/Cas9系统建立叉头框G1基因敲除的人胚胎干细胞系

目的 采用成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR/Cas9）基因编辑技术构建叉头框G1（FOXG1）基因敲除的人胚胎干细胞系,研究FOXG1基因在人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的作用。方法 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过转染2个向导RNA（gRNA）诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除,经单克隆筛选、测序分析和蛋白质印迹分析验证获得FOXG1基因敲除的人胚胎干细胞;通过细胞免疫荧光染色、qRT-PCR检测FOXG1基因敲除前后细胞在早期神经诱导过程中关键标志物配对框基因6（PAX6）、性别决定区Y框蛋白2（SOX2）和正小齿同源物2（OTX2）的表达。结果 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得FOXG1基因大片段缺失的人胚胎干细胞,细胞免疫荧光染色、qRT-PCR结果均显示人胚胎干细胞早期神经诱导过程中的关键标志物PAX6、SOX2和OTX2的表达并未受FOXG1缺失的影响。结论 通过2个gRNA共转染可以快捷地诱导人胚胎干细胞FOXG1基因的大片段敲除。FOXG1基因缺失并不影响人胚胎干细胞的早期神经诱导。     

利用CRISPR/Cas9技术体内标记示踪小鼠内源性NPC1L1蛋白

目的:对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行标记和示踪,为研究体内胆固醇的吸收机制提供新的技术手段。方法:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3′末端非编码区,设计不同sgRNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas9/sgRNA核酸酶活性,筛选出高活性的sgRNA序列,经体外转录制备sgRNA和Cas9 mRNA。PCR扩增基因打靶的两侧同源臂,与FLAG-EGFP的编码cDNA一起克隆至打靶载体。经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sgRNA、Cas9 mRNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育;通过基因组DNA 的PCR和Southern 印迹分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠。制备小肠组织冰冻切片,荧光显微镜下观察NPC1L1-EGFP的表达分布。结果:成功构建了NPC1L1基因敲入打靶载体,筛选了高活性的sgRNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代小鼠,荧光显微镜下观察到该融合蛋白分布于小肠绒毛上皮细胞的刷状缘,与NPC1L1的分布特征一致。结论:成功实现了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行体内标记,为研究NPC1L1囊泡转运和胆固醇吸收机制提供了有效手段。     

基于CRISPR/Cas9的PALM基因敲除约氏疟原单克隆虫株的构建

目的：基于CRISPR/Cas9技术构建并鉴定Plasmodium yoelii 17XNL PALM基因敲除单克隆虫株。方法：根据PlasmoDB数据库中的约氏疟原虫P.yoelii 17XNL PALM基因序列信息,设计引物与sgRNA。PCR扩增左、右同源臂,将同源臂和sgRNA与载体pYCm-golden-blue连接,构建用于基因敲除的CRISPR工具质粒pYCm-PALM KO。pYCm-PALM KO CRISPR质粒电转染至P.yoelii 17XNL裂殖体,尾静脉注射感染小鼠,24 h后采血查获疟原虫后,给予小鼠6 mg/mL乙胺嘧啶喂水进行药物压力筛选基因敲除疟原虫。此后每2天鼠尾采血涂片镜检疟原虫,喂药8 d时提取疟原虫基因组DNA进行PCR鉴定,最终经测序确定是否发生PALM基因敲除。将已证实存在PALM基因敲除疟原虫的鼠血采用有限稀释法接种小鼠,8 d后采血镜检疟原虫,PCR鉴定,筛选获取单克隆虫株。将获取的PALM基因敲除的单克隆虫株和P.yoelii 17XNL各接种至6只昆明小鼠体内,每只接种1×10⁵感染疟原虫的红细胞(iRBC)...     

基于CRISPR/Cas9系统定点编辑小鼠MAD2L1基因及其脱靶效应分析

目的 建立利用CRISPR/Cas9系统对小鼠MAD2L1基因第二外显子基因编辑的方法体系，并分析CRISPR/Cas9对MAD2L1基因编辑的脱靶效应。方法 通过CHOPCHOP网站设计位于小鼠MAD2L1基因第二外显子的靶点序列，并构建Cas9-MAD2L1载体，将该载体转染到NIH/3T3细胞中，通过嘌呤霉素筛选并结合荧光显微镜观察GFP后，提取细胞转染后的基因组DNA，利用PCR方法，结合T7E1分析和桑格尔测序，鉴定对小鼠MAD2L1基因编辑情况，并对转染后的NIH/3T3细胞进行CRISPR/Cas9脱靶效应分析。结果 将Cas9-MAD2L1载体转染到NIH/3T3细胞并进行嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下观察到大量表达GFP的细胞，PCR结合T7E1结果显示，以转染后的细胞DNA为模板扩增出的228 bp MAD2L1 PCR产物，可被酶切成166 bp和62 bp片段，测序结果显示，成功对MAD2L1基因第二外显子靶点处进行基因编辑，脱靶效应分析未检测到CRISPR/Cas9有对脱靶位点进行基因编辑。结论 成功建立对小鼠MAD2L1基因第二外显子进行基因编辑的方法体系，设计的对MAD2L1基因编辑靶点未检测到脱靶效应的发生。     

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T细胞, 为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点靶向设计4对向导RNA （sgRNA）,构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的 细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测 G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的Cas9-sgRNA外 源PX458 质粒,T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因 c.392G>T（p.131G>V）突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生 素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T稳定细胞模型, 为后期研究基因的修复奠定了基础。