亲环素A的原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

目的构建人亲环素A(CypA)基因的原核表达载体,诱导表达、纯化蛋白,制备抗体,为进一步研究其生物学作用奠定基础。方法以人肺癌组织总RNA为模板,RT-PCR扩增CypA基因片段,克隆到pMD18-T载体中。扩增产物与原核表达载体pET30a(+)连接,构建表达质粒pET30a-CypA,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用镍树脂亲和层析柱High-Affinity Ni-IDA Resin纯化表达产物,SDS-PAGE检测纯化蛋白。用获得的蛋白免疫大白兔,制备抗CypA蛋白多抗,采用蛋白印迹法检测抗体特异性。结果成功构建了CypA的原核表达载体,经大肠杆菌诱导表达、镍亲和层析柱纯化,得到纯度达80.2%的融合蛋白,免疫大白兔后得到多抗血清。蛋白印迹结果显示此多克隆抗体能与CypA蛋白特异性结合。结论成功获得CypA纯化蛋白及CypA多克隆抗体,为进一步研究CypA在肺癌中的作用机制奠定了基础。     

溃疡性结肠炎患者血清抗亲环素A抗体的检测意义

目的本研究对溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）患者血清中抗Cyclophilin A抗体（ACA）水平进行了测定,旨在探讨ACA与UC的关系。方法用纯化的Cyclophilin A（CyPA）抗原包被微孔反应板建立检测ACA的间接ELISA方法,对67例活动期UC患者,75例内科其他疾病患者及100名健康体检者进行检测。并对49例经治疗缓解后的UC患者ACA水平进行随访。结果 ACA水平以吸光度（A）值（492nm）表示,正常对照组（n=100）A值为（0.09±0.05）,以（x±3s）为正常上限,其A值〉0.24为阳性。各组被检患者血清中ACA水平与阳性率（%）为UC（n=67）（0.33±0.20）,52.2%;内科其他疾病（n=75）（0.10±0.06）,1.3%。UC患者血清中ACA水平明显高于对照组（P〈0.01）及其他疾病组（P〈0.01）。对49例UC患者血清中ACA水平进行随访观察发现,活动期明显高于缓解期（P〈0.01）。结论以上结果提示ACA可能与UC有一定的关系,检测ACA可作为UC的参考诊断指标。     

亲环素A抑制剂研究进展

亲环素A是亲环素家族重要成员,是重要的免疫抑制药物环孢素A的体内结合蛋白,除了具有肽脯氨酰顺反异构酶活性,亲环素A在一系列生物途径中发挥作用,如蛋白折叠、装配、转运、神经生长调节和HIV病毒复制。总结了天然产物抑制剂、肽类抑制剂和有机合成分子等亲环素A抑制剂的发现和发展历程,对亲环素A抑制剂的研究进展进行了综述。     

人参亲环素蛋白原核表达及其抗真菌活性

目的：研究人参亲环素蛋白（pgCyP）体外抗真菌活性。方法采用 RT-PCR 技术,扩增人参 cyclo-philin（pgCyP）基因片段,构建原核表达质粒并转入大肠杆菌中,利用 IPTG 诱导表达目的蛋白,通过亲和纯化获得 pgCyP 蛋白,纸片扩散法验证目的蛋白的抗菌活性。结果人参 CyP 基因全长为522个碱基,编码174个氨基酸;目的蛋白经纯化后,SDS-PAGE 分析显示单一条带;抑菌试验表明该重组蛋白可明显抑制疫霉菌菌丝的生长。结论成功克隆并表达具有抗菌活性的 pgCyP 蛋白,为进一步研究 pgCyP 在人参抗真菌中的作用机制奠定了基础。     

