网织红细胞胞质因子调控肿瘤细胞基因表达的核酸杂交分析 Ⅰ.β-珠蛋白基因的表达

本实验采用核酸杂交技术,以小鼠和人β-珠蛋白基因为探针,分析了同种和异种细胞的胞质体杂交细胞中β-珠蛋白基因的表达状态。结果发现小鼠β-珠蛋白基因转录物不但在同种杂交(小鼠网织红细胞RM×小鼠骨髓瘤BW)的胞质体杂交细胞(BW-RM)中出现,而且在兔网织红细胞与小鼠骨髓瘤的异种杂交细胞(Bw-RR)中亦有表达。同样在小鼠网织红细胞与人浆细胞瘤(HMy)的异种胞质杂交细胞(HMy-RM)中出现人β-珠蛋白基因产物。说明网织红细胞胞质因子可激活原来处于不活动状态的肿瘤细胞β-珠蛋白基因并使之表达.兔和小鼠的胞质因子有同样的调节基因表达的作用而似无种属特异性。对网织红细胞胞质因子调控基因表达和肿瘤细胞恶性逆转的机理和分子生物学基础进行了讨论。     

胞质因子对肿瘤细胞恶性的调控研究——小鼠骨髓瘤细胞与网织红细胞胞质体的胞质杂交实验

本文选用无细胞核而富含珠蛋自mRNA的正常小鼠网织红细胞与骨髓瘤细胞系中的BW胸腺淋巴肉瘤细胞系、NS-1浆细胞癌细胞系及P388淋巴瘤细胞等分别进行胞质杂交实验,以研究胞质因子调控肿瘤细胞恶性的可能性。实验结果表明3种淋巴瘤细胞在并入网织红细胞胞体后所形成的杂交细胞呈现下列去恶性化特征:1)杂交细胞出现组织化学反应及超微结构形态改变;2)细胞分裂指数及生长速度明显下降;3)作异种移植至裸鼠后丧失发生肿瘤能     

兔网织红细胞胞质因子对小鼠骨髓瘤细胞恶性调控的研究

以无细胞核的兔网织红细胞与小鼠骨髓瘤细胞BW(胸腺淋巴肉瘤)及SP2/0(浆细胞瘤)分别进行异种杂交。实验结果表明杂交后形成的二种胞质杂交细胞(BW-RR及SP 2/0-RR)均呈现下列去恶性分化特征;①细胞分裂指数、~3H-TdR标记指数及生长曲线明显下降。其中SP2/0-RR的核分裂活动受到明显的抑制;②在软琼脂培养中不形成集落;③异种移植至裸鼠不长瘤;④染色体数量减少,众数及畸变率下降;⑤出现正常分化的珠蛋白基因产物血红蛋白和HGPRT基因的酶产物,珠蛋白探针分子杂交实验证明有珠蛋白基因的表达。为不同种属红细胞胞质因子调控肿瘤细胞恶性提供了证据。论文对胞质因子调控基因表达、恶性逆转及其在红细胞发生过程中自然去核的物质基础等问题进行了讨论。     

网织红细胞胞质因子调控肿瘤细胞基因表达的核酸杂交分析 Ⅱ.myc癌基因的表达状态

本实验用Northern杂交方法,以c-myc癌基因为探针,对人和小鼠骨髓瘤细胞以及杂交后的同种和异种胞质体杂交细胞和异种杂交细胞进行了癌基因表达的核酸分子杂交分析。结果表明,在小鼠-小鼠,小鼠-兔及人-小鼠的胞质体杂交细胞(BW-RM,BW-RR,HMy-RM)中均未检测到myc癌基因的表达产物。但自15代以后开始出现微弱或可测的表达活性,并随传代而有上升的趋向。同样,在小鼠浆细胞瘤(Sp2/o)与大鼠有核红细胞(ER)的异种杂交中,杂交细胞(SpER)的第4代和第7代细胞中亦未检查到myc基因转录物。表明细胞杂交后,myc基因受到了抑制。这种抑制作用似无种属特异性。这一结果提示红系细胞内“胞质因子”对肿瘤细胞原来活化的myc基因具有抑制作用,并与杂交细胞的恶性下降有关。论文对胞质因子对癌基因表达的调控作用及其分子生物学机理进行了讨论。     

网织红细胞与骨髓瘤细胞杂交的胞质杂交体细胞血红蛋白的PAGE电泳分析

小鼠网织红细胞(RM)×人早幼粒白血病细胞突变株(Hb-60-AR);兔网织红细胞(RR)×小鼠BW-胸腺淋巴肉瘤细胞(BW5147);大鼠骨髓有核红细胞(RNR)×小鼠SP2/0浆细胞瘤细胞等不同异种杂交组合的胞质体杂交细胞珠蛋白基因产物血红蛋白的PAGE电泳分析,结果表明在正常状态下检测不到血红蛋白的肿瘤细胞,一旦与网织红细胞或有核红细胞融合后,则能持续地出现血红蛋白,进一步证明哺乳类红细胞胞质因子具有调节基因活动,激活珠蛋白基因表达的作用,不同种属红细胞胞质因子似无种属特异性。     

