肾癌细胞来源exosome的制备和免疫相关蛋白组成的初步研究

目的:分离纯化肾癌细胞分泌的exosome,检测exosome免疫相关蛋白的组成,探讨其潜在的临床应用价值.方法:体外培养人肾癌细胞株Rc-2.用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化exosome,透射电镜观察其形态,Western blot检测其免疫相关蛋白的组成.结果:用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法成功分离出exosome.透射电镜下exosome为类圆碟形,具有双层膜结构,直径30-100 nm.exosome表达肾癌特异性抗原G250、热休克蛋白70(Heat shock protein70,HsP70)和细胞间粘附分子(Intercellular Adhesion Molecule-1,ICAM-1).结论:超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法可以分离纯化肾癌细胞分泌的exosome,exosome表达免疫相关蛋白G250、HSP70、ICAM-l.其负载肾癌特异性抗原,具有免疫原性,可望成为治疗肾癌的新疫苗.     

热休克胶质瘤源exosomes分离鉴定及相关蛋白组成的研究

目的验证胶质瘤细胞可分泌exosomes,探讨热休克对胶质瘤细胞分泌的exosomes产量及相关蛋白的影响,为进一步研究增强exosomes免疫活性及体外实验提供理论依据.方法采用差速离心法结合超滤及蔗糖密度梯度离心纯化得到胶质瘤细胞分泌的Exosomes和经热休克处理后胶质瘤细胞分泌exosomes(Heat shocked Exosomes,HS-Exo),电镜观察两组exosomes形态.westerrn-blot鉴定HSP70及ICAM-1表达.结果胶质瘤细胞及经热休克处理后均可分泌exosomes,直径约30-100nm,电镜形态无明显差别.经westerrn-blot检测热休克处理的细胞的HSP70及ICAM-1表达量增加,为进一步提高exosomes的免疫活性提供理论基础.     

热休克小鼠肝癌细胞(H22)源Exosomes的制备及其蛋白组成的初步研究

目的:探讨热休克对小鼠肝癌细胞H22分泌的Exosomes产量及蛋白组分的影响,为进一步研究Exosomes在生产和免疫治疗方面的改进提供理论依据.方法:经超速分级离心和蔗糖密度梯度离心纯化得到H22细胞分泌的Exosomes和经热休克处理后H22细胞分泌的Exosomes(Heat shocked Exosomes,HS-Exo),透射电镜观察其形态,SDS-PAGE电泳分析其蛋白带组成,Western Blot检测两者所含有的免疫分子情况.结果:在透射电镜下,HS-Exo与Exosomes形态相似,直径约20～90nm的膜性囊泡,结构完整;经热休克处理后小鼠肝癌细胞H22分泌的Exosomes产量增多,且在HS-Exo中表达的热休克蛋白70(HSP70)、热休克同源蛋白70(HSC70)、热休克蛋白60(HSP60)、粘附相关蛋白(ICAM-1)与在Exosomes中的表达相比显著上调(P<0.05).结论:超速分级离心及蔗糖密度梯度离心提取纯化热休克小鼠肝癌细胞H22源的Exosomes的方法具有可行性;HS-Exo中HSP70、HSC70、HSP60、ICAM-1的表达比Exosomes更为丰富,提示HS-Exo可能比Exosomes具有更强的免疫活性.     

肝癌细胞来源的exosomes提取方法的改进及电镜观察

目的：分离提纯两种肝癌细胞HepG2细胞和Hep3B细胞来源的exosomes，并在透射电镜下观察exosomes的形态特征，为肿瘤免疫治疗寻找肿瘤新抗原提供实验材料。方法：采用离心超滤联合蔗糖密度梯度离心等方法分离出HepG2和Hep3B细胞释放exosomes，经透射电镜观察其超微结构。结果：HepG2和Hep3B细胞分泌释放的exosomes为直径50-100nm的膜性微囊结构，圆形或椭圆形，腔内为低电子密度成分。结论：离心超滤和蔗糖密度梯度离心法分离提纯exosomes方法是较为简便高效，对肿瘤细胞培养上清提纯exosomes而言具有可行性。     