亲环素A 与恶性肿瘤的研究进展

亲环素家族最先被认为是环胞素A( Cyclosporine A，CsA) 的胞内结合蛋白，在进化上有高度的保守
性，广泛表达于原核生物和真核生物中，在人体内有七个主要的亚型。亲环素A( cyclophilin A，CyPA) 作为亲环
素家族中最重要的一员，在自然界中广泛表达，发挥着肽基脯氨酰顺反异构( peptidylprolyl cistrans isomeras，PPIase)
活性和分子伴侣效应，辅助细胞内蛋白质的正确折叠，参与免疫抑制，介导炎性反应，平衡细胞内外胆固醇。
CyPA 在许多恶性肿瘤中均表达增高，在某些恶性肿瘤中，CyPA 的表达增高与肿瘤的恶性转化密切相关。而且
CyPA 直接受信号通路中与促进肿瘤发展密切相关的两个关键调控因子: p 53 与缺氧诱导因子－1α 的调控。本
文详细描述了亲环素家族，尤其是CyPA 的异常高表达对恶性肿瘤形成、发展的重要作用。这些特征表明，CyPA
是一个潜在的恶性肿瘤靶向治疗的靶点。     

亲环素A与恶性肿瘤的研究进展

亲环素家族最先被认为是环胞素A（Cyclosporine A,CsA）的胞内结合蛋白,在进化上有高度的保守性,广泛表达于原核生物和真核生物中,在人体内有七个主要的亚型。亲环素A（cyclophilin A,CyPA）作为亲环素家族中最重要的一员,在自然界中广泛表达,发挥着肽基脯氨酰顺反异构（peptidylprolyl cistrans isomeras,PPIase）活性和分子伴侣效应,辅助细胞内蛋白质的正确折叠,参与免疫抑制,介导炎性反应,平衡细胞内外胆固醇。CyPA在许多恶性肿瘤中均表达增高,在某些恶性肿瘤中,CyPA的表达增高与肿瘤的恶性转化密切相关。而且CyPA直接受信号通路中与促进肿瘤发展密切相关的两个关键调控因子：p 53与缺氧诱导因子-1α的调控。本文详细描述了亲环素家族,尤其是CyPA的异常高表达对恶性肿瘤形成、发展的重要作用。这些特征表明,CyPA是一个潜在的恶性肿瘤靶向治疗的靶点。     

亲环素A与HIV－1的感染性

亲环素A（CyPA）是免疫抑制药物环孢素A的受体,是胞质内一种具有肽基－脯氨酸顺／反异构酶活性的蛋白质。CyPA在HIV－1的生命周期中能掺入病毒颗粒,其掺入为HIV－1的感染性所必需。本文简要综述CyPA在HIV－1复制中的作用,以及这方面的研究对抗HIV－1治疗的意义。     

亲环素A蛋白表达水平与人脑胶质瘤分级相关性研究

目的:探讨亲环素A(CypA)蛋白表达水平与人脑胶质瘤分级之间的关系.方法:采用免疫组化ABC法观察不同病理级别人脑胶质细胞瘤标本45例和正常脑组织10例中CypA蛋白表达情况,比较各级之间表达率的差异.结果:正常脑组织CypA蛋白表达率为0,45例脑胶质瘤组织CypA蛋白总阳性表达率为60.0%,较正常脑组织有显著差异;各级脑胶质瘤CypA蛋白表达阳性率分别为Ⅰ级16.7%,Ⅱ级40.0%,Ⅲ级69.2%,Ⅳ级81.3%,低级别(Ⅰ～Ⅱ级)组为31.3%.高级别(Ⅲ～Ⅳ级)组为75.9%,两组之间CypA蛋白表达有显著差异(P＜0.01).结论:CypA蛋白的表达水平与人脑胶质瘤病理分级相关.     

重组日本血吸虫亲环素A的原核表达及免疫保护作用的研究

目的 克隆、表达日本血吸虫亲环素A(SjCyPA)基因,并对重组蛋白的免疫保护效果进行实验室评价.方法 构建pET28-SjCyPA重组质粒,转化感受态大肠杆菌BL21/DE3.用IPTG诱导表达,经亲和层析纯化目的蛋白.用PBS、rSjCyPA分别免疫小鼠后进行日本血吸虫尾蚴攻击感染,观察其免疫保护效果.结果 成功表达了可溶性SjCyPA蛋白并得到纯化,经Western blot鉴定为血吸虫蛋白.rSjCyPA免疫小鼠产生60.10％的减虫率和43.42％的减卵率,HE染色及Masson染色揭示实验组肝脏虫卵肉芽肿及纤维化明显减轻.结论 rSjCyPA具有较好的抗血吸虫感染和抗血吸虫病的作用,是一个有前景的血吸虫疫苗候选分子.     

