原代培养乳鼠窦房结细胞的形态学研究

目的 通过对原代培养乳鼠窦房结细胞进行光、电镜观察，了解培养窦房结细胞的形态结构特征。方法 取新生24h Wistar乳鼠的窦房结组织，用差速贴壁结合BrdU处理进行原代细胞纯化培养。结果 在培养的窦房结细胞中观察到有3种不同形态的细胞，即梭形细胞、三角形细胞与不规则形细胞，其中梭形细胞最多，博动频率最快，肌原纤维稀疏排列紊乱，细胞器不发达；三角形细胞与心房肌三角形细胞特征相似。结论 在培养的乳鼠窦房结细胞中，细胞体积小搏动频率快的细胞即是窦房结的起搏细胞。     

窦房结缺血再灌注的细胞凋亡研究进展

病态窦房结综合征是临床常见病,其发病机制目前尚不完全清楚。鉴于该病常伴随缺血性心脏病而出现,故窦房结缺血再灌注诱导细胞凋亡可能为其原因之一。在窦房结的发育、成熟过程中,凋亡不足可留下引发心律失常的基础,凋亡过度可引起病态窦房结综合征等病变。采用抑制窦房结病理性细胞凋亡的措施,可望为临床防治病态窦房结综合征提供新的方法。中药具有效果明显,副作用小的优点,如何利用中药来诱导机体产生内源性心脏保护作用是现代中医面临的一个崭新课题。     

模拟缺血预适应对原代培养乳鼠窦房结细胞缺血再灌注损伤的保护作用

目的通过观察不同时间、不同次数的模拟短暂缺血刺激对随后较长时间缺血/再灌注乳鼠窦房结细胞活性的影响,以探讨模拟缺血预适应(IP)对原代培养乳鼠窦房结细胞的保护作用.方法取培养2 d的窦房结细胞,分为对照组、模拟缺血/再灌注(I/R)组及IP1(缺血5 min/再灌注5 min)组、IP2(5 min/5 min×2)组、IP3(5 min/5 min×3)组、IP4(10 min/10 rmin)组、IP5(10min/10min×2)组、IP6(10min/10min×3)组、IP7(20 min/20min)组、IP8(20 mir/20min×2)组、IP9(20 min/20min×3)组,在模拟缺血3 h/再灌注4 h结束后,通过PI染色及MTT比色法检测各组乳鼠窦房结细胞PI染色阳性率及D490值的变化.结果①各实验组乳鼠窦房结细胞D490值均较对照组明显降低(P＜0.01),但IP2组、IP3组、IP4组、IP5组及IP7组D490值却较I/R组明显升高(P＜0.01).②各实验组PI染色阳性窦房结细胞百分率均较对照组明显增高(P＜0.01),但IP2组、IP3组、IP4组、IP5组及IP7组PI染色阳性率却较I/R组显著降低(P＜0.01).结论模拟IP对随后较长时间I/R的乳鼠窦房结细胞具有保护效应,而这种保护作用的产生可能与累计的模拟缺血刺激"总时程"有关.     

缺血后处理对家兔缺血再灌注心肌窦房结细胞凋亡的影响

目的：在家兔急性心肌梗死模型中观察缺血后处理对家兔心肌窦房结细胞缺血再灌注（IR）的作用及Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。方法：在体成年家兔右冠状动脉缺血再灌注模型分4组：正常对照组、IR组、缺血预处理（IPC）组、缺血后处理组。观察缺血后处理对家兔在体窦房结细胞IR损伤及Bcl-2和Bax蛋白表达的变化。结果：对照组细胞凋亡、Bcl-2和Bax蛋白表达极少;IPC、缺血后处理组较IR组窦房结细胞凋亡数目显著减少,Bcl-2蛋白表达显著增强,Bax蛋白表达显著减弱;IPC组与缺血后处理组细胞凋亡数目、Bcl-2和Bax蛋白表达无显著差异。结论：IR损伤可诱导窦房结细胞凋亡,IPC、缺血后处理可通过提高Bcl-2蛋白表达同时下调Bax蛋白表达水平从而减少窦房结细胞凋亡,但两组干预效果无明显差异。     