红细胞分化去核因子：哺乳类红细胞终末分化／肿瘤抑制 …

本文报道哺乳类红细胞终末分化去核因子（ＥＤＤＦ）调控恶性骨髓瘤细胞的分化以及与ＥＤＤＦ相关的基因克隆的系列研究结果。以不同分化期哺乳类红细胞为研究对象,观察红细胞自然排核前后的细胞形态变化和与之互为对应的物质代谢的改变,分析ＥＤＤＦ与终末分化、核浓缩及自然排核的可能关系;用自建的红细胞质体杂交模型,分别对红白血病和非红系的骨髓瘤细胞进行同种和异种的细胞杂交实验以验证ＥＤＤＦ的作用规律。结果表明,哺     

抗B7-1功能性单克隆抗体对B淋巴瘤细胞生长的抑制作用

目的　分析抗B7- 1功能性单克隆抗体对表达B7分子的人恶性淋巴瘤细胞株Raji和Daudi细胞体外生长的抑制作用及其可能机制。方法　采用免疫荧光标记和流式细胞仪分析肿瘤细胞的B7- 1分子表达 ;以不同浓度抗B7- 1功能性单克隆抗体 ,加入体外培养细胞中 ,经细胞计数和MTT法 ,观察单克隆抗体对肿瘤细胞体外生长的作用。结果　Raji和Daudi细胞均表达B7- 1分子 ,表达阳性百分率分别为 92 .7%和 89.2 % ;抗B7- 1单克隆抗体浓度在 5 μg/ml时就对这两种细胞株有显著的抑制作用 ,并随浓度增高而增强。 结论　抗B7- 1单克隆抗体对高表达B7- 1分子的人恶性淋巴瘤细胞体外生长有明显的抑制作用 ,这种抑制作用是通过诱导肿瘤细胞的凋亡所致     

HIF-1α和C-MYC基因在肿瘤发生过程中的研究

HIF具有促进肿瘤血管的增生、促进肿瘤细胞在相对缺氧状态下的能量供应、促进红细胞生成、细胞周期调控、肿瘤细胞凋亡、侵袭和转移以及放疗化疗抵抗性等方面促进肿瘤的作用.myc可促进细胞分裂、参与细胞凋零、具有转化细胞的能力、并具有与染色体DNA结合的特性,在调节细胞生长、分化及恶性转化中发挥作用.     

肝细胞癌Hepg2动物腹水模型的建立及其腹水微环境对肿瘤细胞影响的研究

目的肝癌是人体最常见的恶性肿瘤之一,特别是已有腹水产生的晚期肝癌,肿瘤微环境可促进肿瘤细胞恶性进展,缩短患者的生存时间。本文旨在建立一个伴有腹水产生、以荧光示踪显示肿瘤微环境细胞的肝癌原位移植动物模型,用于研究肿瘤微环境细胞促进肿瘤细胞恶性进展的机理。方法将Hepg2肝癌细胞,肝脏原位接种于绿色荧光裸小鼠,从动物模型的腹水中单克隆得到一株肝癌细胞(Hepg2-1),将其与亲本Hepg2细胞进行细胞生物学及分子生物学的比较。结果接种的10只小鼠肿瘤晚期都有大量血性腹水形成及腹腔广泛转移;Hepg2-1细胞与亲本Hepg2相比,细胞增殖速度、侵袭和迁移能力均明显强,分子检测结果表明,Oct4、Nanog和CCN的表达明显升高,AFP的表达无明显差异。结论成功建立了肝癌Hepg2原位移植小鼠腹水模型,借助于荧光示踪能区分出肿瘤细胞及宿主来源的肿瘤微环境细胞。肿瘤细胞在Oct4、Nanog和CCN调控下变得更加恶性,这为进一步研究肿瘤微环境促进肿瘤恶性进展的细胞分子生物学机制和靶分子干扰,奠定了动物和细胞实验基础。     

异种基质金属蛋白酶-2肿瘤细胞疫苗的制备与功能研究

目的 构建异种基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)肿瘤细胞疫苗，初步探讨疫苗的功能。方法 将鸡MMP-2转染到CT26细胞内制成肿瘤细胞疫苗，用MTT[四甲基偶氮唑盐，3-(4，5-dimetylthiazol-2-y1)-2，5-diphenyltetrazolium bromide3比色法检测转染后的细胞活性，在小鼠体内做疫苗的致瘤性实验和保护性实验。结果 用RT-PCR挑选出MMP-2表达量最高的细胞株作为研究对象。通过MTT比色法发现转染虽然增加了肿瘤细胞内MMP-2的表达，但是并没有改变肿瘤细胞的生长趋势。经过致瘤性实验和保护性实验，还初步发现疫苗可以起到抑制肿瘤生长和延长动物生存时间的作用。结论 异种基质金属蛋白酶-2肿瘤细胞疫苗构建成功，并且具有抗肿瘤的作用。     

