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相似文献
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1.
人乳头瘤病毒16 E7 (HPV16E7)逆转录病毒载体的构建   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的 构建人乳头瘤病毒16型E7基因片段(HPV16E7)的逆转病毒载体。方法 PCR扩增HPV16cDNA全长的E7片段,并用酶切,连接等方法将HPV16E7亚克隆到逆转录病毒载体pLXSN上,然后再用酶切,测序进行鉴定,通过Genbank的数据库分析软件对PV16E7进行同源性分析。结果 经酶切分析,测序证明,从HPV16cDNA克隆的300bp的HPV16E7与逆转录病毒载体发生了基因重组,HPV16E7基因片段与数据库中的原HPV16cDNA的E7有高度的同源怀。结论 构建了含HPV16E7的逆转录病毒载体,为人关节软骨细胞的基因转染打下了基础。  相似文献   

2.
人乳头状病毒16/18及E6、E7基因在宫颈癌组织中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的探讨高危型人乳头状病毒(HPV)16/18及其E6、E7基因在宫颈癌诊断中的价值。方法对104例宫颈新鲜组织(正常对照16例,轻度宫颈增生18例,中度宫颈增生20例,重度宫颈增生20例,宫颈癌30例)进行研究,荧光定量PCR用于HPV16/18的检测,PCR用于E6、E7基因的检测。结果正常对照组:HPV16/18阳性1例,E6、E7基因无阳性;轻度宫颈增生:HPV16/18阳性2例,R、E7基因无阳性;中度宫颈增生:HPV16/18阳性2例,E6、E7基因阳性1例;重度宫颈增生:HPV16/18阳性6例,R、E7基因阳性2例;浸润型宫颈癌:HPV16/18阳性16例,E6、E7基因阳性7例。结论宫颈癌组织HPV16/18和E6、E7基因阳性率明显高于其它子宫颈增生者,并随子宫颈增生程度逐渐增加。  相似文献   

3.
黄丽丽  戴淑真  罗兵  姚勤 《齐鲁医学杂志》2005,20(5):406-408,410
①目的构建携带人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7病毒癌基因的复制缺陷型重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-E7。②方法应用PCR技术从宫颈癌组织中扩增E7病毒癌基因全长片段,并导入T载体进行测序,与Nucleotide中HPV16标准毒株序列比较鉴定。目的基因及穿梭质粒载体pAdTrack-CMV分别经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切后连接,转化宿主菌E.coli DH5α,应用PCR法及限制性内切酶消化法双重鉴定重组质粒,并测序。③结果PCR扩增产物与Nucleotide中HPV16E7序列一致,重组穿梭质粒经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切后电泳,可观察到9220bp大小的载体条带和313bp大小的目的基因条带;将经PCR和双酶切鉴定的重组阳性克隆测序,结果证实克隆成功。④结论成功地构建了携带HPV16E7基因的重组腺病毒穿梭质粒。  相似文献   

4.
HPV16 E7蛋白编码基因原核表达与鉴定   总被引:1,自引:1,他引:1  
目的研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其细胞转化机制,对HPV16E7蛋白原核表达质粒进行构建、表达和鉴定。方法以临床确诊的HPV16感染患者子宫颈细胞DNA为模板,采用PCR方法扩增HPV16E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅱ双酶切后插入相同酶切pET32a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选。经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS—PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况。结果成功构建了原核表达质粒pET32/E7,HPV16E7-TRX融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达,在1mmol/L IPTG、30℃诱导条件下融合蛋白表达量占菌体总蛋白的30%左右。结论pET32/E7原核表达质粒的构建、HPV16E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础。  相似文献   

5.
HPV16E7基因的原核克隆及表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:探讨从喉癌组织中HPV16 E7蛋白的原核克隆及表达.方法:采用PCR方法扩增HPV16 E7基因,经BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切后插入相同酶切pET28a(+)载体,转化JM109感受态细胞,并进行阳性克隆筛选.经IPTG对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测目标蛋白表达情况.结果:成功构建了原核表达质粒pET28/E7、HPV16 E7融合蛋白在BL21(DE3)菌株中高效表达.结论:HPV16 E7融合蛋白的表达为进一步深入研究HPV16E7蛋白的生物学特性及其致细胞转化的作用机制奠定了基础.  相似文献   