细胞凋亡与肝移植缺血-再灌注损伤的研究进展

20世界 60年代 ,人们发现了细胞自发死亡与消失的现象。 1 972年 ,Kerr等[1 ] 首先提出了细胞凋亡(Apoptosis)的概念 ,指细胞受到一些特殊信号刺激后 ,按照内在程序 ,即细胞所固有的“死亡程序”,由其自身内部机制调控的主动的细胞死亡 ,属于机体自身的生理活动 ,也称为程序性细胞死亡 (Programmed cell death,PCD)。近些年 ,随着器官移植的不断开展和深入研究 ,人们逐渐认识到细胞凋亡在器官移植中具有特殊的生物学意义。肝移植中的缺血 -再灌注损伤 (ischemia reperfusion,I/ R)主要发生在肝脏保存再灌注损伤 (Hepatic preservationre…     

乳鼠窦房结细胞原代培养与纯化方法的探讨

目的:探讨乳鼠窦房结细胞的原代培养与纯化方法,观察细胞的生长状况,分析窦房结细胞的自律性及形态结构特征.方法:取SD乳鼠96只随机分为试验组和对照组,每组各48只,每次试验各取6只乳鼠窦房结组织,分别用前述两种方法进行细胞培养观察和比较两个培养组中各种细胞的数量及生长状况,以细胞的搏动频率评价细胞的活性,以梭形细胞的数量评价窦房结细胞的纯度.结果:(1)试验组明显减少了酶与细胞的接触时间和离心时间;简化了操作环节,优化了细胞的培养环境,可提高细胞的活性;(2)经过差速贴壁、阿糖胞苷处理,可明显减少不规则细胞的数量,窦房结细胞的数量明显上升(P＜0.01).结论:试验组纯化培养法是一种较为可行的乳鼠窦房结细胞原代培养方法,可为进一步研究提供高纯度、高活力的窦房结细胞.     

Rho激酶在乳鼠心肌细胞模拟缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用

摘要：目的观察Rho激酶在培养乳鼠心肌细胞缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用,及Rho激酶抑制剂盐酸法舒地尔（fasudil,F）对缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法原代培养出生1～2d的SD乳鼠心肌细胞,并行肌钙蛋白抗体免疫荧光染色鉴定,建立缺血再灌注损伤（I/R）模型。实验分3组：① 正常对照组;② I/R组;③ I/R+F组：建立I/R模型前20min 加入法舒地尔,使其终浓度分别为10μmol/L（F1组）、30μmol/L（F2组）、50μmol/L（F3组）。Western blot分别检测缺血2h,再灌注3h肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（myosin phosphatase target subunit 1,MYPT1）磷酸化水平,作为Rho激酶功能活化的标志。应用流式细胞仪Annexin-V/PI双色法检测再灌注3、6h时点心肌细胞的凋亡率。结果再灌注3h后MYPT1的磷酸化水平明显增加,I/R组为正常对照组的 5.7倍(P＜0.01),F1、F2、F3组法舒地尔干预后较I/R组分别减少24.6%、40.1%、60.1%（P＜0.05）;法舒地尔组再灌注3、6h心肌细胞的凋亡率较I/R组同时间点显著下降,随给药浓度的增加,细胞凋亡率呈下降趋势。结论Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中有促凋亡作用,法舒地尔可减少缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生,从而发挥良好的心肌保护作用。     

利用培养乳鼠心肌细胞建立缺血再灌注损伤实验模型的探讨

利用培养乳鼠心肌细胞，复制缺血再灌注损伤模型，通过观察细胞三磷酸腺苷（ＡＴＰ）、细胞内钙离子（［Ｃａ２＋］ｉ）、脂质过氧化物（ＬＰＯ）、乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）及心肌细胞扫描电镜变化，发现：①缺血３ｈ培养液中ＬＤＨ及［Ｃａ２＋］ｉ、ＬＰＯ轻度上升，ＡＴＰ耗竭明显，细胞严重水肿；②再灌注早期ＬＤＨ、［Ｃａ２＋］ｉ及ＬＰＯ急剧增加，ＡＴＰ含量逐渐升高，再灌注１ｈ细胞水肿减轻。结果提示：①在常温、缺氧、缺糖及限制培养液量的条件下培养乳鼠心肌细胞３ｈ，再在基础培养液（ＭＥＭ）存在下培养１ｈ，能成功复制缺血再灌注损伤模型；②证实了心肌细胞缺血再灌注损伤可能与氧自由基（ＯＦＲ）作用及［Ｃａ２＋］ｉ超负荷有关。     