肾癌ACHN细胞exosome对自身细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨肾癌ACHN细胞来源的exosome对肾癌ACHN细胞自身增殖和凋亡的影响及机制。方法用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome;采用CCK-8法评价exosome对肾癌ACHN细胞增殖的影响;Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡的变化;RT-PCR和Western blotting检测CyclinD1、caspase-3 mRNA和蛋白的表达;Western blotting检测p-Akt、p-ERK1/2的变化。结果成功使用超滤和蔗糖重水密度梯度超速离心法分离纯化肾癌ACHN细胞分泌的exosome。exosome可促进肾癌ACHN细胞增殖,抑制其凋亡;在此过程中,CyclinD1 mRNA和蛋白的表达均上调,而caspase-3 mRNA表达无明显变化,caspase-3蛋白表达下调;同时p-Akt和p-ERK1/2的表达也上调。结论 exosome可促进肾癌ACHN细胞生长和增殖,抑制细胞凋亡。筛除肾癌微环境中的exosome或抑制其功能,可能成为肾癌治疗的有效新方法。     

抗ABL胞内抗体对K562细胞酪氨酸激酶活性的影响

目的:观察人慢性粒细胞白血病(CML)细胞转导抗ABL胞内抗体基因后,对其酪氨酸激酶活性的影响。方法:构建逆转录病毒载体MSCV-ib-IRES-eGFP,转导K562细胞,分选eGFP 的细胞,用RT-PCR检测胞内抗体mRNA的表达,观察细胞内BCR/ABL、c-ABL酪氨酸激酶活性及细胞总蛋白酪氨酸激酶活性的变化。结果:获得表达胞内抗体的K562细胞:K562-ib-eGFP。RT-PCR证实胞内抗体mRNA在K562-ib-eGFP细胞内表达。与对照组相比,K562-ib-eGFP细胞内BCR/ABL和c-ABL蛋白酪氨酸激酶活性及总蛋白酪氨酸激酶活性明显受抑制。结论:转导抗ABL胞内抗体能有效降低CML细胞内ABL酪氨酸激酶活性,为进一步研究打下基础。     

胃癌细胞来源的exosome的提取和鉴定

目的从胃癌细胞系SGC7901培养上清中分离获得外来体（exosome），并进行形态学观察鉴定。方法通过低速离心、高速离心、超滤及超高速离心等方法，从SGC7901胃癌细胞培养上清中分离exosome，用透射电子显微镜观察其形态特征，Lorry方法蛋白定量，通过免疫印迹进行主要组织相容性复合体（MHC）分子鉴定。结果SGC7901胃癌细胞上清中分泌大量的exosome，电镜下观察呈椭圆形或圆形的双层膜的囊泡，直径为30～100nm，具有完整的细胞膜。结论用离心的方法可从SGC7901胃癌细胞培养上清中提取exosome，有可能作为胃癌免疫治疗的潜在抗原，同时也为研究肿瘤的发病机制提供一个新的途径。     

K562细胞分泌exosomes的观察及膜表面标志分子CD63的克隆

目的观察K562细胞分泌的外泌体exosomes.构建CD63与绿色荧光蛋白融合蛋白载体,并在K562细胞中表达。方法采用梯度离心的方法分离K562细胞培养上清中的exosomes,并用扫描电镜观察。构建pEGFP-N1-CD63重组质粒,以不同方式转染至K562细胞,观察表达效率的差异。结果质粒pEGFP-N1-CD63经测序鉴定,通过激光共聚焦显微镜观察,能够在K562细胞中表达。Amaxa核转染的效率高于脂质体转染的方式。结论成功构建pEGFP—N1-CD63质粒并在K562细胞中表达,可对exosomes进行示踪,为后续实验奠定基础。     

槲皮素对K562/A02细胞株热休克蛋白mRNA及蛋白质表达的影响

目的了解槲皮素对K562/A02细胞株70kd热休克蛋白(HSP70)基因及蛋白质表达的影响.方法热处理前后加入终浓度为10μmol/L的槲皮素,RT-PCR方法检测HSP70基因mRNA表达,Western blot方法检测HSP70蛋白表达. 结果热处理明显增加K562/A02细胞HSP70基因mRNA转录和蛋白表达;热处理前加入槲皮素,HSP70基因mRNA及蛋白表达均显著下调;热处理后加入槲皮素,HSP70基因mRNA及蛋白表达无明显变化. 结论热处理能明显增加K562/A02细胞HSP70基因转录和蛋白表达;槲皮素能抑制K562/A02细胞HSP70基因mRNA及蛋白的表达,并且抑制点早于HSP70的基因转录;槲皮素在K562/A02细胞HSP70基因转录启动后则不再有抑制作用.     