6.
SV40LTAg基因永生化软骨细胞体外培养的生物学特性   总被引:2,自引:0,他引:2  
王吉兴  姚军 《第一军医大学学报》2003,23(12):1338-1340,1343
目的 探讨永生化关节软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 用SV40LTAg(类人猿40病毒大T抗原)基因转染原代培养的关节软骨细胞。构建永生化关节软骨细胞系(immortalized cartilage chondrocytes)并体外培养,以正常关节软骨细胞(normal cartilage chondrocytes)作对照。倒置显微镜下观察永生化软骨细胞的形态学变化和增殖情况;应用甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色,观察永生化软骨细胞在培养过程中酸性粘多糖(GAG)和胶原分泌情况。结果 永生化关节软骨细胞体外培养呈贴壁单层生长,长期传代(50代)仍有很强的增殖能力,形态呈现多角形和三角形,GAG和胶原染色均呈阳性。结论 构建的永生化关节软骨细胞在体外培养能长期维持软骨细胞的特征性表型。  相似文献   

7.
目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的“自杀性”DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。  相似文献   

8.
目的筛选针对HPV16 E7基因有效的siRNA,探讨其对HaCaT E7 细胞中HPV16 E7 mRNA及细胞表面HLA Ⅰ类分子表达的影响。方法采用化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用转染试剂Lipofectamine2000将其转染入HaCaT E7细胞,采用实时荧光定量PCR(RT PCR)检测HPV16 E7 mRNA的表达,采用流式细胞术(FCM)检测细胞表面HLA Ⅰ类分子的表达。结果3条siRNA均能有效抑制HaCaT E7细胞中HPV16 E7的转录表达,以siRNA2作用效果最明显,抑制率达75%,细胞膜表面HLA Ⅰ类分子的表达明显上调,平均荧光强度(MFI)为130.18±1.07,高于空转染对照组(100.32±3.01)和非特异性siRNA对照组(100.82±2.87)。 结论化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT E7细胞中E7 mRNA的表达,同时使细胞表面HLA Ⅰ类分子表达上调。  相似文献   

9.
目的在真核细胞中表达人Wnt7b基因并且观察对大鼠原代软骨细胞的退变作用。方法取出生24 h SD大鼠关节处软骨,Ⅱ型胶原酶多次消化后获得原代软骨细胞,取P1代细胞进行实验。扩增人Wnt7b基因及克隆至PCDH-GFP上,转染PCDH-GFP和PCDH-Wnt7b至293ft细胞中,48 h后收集细胞上清及转染细胞,Western blot鉴定Wnt7b在293ft细胞中的表达。收集的上清分别稀释10倍和50倍培养大鼠软骨细胞,24 h后观察细胞形态并收集细胞蛋白和抽提RNA,Western blot和定量PCR检测软骨退变指标MMP13、MMP3、Ⅱ型胶原、A-can、ADAMTS5、ColⅩ和SOX9的表达。结果成功克隆人Wnt7b基因至PCDH-GFP载体上且在293ft细胞中得到有效表达。含Wnt7b培养基干预软骨细胞24 h后,软骨细胞形态由原来的多角形变成长梭形,Wnt7b处理组软骨细胞MMP13和MMP3表达显著上调,Ⅱ型胶原的表达下调。PCR结果表明A-can和Sox9表达下降,ColⅩ和ADAMTS5表达增强。结论有效在真核细胞中表达Wnt7b基因并且促进大鼠软骨细胞退变,建立软骨细胞退变的体外模型。  相似文献   

10.
HPV58型E7基因重组痘苗疫苗保护作用的实验研究   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:制备含人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)58型E7基因的重组痘苗病毒疫苗,并利用动物肿瘤模型观察疫苗接种效果。方法:利用PCR方法扩增HPV58 E7 DNA片段,在消除其转化活性的基础上,构建表达HPV58 E7的重组痘苗病毒疫苗并免疫小鼠,观察该疫苗对E7阳性肿瘤细胞生长的抑制作用,体外诱导、测定细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)活性。结果:经定点突变的HPV58 E7基因转化活性显著降低,用突变的E7基因构建的重组痘苗病毒免疫小鼠后,能抑制E7阳性肿瘤细胞在小鼠体内的生长并延长小鼠的生存期;免疫小鼠脾淋巴细胞体外可诱导产生针对E7阳性肿瘤的CTL细胞。结论:在消除转化活性的基础上,HPV58E7可用于治疗与HPV58感染有关的肿瘤。  相似文献   