细胞凋亡与缺血再灌注损伤

细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下,遵循自身的程序,自己结束其生命,是细胞在基因调控下采取的自杀行为.它是机体内衰老的、无用的或某些损伤细胞死亡的一种不同于细胞坏死特殊的细胞死亡形式.……     

缺血预处理与肝脏缺血再灌注时细胞凋亡变化的关系

目的 探讨缺血预处理与兔肝脏缺血再灌注时细胞凋亡变化的关系.方法 将兔分为假手术（SO）组、缺血再灌注（IR）组,缺血预处理（IP）组.后2组中分为6个亚组.缺血期均为60 min.缺血预处理为缺血前采用5 min缺血及5 min再灌注的方法.分别于再灌注结束后处死动物采取肝脏标本,SO组于手术后24 h采取肝标本.检测各组细胞凋亡指数.结果 在再灌注3～24 h时段时,IP各组与IR各组比较差异均有显著性（P〈0.01）,而在再灌注1、48 h时,两者比较差异无显著性（P〉0.05）.在IR组组内,在IR1h～IR24h组中,各组细胞凋亡值（AI）值均较上一组有显著性增加,而IR48h组与IR各组（IR1h组除外）比较,细胞凋亡值却出现显著性降低.而在IP组中,IP1h与其余IP各组比较,AI值差异有显著性（P〈0.01）,而其余IP各组的组间比较差异无显著性（P〉0.05）.结论 细胞凋亡现象主要存在于肝脏缺血再灌注早期,并且随着再灌注时间的延长,细胞凋亡现象逐渐加重,在再灌注24 h达到高峰.缺血预处理可明显抑制再灌注早期的细胞凋亡现象,从而减轻肝脏缺血再灌注损伤.     

缺血再灌注对在体兔窦房结电生理功能的损伤研究

目的　探讨缺血再灌注对在体兔窦房结电生理功能的影响。方法　取家兔 90只随机分为对照组、缺血 10、3 0、60、12 0min组及缺血再灌注 4h组 ,每组 10只。通过结扎及放松右冠状动脉起始部建立在体兔窦房结缺血再灌注损伤模型 ,同步记录体表及心腔内电图 ,观察AA间期变化及心律失常发生情况。结果　①对照组各时相点AA间期比较均无显著差异 (P >0 .0 5 )。②缺血组与缺血再灌注组 80只兔子在缺血期共有 5 1只 ( 63 .75 %)发生窦性停搏、窦性心动过缓伴不齐、或房性快速性心律失常 ,且随缺血时间延长 ,心律失常发生率增加 ;有 5 4只兔子 (占 67.5 %)于结扎右冠状动脉后AA间期延长 40ms以上。③缺血再灌注组 40只兔子中 ,有 2 6只兔子于缺血期发生了窦性或房性心律失常 ,其中 15只于再灌注后 2 0min内恢复正常 ,但另有 3只发生了新的心律失常。④缺血再灌注组于缺血期有AA间期延长的 2 7只兔子 ,多在再灌注后 10min内恢复至结扎前水平 ,但缺血 60、12 0min再灌注组则随再灌注时间进一步延长 ,AA间期再次延长。结论　①约 2 3的兔子窦房结动脉可能起源于右冠状动脉。②窦房结缺血引起的心电生理变化与病窦综合征的心电图表现相似。③较长时间缺血后再灌注可发生再灌注心律失常     