亲环素A与头颈部肿瘤的研究进展

亲环素家族(cyclophilins,Cyps)最先被认为是环胞素A(cyclosporine A,CsA)的胞内结合蛋白,是由一组具有肽基脯氨酰顺反异构酶活性(peptidyl-prolyl cis-trans isomeras,PPIase)的蛋白质所组成,目前,已知人类中有7大类16种亲环素蛋白。亲环素A(cyclophiline A,CypA)是亲环素家族中重要的一员,是最早被发现的亲环素,也是Handschumacher在1984年从小牛胸腺中最早被提纯的亲环素。CypA在病毒感     

亲环素A及其自身抗体与溃疡性结肠炎的相关性

目的:探讨血浆和淋巴细胞内亲环素A(CyP A)水平及CyP A自身抗体与溃疡性结肠炎(UC)的关系。方法:用双抗体夹心ELISA法测定67例活动期、49例缓解期UC患者和50名健康体检(正常对照组)者血浆和淋巴细胞内CyP A水平同时用间接ELISA法检测抗CyP A自身抗体,统计分析其间关系。结果:UC活动期患者血浆和淋巴细胞CyP A水平均显著高于正常对照组和缓解期UC患者(P<0.01),但正常对照组与缓解期UC患者差异无统计学意义(P>0.05)。UC活动期患者抗CyPA自身抗体阳性者也显著高于缓解期UC患者及正常对照组(P<0.01)。结论:血浆和淋巴细胞内CyP A升高和抗CyP A自身抗体阳性可反映UC活动性。     

亲环素A及其受体CD147对动脉粥样硬化的影响

亲环素A（CyPA）通过其受体CD147分子作用于动脉粥样硬化发生、发展的全过程。其机制包括引起内皮细胞损伤、凋亡和活化所致的血管内皮功能障碍;趋化各种白细胞如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核/巨噬细胞、T淋巴细胞等聚集至炎症反应局部,并产生各类炎症因子,加重炎症反应;诱导巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶,增强粥样斑块的不稳定性;介导巨噬细胞吞噬脂质形成泡沫细胞,加速脂质条纹形成;促进巨噬细胞、血管平滑肌细胞的增殖,引起血管壁增厚和重构等。对CyPA与其受体CD147分子作用的研究可能为干预动脉粥样硬化提供新的方向。     

间充质干细胞对脂多糖诱导急性肺损伤大鼠亲环素A表达的影响

目的观察亲环素A(CyPA)在脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺组织的表达变化及间充质干细胞对CyPA表达的影响。方法 90只SD大鼠随机分为5组,即:正常对照组、模型组、干细胞对照组和高、低剂量干细胞治疗组,每组18只。模型组经尾静脉注射脂多糖(LPS)5mg/kg;干细胞对照组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞2×106/ml,0.5 ml;正常对照组经尾静脉注射等量生理盐水;高、低剂量干细胞治疗组分别经尾静脉同时注射LPS 5mg/kg和骨髓间充质干细胞2×106/ml、1×106/ml,0.5 ml。分别于造模后6、24和72 h处死动物收取标本,测定右下肺组织髓过氧化物酶(MPO)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)及肺组织细胞核内的CyPA表达。结果模型组、两种剂量干细胞治疗组MPO、TNF-ɑ、IL-1β及CyPA表达三个时间点均较正常对照组显著升高(P<0.05);高剂量干细胞治疗组CyPA蛋白和mRNA表达均较模型组明显降低(P<0.05)。结论 CyPA参与了内毒素诱导急性肺损伤大鼠的发病过程,骨髓间充质干细胞可能通过降低CyPA的活性对急性肺损伤发挥治疗作用。     

变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的表达、纯化与鉴定

目的在大肠杆菌中高效表达变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A(ribose 5-phosphate isomerase A,rpiA),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法根据GenBank中变异链球菌UA159株基因组rpiA的DNA编码序列,设计PCR引物,扩增变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A的DNA编码序列,将其克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达;对培养温度、IPTG用量、诱导时间等条件进行了优化;用亲和层析、离子交换层析纯化目标蛋白;用SDS-PAGE和质谱对目标蛋白进行鉴定。结果变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经质谱鉴定及SDS-PAGE分析,表达产物为变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A蛋白。经过纯化,得到纯度高达95%的变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A。结论成功地在大肠杆菌中高效表达了变异链球菌核糖-5-磷酸异构酶A蛋白,并建立了纯化工艺,得到高纯度的重组蛋白,为进一步研究变异链球菌属核糖-5-磷酸异构酶蛋白的生物学活性及功能奠定了基础。     