Exosomes致敏的树突状细胞介导的抗大肠癌LoVo细胞株的作用

目的：分离LoVo细胞释放的exosomes,以其致敏树突状细胞（dendritic cell,DCs）,观察其对细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes,CTLs）的激活效应。方法：离心超滤和蔗糖密度梯度离心法分离LoVo细胞释放的exosomes,常规方法从静脉血单个核细胞诱导DC,并分离T细胞,将LoVo细胞来源的exosomes冲击或未冲击的DCs与T细胞共培养。MTT比色法检测体外细胞毒活性。结果：LoVo细胞分泌的exosome致敏的静脉血DCs激活CTL的能力显著高于肿瘤冻融抗原致敏的DCs组,在效靶比为50：1时,两组CTLs对LoVo细胞的杀伤率为（67．9％vs38．7％,P〈0．05）。结论：树突状细胞经来自LoVo细胞分泌的exosomes致敏后,能活化CTLs而杀伤肿瘤细胞。     

5-脱氧杂氮胞苷修饰的肝癌细胞来源胞外体对淋巴细胞增殖功能的影响

目的研究经5-脱氧杂氮胞苷(5-Aza-deoxycytidine,5-Aza-CdR)处理的肝癌细胞HepG2分泌的胞外体(exosomes)对免疫细胞增殖能力的影响。方法采用离心超滤等方法将经5-Aza-CdR处理和未处理过的肝癌细胞系HepG2细胞分泌的exosomes分离和纯化。Ficoll淋巴细胞分层液分离外周血单个核细胞(PMBC);将实验分为exosomes实验组(加药组)、exosomes对照组(未加药组)、加药exosomes提取后上清组、未加药exosomes提取后上清组、空白对照组。H3-TdR掺入法检测PBMC细胞增殖状况。结果 exosomes对照组及其上清液对淋巴细胞增殖功能有明显的抑制作用,与空白对照组比较有显著性差异(P<0.05);而exosomes及其上清液实验组对淋巴细胞增殖功能的影响明显减弱,与exosomes和上清液对照组比较存在显著的统计学差异(P<0.05),而与空白对照组无统计学上的差异(P>0.05)。结论经5-Aza-CdR修饰的exosomes及其上清液显著改善HepG2来源的exosomes对淋巴增殖功能的抑制作用。     

刚地弓形虫RH株速殖子外泌体的分离与鉴定

目的: 分离与鉴定刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）RH株速殖子外泌体。方法: 收集弓形虫速殖子与人结肠癌SW480细胞共培养上清液,经离心、过滤,采用基于聚合物沉淀技术的试剂盒法分离外泌体;透射电镜观察外泌体形态特征,纳米颗粒跟踪分析（nanoparticle tracking analysis,NTA）检测外泌体粒径大小,蛋白质印迹法检测外泌体经典标志分子CD63、HSP70以及弓形虫特异蛋白表面抗原1（surface antigen 1,SAG1）、棒状体蛋白16（rhoptry protein 16,ROP16）、ROP18和致密颗粒蛋白1（dense granule protein 1,GRA1）。结果： 从弓形虫与细胞共培养上清液中分离出囊泡样物质,其外形为圆形,有完整的膜结构,直径为30~150 nm;表达外泌体特异性蛋白CD63、HSP70;检测出弓形虫特异性蛋白SAG1、ROP16、ROP18和GRA1。结论： 从弓形虫速殖子与SW480细胞共培养上清液中获得弓形虫外泌体。     

多步离心法提取K526细胞外泌体

目的:探讨多步离心提取K526细胞外泌体的实验方法.方法:选用白血病细胞株K562细胞为研究对象,取其培养上清液,经多步骤离心获取提取物,然后进行形态和蛋白成分分析.结果:形态和蛋白成分分析证实所提取到的物质正是K526细胞外泌体.结论:多步离心是一种方便实用的提取外泌体的方法.     