模拟缺血对培养乳鼠窦房结细胞膜KATP通道电流的影响

目的 观察模拟缺血对原代培养乳鼠窦房结细胞膜KATP通道电流的影响,为保护缺血窦房结细胞提供实验依据.方法 取培养2d乳鼠窦房结细胞进行实验,将细胞放入灌流槽,用模拟缺血液持续灌流,并在不同阶段加入KATP通道阻断剂Glibenclamide(10μM/L),采用全细胞膜片钳技术,在钳制电压为-40mV情况下连续纪录的跨膜电流的变化情况.结果 在-40mV钳制电压下,窦房结细胞模拟缺血2min可产生KATP通道外向电流,该电流5min左右达最大值,约10min后自行衰减.在细胞外液中加入Glibenclamide后,模拟缺血诱发的跨膜外向电流明显减小[(7.5±0.8)pA vs (2.1±0.3 )pA,P＜0.05].Glibenclamide可加速模拟缺血诱导的外向电流的衰减,它对电流的阻断率为68.5%[(2.4±0.4)pA vs (7.5±0.8)pA,P＜0.05].结论 模拟缺血可引起窦房结细胞膜上对Glibenclamide敏感的KATP通道的开放,这可能有利于保护缺血窦房结细胞.     

ATP敏感性钾通道开放剂对培养乳鼠窦房结细胞模拟缺血时细胞活性的影响

目的 观察ATP敏感性钾（KATP）通道开放剂对模拟缺血窦房结细胞活性的细胞,并探讨其作用机制。方法 取培养2d的窦房结细胞,以低渗（85msmol/L）台盼蓝染色四唑盐（MTT）比色观察窦房结细胞活性的变化。结果 模拟缺血4h后,窦房结细胞脆性增加、活性降低;KATP通道开放剂Pinacidil和Diazoxide能显著降低模拟缺血窦房结细胞脆性,增加细胞的活性,但两组间无明显的统计学差异;KATP通道阻断剂5-HD能逆转Pinacidil及Diazoxide的上述作用。结论 KATP通道开放剂Pinacidil和Diazoxide对缺血窦房结细胞具有显著的保护作用,但这种效果能为KATP通道阻断剂5-HD阻断。本研究提示窦房结细胞线粒体内膜可能有KATP通道存在,它的开放可能是细胞获得保护的关键。     

KATP通道开放剂对培养乳鼠窦房结细胞模拟缺血时L-型钙电流的影响

目的：观察ATP敏感性钾（KATP）通道开放剂对原代培养的乳鼠窦房结细胞模拟缺血时L型钙电流（L－ICa)的影响以探讨其保护作用机制。方法：取培养2d的原代窦房结细胞,运用常规全细胞膜片钳技术,采用灌流方法研究KATP通道开放剂Pinacidil和Diazoxide对缺血窦房结细胞L－Ica的作用,结果：模拟缺血4h可使窦房结细胞LI－ICa密度显著减少（P＜0．01）,电流密度－电压曲线下移;Pinacidil及Diazoxide则能使缺血的窦房结细胞L－ICa密度明显增加（P＜0．01）,电流密度－电压曲线上移,但两组间无明显的统计学差异,选择性线粒体KATP通道阻官剂5－HD能消除Pinacidil及Diazoxide的上述作用。结论：Pinacidil和Diazoxide可能通过开放缺血窦房结细胞线粒体KATP通道来增加L－ICa密度从而对细胞产生保护作用。     

兔窦房结组织急性损伤后细胞形态结构改变的动态观察

目的探讨用甲醛湿敷致兔窦房结组织急性损伤后窦房结细胞形态学的动态变化规律.方法将60只日本大耳白兔随机分组,用20%甲醛湿敷窦房结区建立窦房结急性受损术后2 h、1、2、3周及4周(每组10只)实验组模型,对照组与术后2 h组于湿敷后2 h、其余各组分别于相应时间点切取窦房结组织留取标本;观察用TUNEL法检测窦房结细胞凋亡情况.结果光镜下,各实验组均有不同程度的窦房结细胞损伤,主要表现为细胞明显肿胀、粒细胞浸润、细胞坏死及胶原纤维增生等病变.电镜下各实验组细胞超微结构病变亦明显,主要表现在线粒体肿胀及嵴变短、紊乱或断裂甚至消失;内质网则广泛解体、离断;核膜极不规整,核仁裂解,染色质边聚肌丝模糊,片状溶解或坏死.对照组兔窦房结均未见明显的细胞凋亡.实验组兔窦房结均可见不同程度的细胞凋亡,与对照组相比凋亡率均有显著性差异(P＜0.01),但实验组之间凋亡率无统计学意义(P＞0.05).结论用甲醛湿敷法损伤窦房结组织不仅导致窦房结细胞不可逆性损伤,而且可诱发窦房结细胞凋亡.     