内毒素血症时小鼠肺泡巨噬细胞CD14和清道夫受体的表达

目的 探讨内毒素肺损伤时,肺泡巨噬细胞逐步由免疫防御型转变为效应型的分子机制。方法 建立内毒素肺损伤动物模型,免疫组化法观察肺泡巨噬细胞ＣＤ１４及清道夫受体（ＳＲ）表达的变化,并辅以计算机图像分析;同时检测肺体指数,肺组织的病理变化及动物存活率。结果 内毒素对ＣＤ１４的表达呈时间依赖性升高,但加大剂量并未使其进一步增加;ＳＲ呈时间及剂量依赖性降低。肺泡巨噬细胞ＳＲ、ＣＤ１４的表达变化与小鼠肺损伤程     

网织红细胞与骨髓瘤缺陷株细胞杂交前后HGPRT酶基因产物的测定

本研究建立了HGPRT酶的测定方法,对自然去核的哺乳类网织红细胞与小鼠骨髓瘤及人肿瘤突变型细胞杂交前后的HGPRT基因产物进行测定结果表明:①自然去核后的兔和小鼠网织红细胞质中含有高活性的HGPRT酶,其活性浓度与有细胞核的人早幼粒白血病细胞HL-60及人胃癌823细胞相当;②无核和缺失HGPRT酶基因定位的X染色体的上述网织红细胞分别与HGPRT阴性的小鼠骨髓瘤Bw及人早幼粒白血病的HL-AR突变株细胞杂交后,获得HGPRT阳性的胞质体杂交细胞。这些杂交细胞及其子代均出现中等阳性的HGPRT酶活性。提示用无细胞核而含基因产物的胞质体可能激活或诱导宿主细胞相应基因进行表达。     

槲皮素对BGC-823胃癌细胞caspase-3、Bcl-2表达影响与抑癌作用研究

目的：研究槲皮素（quercetin,QUE）抑制人胃癌BGC-823细胞增殖和诱导凋亡的作用。方法：采用四甲基噻唑氮蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）比色法检测不同终浓度的QUE对BGC-823细胞增殖的影响及其细胞毒活性,流式细胞术（FCM）对不同浓度的QUE作用24h的BGC-823细胞进行凋亡检测及其周期分析．用免疫组化法测定Bcl-2、caspase-3的表达率。结果：QUE对体外培养的BGC-823细胞具有明显的增殖抑制作用,在30～120μmol／L范围内可显著抑制BGC-823细胞增殖,且呈剂量-时间依赖性。FCM检测后,BGC-823细胞周期阻滞于S期,药物浓度呈正相关。经QUE处理后BGC-823细胞株caspase-3蛋白表达明显增加,Bcl-2蛋白表达降低。免疫组化检测表明,用药组Bcl-2蛋白的表达下降,easpase-3蛋白的表达率增强,与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：QUE诱导BGC-823细胞发生凋亡,使细胞周期阻滞于S期,抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调Bcl-2、上调caspase-3蛋白的表达有关。     

Cell-specific expression of the diphtheria toxin A-chain coding sequence induces cancer cell suicide

Objective To test whether the diphtheria toxin A (DT-A) chain coding sequence linked to murine immunoglobulin κ-light chain (Ig κ) promoter and enhancer have selective cytocidal effects on Ig κ producing cells.Methods The diphtheria toxin A gene or β-galactosidase (β-gal) gene were linked to a murine Ig κ promoter and enhancer to construct pcDNA3Ig κDTA or pcDNA3Ig κLacZ plasmids.These plasmids were transfected into Ig κ producing or non-producing cells by the liposome-coated DNA method.Expression of β-gal activity and effects on cell growth of transfected cells were assessed.Results The β-gal gene, under the control of cytomegalovirus (CMV) promoter, can express in all cell lines.Expression of β-gal under the control of the Ig κ promoter was detected only in the Ig κ producing cell line, CA46.Expression of β-gal was greatly suppressed when cotransfected with pcDNA3Ig κDTA in CA46 cells.Cell growth of CA46 cells transfected with pcDNA3Ig κDTA plasmid was significantly inhibited compared with CA46 cells transfected with pcDNA3Ig κLacZ.Conclusion Selective killing of Ig κ producing cells can be attained by introducing the diphtheria toxin A gene under the control of Ig κ promoter and enhancer.     