兔房水来源exosomes的分离与鉴定及其免疫抑制功能的研究

目的:探讨兔房水中是否能够分离得到具有脂质双分子层结构的纳米级小囊泡exosomes,并检测其是否表达免疫抑制相关分子,参与眼球免疫耐受状态的维持。方法:收集40只健康新西兰大白兔的房水,分级分离,超速离心制备exosomes,透视电镜对其形态进行鉴定;Western blot检测exosomes标志性蛋白以及免疫抑制相关分子TGF-β的表达情况;采用CCK-8细胞增殖检测方法判断兔房水来源的exosomes对经ConA诱导的兔子T淋巴细胞增殖情况的抑制功能。结果:40只新西兰大白兔收集到约8 ml的房水,从中获得200μg exosomes。经透射电镜鉴定:从房水中分离获得的exosomes直径主要集中在50～100 nm,具有典型的脂质双分子层结构;Westerblot结果表明,该exosomes表达热休克蛋白Hsp70、四次跨膜蛋白CD9以及内体相关蛋白Alix,不表达内质网蛋白Grp94,具有典型的exosomes蛋白表达谱。此外,该exosomes还表达免疫抑制相关分子TGF-β。体外抑制淋巴细胞增殖实验表明,房水来源的exosomes能够明显抑制T淋巴细胞的增殖。结论:兔房水中能够分离出具有免疫抑制功能的exosomes;该exosomes很有可能参与了眼球免疫耐受的维持。     

反义BCR/ABL寡核苷酸体外抑制K562细胞的研究

目的：探讨反义ＢＣＲ和ＡＢＬ融合基因（ＢＣＲ／ＡＢＬ融合基因）寡核苷酸体外抑制Ｋ５６２细胞的作用及机制。方法：采用Ｋ５６２细胞培养,观察反义ＢＣＲ／ＡＢＬ寡核苷酸体外对Ｋ５６２细胞数、台盼蓝拒染率及克隆形成等的影响。结果：经反义ＢＣＲ／ＡＢＬ寡核苷酸ｂ３ａ２（ＡＳｂ３ａ２）处理后培养８ｄ的Ｋ５６２克隆抑制率达６０６９％,液体培养中细胞数从２４ｈ开始较对照组减少,细胞存活率从８ｈ开始即较对照组明显下降,ＢＣＲ／ＡＢＬ寡核苷酸ｂ２ａ２（ＡＳｂ２ａ２）及无义寡核苷酸对Ｋ５６２细胞数和存活率无明显影响;３种寡核苷酸对ＨＬ６０细胞数和存活率也无影响。结论：ＡＳｂ３ａ２对Ｋ５６２细胞有序列特异性的抑制作用。ＡＳｂ３ａ２的这种抑制作用可能在于它诱导Ｋ５６２细胞的凋亡。     

益气补肾口服液对体外肿瘤浸润淋巴细胞的作用研究

目的探讨益气补肾口服液（YQBS）对体外肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）的作用,并从免疫学角度初步探讨其作用机制。方法采用不连续密度梯度离心法分离T淋巴细胞,观察YQBS对体外TIL培养后存活时间的影响;TIL体外杀伤活性的影响;TIL细胞形态学的变化。结果YQBS明显延长TIL体外存活时间;对自体瘤细胞、K562细胞的杀伤活性均有显著增强;经细胞涂片和电镜观察,YQB8培养后1周左右,TIL明显增多。结论YQBS具有明显的增加体外TIL数量和活性的作用,其抗肿瘤的作用可能与提高机体免疫能力有关。     

雪旺细胞外泌体影响胶质瘢痕形成修复小鼠脊髓损伤的实验研究

目的:探讨雪旺细胞外泌体（SCDEs）对小鼠脊髓损伤的修复作用。方法:从小鼠坐骨神经中提取原代雪旺细胞,并将雪旺细胞培养上清分次超速离心得到雪旺细胞外泌体。透射电镜鉴定外泌体 ,尾静脉注射外泌体,每周2次,每次3 μL/只,BMS评分观察小鼠行为学功能恢复,免疫荧光染色观察外泌体神经保护作用和胶质瘢痕变化情况。结果:SCDEs的直径范围为40~100 nm;与PBS组相比, SCDEs组行为学BMS评分增加（P<0.05）,神经学功能指标有所恢复（P<0.01）,胶质瘢痕增加（P<0.01）。结论:SCDEs可以促进损伤后胶质瘢痕的增加,修复脊髓损伤。