11.
He Q  Li Q  Yang L  Xu J 《中华医学杂志(英文版)》2003,116(9):1351-1356
Objective To immortalize human articular chondrocytes (HACs) using gene transfection and to maintain stable phenotype of transformed HACs after induction.Methods HACs were transfected with the retroviral vector pLXSN encoding human papillomavirus 16E7 (HPV16E7), and the transformed clones were sorted and proliferated. Karyotype analysis,clone forming tests and nude mice tumor forming tests were applied to check the characteristics of the transformation. Type Ⅱ collagen of transformed chondrocytes was inducted with free serum medium(FSM) supplemented with nutridoma-sp and ascorbate.Results Immortalized HACs were isolated with fifty passages achieved. The HPV16E7 transformedcells were confirmed to be benign. Induction of FSM with nutridoma-sp and ascorbate promoted type Ⅱ collagen of transformed chondrocytes to the high levels of normal chondrocytes.Conclusion HACs transformed with HPV16E7 survive for long periods in vitro, and type Ⅱcollagen can maintain stability after induction.  相似文献   

12.
宫颈癌癌前病变中人乳头状瘤病毒16整合状态的检测   总被引:2,自引:2,他引:0  
目的 探讨宫颈癌癌前病变中人乳头状瘤病毒(HPV)16DNA整合入宿主基因组的发生情况。方法 选取 108例细胞学为宫颈癌癌前病变的患者,应用多重聚合酶链反应 (PCR)同时检测液基细胞标本中的HPV16L1、E_2和E_6基因。采用通用引物GP_(5+) /GP_(6+)扩增HPVL1基因保守区的一个长 150bp的片断,以检测HPV的存在。E_2PCR引物目标是HPV整合时最常缺失的E_2开放阅读框(ORF)的特殊区域,E_6引物目标是E6ORF。在游离型中,E_2、E_6拷贝数比例相等;在整合型中,E_2缺失;在游离、整合的混合型中,E2的拷贝数少于E_6。对E_2、E_6的PCR产物凝胶电泳条带的面积灰度值进行半定量分析,从而确定HPV16的整合状态。结果 HPV感染者 62例 (57. 41% );HPV16感染者 32例 ( 29. 63% ),其中 15例 ( 46 .88% )为纯游离型; 13例 ( 40 .62% )为混合型; 4例(12. 50% )为纯整合型。HPV16DNA整合和 /或混合型的比例随宫颈病变级别升高而增加,不同病变之间差异有统计学意义(P<0 .01)。结论 HPV16整合入宿主基因组在部分宫颈上皮内瘤变中即已发生。多重PCR同时检测HPVL1、HPV16E_2、E_6基因以及E_2 /E_6比值,是一种在宫颈细胞学标本中同时检测HPV感染、HPV16感染和HPV16整合状态的简便方法。它可以作为细胞学筛查的一种补充手段,以发现向宫颈高  相似文献   

13.
人乳头瘤病毒16型基因组体外转化活性的研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的应用重组的人乳头瘤病毒16型(HPV-16)基因组体外转化NIH/3T3细胞,以评价HPV-16的转化活性。方法将HPV-16基因组正向括人pSV2/neo质粒,构建成pSV2-neo/HPV-16真核细胞表达质粒;用磷酸钙转染法,将其导人体外培养的NIH/3T3细胞;对经转化的细胞进行G418选择培养和核酸杂交分析。结果经选择培养获得了具有恶性表型的转化细胞,其主要表现为接触性抑制消失和非锚地依赖性生长;核酸杂交证明,转化细胞内含有HPV—16DNA序列。结论HPV—16基因组具有体外转化NIH/3T3细胞的活性。  相似文献   

14.
人乳头瘤病毒致癌机制的研究进展   总被引:1,自引:0,他引:1  
人乳头瘤病毒(HPV)是一种常见的小DNA双链病毒,主要感染上皮黏膜细胞,引起良性乳头瘤病变和恶性肿瘤,高危型HPV在子宫颈癌组织中的检出率可高达90%以上。E6和E7是HPV最重要的两个病毒癌基因,在病毒整合入宿主细胞基因组后可持续表达,并分别与细胞内重要的抑癌基因p53和pRb的蛋白产物相互作用,阻遏其对细胞增殖分化的负调控,从而诱发细胞恶性转化。此外,E6和E7表达还可影响基因组稳定性。  相似文献   