凋亡素基因的原核表达构建与提纯

目的 构建凋亡素原核表达系统，制备提纯抗原物质凋亡素融合蛋白。方法 用PCR的技术。以pcDNA—VP3质粒为模板，扩增出凋亡素VP3基因。将其克隆到原核表达载体pET—DsbA的多克隆位点，构建成凋亡素的高效原核表达载体pET—DsbA-VP3，将该质粒转化到大肠杆菌EcoliBL21（DE3）plysS中，以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG）对其进行诱导表达，固化Ni离子金属鏊合纯化带6X组氨酸标签的凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白。结果 转化有凋亡素基因的原核表达载体pET—DsbA—VP3的大肠杆菌E．coliBL21（DE3）plysS经IPTG诱导，固化Ni离子金属鏊合亲和层析纯化凋亡素融合蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳获得分子量为38.3KD的目的蛋白条带。结论 凋亡素原核表达载体pET—DsbA—VP3能高效表达出凋亡素融合蛋白。     

结核分枝杆菌PstS1-U1融合抗原的表达、纯化及其免疫活性测定

目的 为获得一种适于本地结核病临床诊断用抗原,将结核分枝杆菌38×103抗原--即磷酸盐传送蛋白1(phosphate transport system protein l,PstS1)和尿蛋白1(urine protein 1,U1)进行融合表达、纯化并测定其抗原活性.方法 用基因拼接法将结核分枝杆菌编码PstS1和U1蛋白的基因拼接在一起,克隆到原核表达载体pET28a中,通过IPTG诱导实现其高效表达,采用亲和层析纯化表达产物.用纯化的融合抗原免疫家兔获得抗血清,用该血清以及活动性肺结核患者血清对纯化产物的抗原活性进行测定.结果 成功构建了原核表达质粒,对表达产物进行亲和层析纯化,获得相对分子质量为57×103的目的蛋白.经Western blot检测融合抗原能够与活动性肺结核患者血清中的抗体发生结合.结论 本研究表达并纯化出PstS1-U1融合抗原,为进一步的应用奠定基础.     

颈动脉粥样硬化斑块中亲环素A/CD147表达及阿托伐他汀干预的影响

目的：探讨兔颈动脉粥样硬化不稳定斑块中亲环素A(cyclophilin A, CyPA)、基质金属蛋白酶诱导因子CD147表达机制及阿托伐他汀干预对其表达的影响。方法：24只新西兰大白兔分为3组,正常组(A组)8只,余16只给予球囊损伤颈总动脉和高胆固醇喂养12周,随机分成模型对照组(B组,n=8,不接受药物处理)和阿托伐他汀干预组[C组,n=8,阿托伐他汀2.5 mg/(kg.d)],干预4周后给予鲁塞尔氏蛙蛇毒和组胺药物触发斑块破裂。测定不同时间点血清TC,TG,HDL-C和LDL-C水平,对粥样斑块组织进行病理分析,免疫组织化学法检测斑块内巨噬细胞及CyPA和CD147蛋白表达,反转录聚合酶链反应检测斑块内CyPA和CD147 mRNA表达。结果：与A组比较,12周末B组和C组血清TC,HDL-C和LDL-C浓度显著增高(均P<0.01);与B组比较,干预4周后C组血清TC和LDL-C浓度显著降低(均P<0.01)。药物触发后B组存活的6只兔中有4只发生斑块破裂及血栓形成,C组存活的7只兔中有1只发生斑块破裂及血栓形成。与B组比较,C组颈动脉斑块中CyPA,CD147及巨噬细胞含量均显著减少(均P<0.01)。结论：CyPA/CD147可能参与了兔颈动脉不稳定粥样斑块的形成,阿托伐他汀可能可以抑制CyPA/CD147的表达而发挥稳定斑块的作用。