抗丙型肝炎病毒5′非编码区核酶在细胞内对病毒翻译启动的抑制作用

目的　研究抗丙型肝炎病毒(HCV)5′非编码区(NCR)双位点213和260核酶(Rz)在细胞内对HCV翻译启动功能的抑制作用.方法　通过脂质体介导的基因转染方法,转染Rz基因和带荧光素酶(luc)的靶基因真核表达载体于人肝癌细胞(HHCC),应用液体闪烁计数仪检测luc报告基因的表达活性.结果　Rz213和Rz260均能在HHCC细胞内有效地抑制luc基历的表达,其抑制率在45%～70%之间,而针对两个不同切割位点的Rz之间无显著差异.结论　我们构建的Rz213和Rz260真核表达载体能在HHCC细胞内表达,并有效地抑制HCV5′NCR介导的翻译启动作用抗丙型肝炎病毒5′…     

丙型肝炎病毒与荧光素酶融合基因细胞模型的初步建立

为了建立易于检测且稳定的丙型肝炎病毒 (HCV)细胞模型 ,利用基因重组技术 ,构建了 HCV c DNA与荧光素酶 (luc)融合基因的可调控逆转录病毒载体 ,通过脂质体介导方法转染人肝癌细胞 (HHCC) ,观察 luc基因的表达活性 .结果表明 :成功地将luc基因融合于 HCV C和大部分 E1区基因下游 ,构建了带 HCV- luc融合基因的真核表达载体 (p BPST- HCV- luc) ;该载体在细胞内有效表达 luc活性 ,puromycin筛选可提高 luc的表达水平 ,并可受四环素调节 .结果说明 :初步建立了表达 HCV C- E1和luc融合基因的可调控细胞模型 ,为以 HCVC- E1为…     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

HCV 5′非编码区和核心区重组真核表达质粒的构建及其细胞内定位

目的 :构建丙型肝炎病毒 (HCV)重组真核表达载体 ,为HCV感染基因免疫和基因治疗的研究奠定基础。方法 :构建含HCV 5′非编码区 (NCR)及编码核心蛋白C区基因片段的重组真核表达质粒pBBS2 12 HCV ,通过脂质体介导转染入人肝癌细胞株HepG2中 ,应用RT PCR及免疫组织化学方法鉴定HCV核心蛋白的表达及其在细胞内的定位。结果 :重组真核表达质粒在HepG2细胞中有稳定表达 ,HCV核心蛋白以胞浆内表达为主。结论 :成功构建了含HCV 5′NCR和核心C区基因片段的真核表达载体 ,明确核心抗原的细胞内定位主要在细胞胞浆内。     

tRNA~(val)-CTE复合核酶真核表达载体构建

目的构建tRNA^val—CTE复合核酶真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法用RT—PCR法扩增CTE DNA；合成含tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶以覆内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ序列，通过退火连接到pPUR质粒的BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点之间，构建质粒pPHCV—Rz；用KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切后，将CTE cDNA定向插入表达载体pPHCV—Rz多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析和序列测定进行了鉴定。结果酶切鉴定和测序证实tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶基因以覆CTE cDNA被正确克隆入真核表达载体pPUK。结论tRNA^val-CTE复合核酶真核表达载体的成功构建，为开展利用tRNA^val-CTE复合核酶切割HCV RNA的研究奠定了基础。     

抗ADAR1锤头状核酶的计算机设计及其可控真核表达载体的构建

目的：选择针对ADAR1 mRNA的5’非编码区(NCR)和翻译起始区的锤头状核酶(ribozyrme，Rz)切割位点，构建针对ADAR1的Rz可诱导真核表达载体，旨在knock down ADAR1基因，开展ADAR1基因功能的研究．方法：应用计算机辅助设计，根据能量最低化原理，以ADAR1 mRNA的5’NCR和翻译起始区为靶序列，预测其二级结构，选择理想的Rz切割位点，设计并合成锤头状核酶．采用亚克隆法首先将人工合成的Rz DNA序列插入原核载体p1.5的XbaI和KpnI位点获得Rz原核表达质粒pRz-613；再将pRz-613中ADAR1Rz基因连同其两端的自剪切Rz序列一起克隆入可诱导真核表达载体pTRE的SacⅡ和EcoRI位点得到真核表达质粒pRz—ADAR1；通过酶切电泳和测序检查质粒重组后序列情况．结果：选出ADAR1 mRNA的第208位为Rz切点，设计并合成了RzDNA序列.所构建的pRz—ADAR1经酶切电泳鉴定显示，插入Rz序列大小约为180kb，和预期结果相同；经测序证实Rz序列正确．结论：利用计算机辅助设计，成功构建了针对ADAR1锤头状Rz可诱导真核表达载体pRz—ADAR1．     

绿色荧光蛋白和HCV5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的 :探讨绿色荧光蛋白 (greenfluorescentprotein ,GFP)和HCV 5′NCR(noncodingregion)调控荧光素酶双顺反子真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达。方法 :用基因重组技术 ,将真核表达载体pCMVNCRLuc的HCV5′NCR及其调控的荧光素酶基因亚克隆至报告载体pEGFP C1的GFP基因下游 ,构建含GFP和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子的真核表达载体pGFPNCRLuc。用脂质体基因转染技术 ,将pGFPNCRLuc转染至肝细胞株QSG770 1。结果 :GFP和荧光素酶基因均得到高效表达 ,其荧光素酶表达强度与pCMVNCRLuc比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,GFP表达水平与pEGFP C1比较 ,差异无显著性 (P >0 .0 5 )。结论 :成功构建HCV和HCV 5′NCR调控荧光素酶双顺反子真核表达载体 ,HCV和荧光素酶基因在肝细胞内得到共表达。该结果为特异性抗HCV药物评价系统的建立创造了条件     

丙型肝炎病毒F蛋白对p21基因的调节作用

目的研究丙型肝炎病毒(HCV)F蛋白对细胞p21基因转录、表达的影响。方法PCR扩增HCV 1b来源的F基因,克隆至pcDNA3.1真核表达载体。F基因质粒转染HepG2细胞,48h后抽提细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR及Western blot检测p21基因表达变化。结果HCV F蛋白在HepG2细胞内瞬时表达,相对于空载体对照(目标基因表达量为1),HCV F基因质粒转染细胞的p21转录水平为3.2,蛋白表达水平为1.4。结论HCVF蛋白增加p21转录和表达,其生物学效应值得进一步研究。     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

HCV 5′UTR调控GFP真核表达质粒的构建及表达

目的构建丙型肝炎病毒5′非翻译区（HCV 5′UTR）调控绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中表达。方法通过PCR扩增，获得HCV基因组HCV 5′UTR完整序列及C区序列的部分基因片断。将此片断插入pEGFP-NI载体多克隆位点区，构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒．应用脂质体转染技术转染HepG2细胞并观察荧光。结果成功构建受HCV 5′UTR调控的绿色荧光蛋白真核表达质粒，并在HepG2细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。结论该载体的成功构建，可以用于直观地评价针对HCV 5′UTR的基因药物的效果。