15.
体外长期培养人转化角朊细胞系的生物学特征   总被引:4,自引:2,他引:2  
目的:研究SV40病毒转化的人角朊细胞系在体外长期培养过程中的细胞生物学特征。方法:采用细胞培养法观察转化细胞系的克隆形成率、细胞生命曲线以及血清、Ca^+对其生长分化的影响。结果:与正常角朊细胞相比,转化角朊细胞系于体外形成克隆所需的最低接种密度有所降低,但接触抑制特性仍未丧失。转化细胞在体外已传代培养25代,对血清的依赖性降低,可被Ca^2+诱导分化而形成细胞膜片结构。结论:本研究所观察的转化  相似文献   

16.
目的:应用E2基因缺失的检测了解宫颈病变中HPV16病毒染色体的存在状态,探讨其与宫颈癌的关系.方法:应用多重聚合酶链反应(PCR)对HPV16感染标本将其E2基因的C端、N端、铰链区分别与E6基因同时进行扩增,应用Scion Image 4.0软件对E2基因、E6基因电泳条带面积灰度值进行半定量分析,判定HPV16是...  相似文献   

17.
目的 通过构建和筛选持续表达HPV16E5的细胞SiHa/16E5,探讨HPV16E5对宫颈癌SiHa细胞的作用及机理.方法 利用pEGFP-C1构建HPV16型E5的正义全长真核表达载体并稳定转染SiHa细胞;利用RT-PCR和Western印迹技术检测转染前后E5和P21基因的mRNA和GFP+E5和P21蛋白的变化;利用MTT法检测SiHa细胞稳定转染后的增殖活性;利用软琼脂克隆形成和裸鼠成瘤实验分别在体内外验证了SiHa/16E5细胞的致瘤情况.结果 稳定转染携带.HPV16全长E5基因的质粒后,SiHa细胞中E5基因的mRNA和相应蛋白表达明显升高,而P21的表达则明显下调;MTT结果 显示稳定转染后细胞的增殖活性与转染空载体细胞和未转染细胞比较明显增高(P<0.05);软琼脂克隆形成结果 示:SiHa/16ES细胞组的可隆形成数为33.4±1.6,与空质粒对照组细胞(15.1±3.1)及未转染组细胞(16.3±2.5)比较差异有统计学意义(P<0.05);裸鼠成瘤实验结果 显示,4个实验组在共20 d的观察中,SiHa/16E5组裸鼠成瘤明显快于其他3个对照组(P<0.05).结论 HPV16 E5可降低宫颈癌SiHa细胞中P21的表达,加强宫颈癌SiHa细胞增殖和成瘤效应.  相似文献   

18.
Infection by certain human papillomaviruses (HPV), most notably HPV types 16 and 18, is the major risk factor for cervical cancer. Worldwide, this disease represents the second most frequent malignant tumor in women; thus, there is urgent need for efficient therapy and prevention. The natural history of cervical cancer and its precursors (cervical intraepithelial neoplasias), as well as animal experiments, strongly suggest that the immune system controls both the primary infection (by neutralizing antibodies directed against the major structural protein L1) and the progression of the disease (via cytotoxic T cells specific for the viral oncoproteins expressed in transformed cells, e.g., E7). By the expression of an HPV 16 L1E7 fusion protein, we have generated chimeric virus-like particles (CVLP). Immunization of mice with CVLPs induces neutralizing antibodies directed against L1 virus-like particles (devoid of the E7 portion) and E7-specific T cells as measured in vitro. Vaccinated animals are protected against tumor growth following inoculation of syngeneic HPV 16-transformed cells. In addition, we observed a therapeutic effect of vaccination on pre-existing tumors. This data allowed us to conclude that CVLPs are suitable for prevention and therapy of HPV infection. A vaccine based on HPV 16 L1E7 CVLPs is currently under development.  相似文献   

19.
目的 :探讨人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )E7DNA疫苗诱导机体特异性细胞免疫应答的情况。方法 :采用分子克隆技术 ,构建HPV16野生型E7基因的真核表达重组体 ,将其转化大肠杆菌JM10 9进行筛选 ,通过限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析 ,证明重组质粒中目的基因插入片段及载体DNA大小、方向、插入位点均正确 ,获得HPV16E7DNA疫苗 ,将E7DNA疫苗经皮内注射免疫动物 ,MTT比色法体外检测特异性淋巴细胞增殖反应。结果 :野生型E7DNA疫苗免疫组脾淋巴细胞在体外受到E7蛋白的再次刺激后出现特异性淋巴细胞增殖反应。结论 :野生型E7DNA疫苗可诱导特异性的细胞免疫应答 ,皮内注射HPVDNA疫苗是一种简便有效的免疫接种途径  相似文献   

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