缺血再灌注对在体兔窦房结细胞形态结构影响的研究

目的 探讨缺血再灌注对在体兔窦房结细胞形态结构的影响。方法 取家兔90只分为对照组、单纯缺血组(又分为缺血10、30、60及12Dmin4个亚组)及缺血再灌注组(又分为4个亚组，分别缺血10、30、60及120min后均再灌注4h），每组10只。当达各预定时间点后，迅速取窦房结组织固定，供光镜及电镜观察。结果 ①与对照组比较，缺血10min组光镜观察窦房结细胞未见异常，电镜观察则显示胞质及线粒体轻度肿胀，而缺血10min再灌注组窦房结细胞的光镜及电镜观察均未见异常。②缺血30、60及120min组中分别有7、6及8只兔子的窦房结细胞发现形态结构改变，其中光镜下主要表现为细胞肿胀、核固缩及灶性坏死；电镜下可见线粒体肿胀，嵴紊乱或断裂，并以缺血120min组细胞损伤最为严重。③缺血30、60及120min再灌注组中分别有6、8及7只兔子的窦房结细胞发现形态结构异常，其光镜及电镜观察见窦房结细胞形态结构改变与缺血组相似，但其损伤程度则较相同缺血时间的缺血组重。结论 缺血及缺血再灌注均可引起在体兔窦房结细胞形态结构改变，且随着缺血时间的延长，细胞损伤进一步加重；相同缺血时间的缺血再灌注组细胞损伤较单纯缺血组重，表明有缺血再灌注损伤的存在。     

模拟缺血预适应对原代培养乳鼠窦房结细胞起搏离子流的影响

目的通过比较模拟缺血预适应(IP)及模拟/再灌注(I/R)对原代培养乳鼠窦房结细胞起搏离子流(IF)的影响,探讨IP对I/R时乳鼠窦房结细胞电生理活动的保护作用。方法取培养2D的乳鼠窦房结细胞,随机分为①对照组;②模拟I/R组;③模拟IP组。以全细胞膜片钳技术检测窦房结细胞IF的变化。结果①模拟I/R组各指令电压下的IF密度较对照组显著增高,激活曲线右移,半数最大激活电压由(-98.9±2.4)MV变为(-85.2±2.5)MV(P<0.01)。②模拟IP能显著降低I/R后的IF密度,使激活曲线左移,半数最大激活电压变为(-93.3±2.8)MV(P<0.01),但未恢复到对照水平(P<0.05)。结论模拟IP可抑制模拟I/R后活化增强的IF,有助于维护I/R时窦房结细胞电生理活动的相对稳定性。     

窦房结区甲醛湿敷法建立犬窦房结损伤模型

目的 探讨甲醛湿敷法建立犬窦房结损伤模犁的可行性和电生理特征变化.方法 20只实验犬按随机数字表法随机分为湿敷后2 h、4 h、1周及4周组(n=5).用20%甲醛湿敷窦房结区建立窦房结损伤模型.各组于湿敷前、湿敷后各自相对应时间点行电生理功能检测,同步记录体表心电图(electrocardiogram,ECG).结果 20只实验犬甲醛湿敷时间为3～12(6.2±2.6)min.5只犬甲醛湿敷后窦性心率(heart rate,HR)显著减慢[(140±11)、(89±6)次/min,P<0.01],无心律失常;4只犬除窦性心率明显减慢外出现窦性心律不齐、窦性停搏及频发房性早搏,但很快恢复为规整的窦性节律;11只犬予甲醛湿敷后P波消失,呈交界性逸搏心律,其中4只于湿敷后24 h行ECG监测时转为窦性心律,但HR仍显著低于湿敷前.湿敷后2 h、24 h、1周及4周组的HR均较甲醛湿敷前显著减慢(P<0.01);各组湿敷后的窦房结恢复时间(sinus node recovery time,SNRT)及校正的窦房结恢复时间(corrected sinus node recovery time,CSNRT)则均较湿敷前显著延长(P<0.01,P<0.05).结论 采用甲醛湿敷法可以成功建立犬窦房结损伤模型,其电生理改变与临床病态窦房结综合征表现相似.