bcl-2基因过表达致急性髓系白血病对柔红霉素耐药机制的初步探讨

目的 探讨bcl-2基因过表达导致人急性髓系白血病对柔红霉素耐药的机制.方法 通过分子克隆技术构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,将其转染人急性髓系白血病U937细胞,分正常对照组、空载体对照组、转染组,与柔红霉素培养24 h,采用CCK-8法检测细胞增殖率,Western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化,从而比较转染bcl-2基因前后,U937细胞对柔红霉素敏感性的变化.结果 成功构建质粒pcDNA3.1(+)/bcl-2,转染入U937细胞,PCR证实其转染效果;CCK-8法检测结果显示U937/ bcl-2组细胞存活率显著高于对照组和空载体对照组;bcl-2基因过表达降低caspase-3片段的裂解活化,降低U937细胞对柔红霉素的敏感性.结论 bcl-2过表达抑制caspase-3激活、抑制柔红霉素杀伤U937细胞,导致细胞对柔红霉素耐药.bcl-2可作为临床治疗急性髓系白血病的靶点.     

腺病毒介导的p27kip1基因转移对食管癌细胞及裸鼠移植瘤生长的抑制作用

目的 :研究p2 7kip1基因转移对食管癌的体内、外抑制作用 ,并探讨其抑癌机制。方法 :①构建携带人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Ad p2 7kip1) ;②将Ad p2 7kip1转染人食管癌细胞Eca970 6 ,MTT法、3 H TdR和3 H Leucine掺入试验检测对细胞增殖的影响 ,流式细胞仪 (FCM)、DNA片段分析检测对细胞周期和凋亡的影响 ,TRAPPCR -ELISA法检测端粒酶活性 ,免疫细胞化学法及Westernblotting法检测p2 7kip1和Survivin的表达 ;③Ad p2 7kip1直接注射入人食管癌裸鼠移植瘤中 ,观测抑瘤效应 ,并检测p2 7kip1和Survivin的表达。结果 :①Ad p2 7kip1转染食管癌细胞后 ,细胞增殖明显受抑制 ,G0 /G1期细胞比例增加 ,并出现明显的亚二倍体凋亡峰和特征性的凋亡梯状条带 ,细胞端粒酶活性降低 ,p2 7kip1表达增强 ,Survivin表达降低 ;②采用p2 7kip1基因治疗 ,食管癌裸鼠移植瘤生长明显受抑制 ,肿瘤生长抑制率达 6 4 .1% ,移植瘤中p2 7kip1表达增强 ,Survivin表达降低。结论 :p2 7kip1基因转移对食管癌具有较显著的体内、外抑制作用 ,其机制是增强p2 7kip1表达、抑制Survivin表达 ,使细胞产生G1期阻滞 ,抑制端粒酶活性 ,并诱导凋亡 ,表明该基因疗法是食管癌治疗的新途径。     

芪玉三龙汤对肺癌移植瘤小鼠PI3K/Akt/mTOR通路PI3K、Akt、mTOR表达的影响

目的 研究芪玉三龙汤对小鼠皮下移植瘤生长及对PI3K/Akt/mTOR信号通路调节的影响。方法 采用Lewis肺癌细胞培养移植法复制肺癌荷瘤小鼠模型,荷瘤成功后随机分为模型组,化学治疗组,芪玉三龙汤高、中、低剂量组,联合组;观察小鼠的生存状态,绘制肿瘤生长曲线,计算抑瘤率;Western blot法检测荷瘤小鼠肿瘤组织PI3K、Akt、mTOR蛋白表达。 结果 芪玉三龙汤高剂量组、联合组生存状态优于化学治疗组;芪玉三龙汤对肺肿瘤具有温和的抑制作用,其高剂量抑制肿瘤生长作用较优,但量效关系不明显,其与顺铂联用无明显增效作用;芪玉三龙汤可以下调PI3K、Akt和mTOR表达水平,和顺铂联用对下调关键分子Akt的表达具有明显的协同作用。 结论 芪玉三龙汤对肺癌移植瘤的抑制作用可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路关键分子有关,与化学治疗药联用可协同下调关键蛋白Akt的表达。     

DcR3基因对胰腺癌裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响

目的探讨RNA 干扰沉默诱骗受体-3（DcR3）对人胰腺癌细胞裸鼠移植瘤化疗敏感性的影响及其可能机制。方法取对数生长期的AsPC-1 细胞1×106个/ml,接种于5 周龄裸鼠右后肢腹股沟,当皮下肿瘤直径为8 mm 左右,随机分为4 组（ n=10）：对照组、化疗组、阴性质粒+ 化疗组、DcR3 siRNA+ 化疗组。观察DcR3 siRNA联合化疗药物对人胰腺癌AsPC-1细胞裸鼠移植瘤的治疗效果。应用ELISA和Western blot检测DcR3 蛋白的变化;TUNEL 分析肿瘤细胞凋亡;Western blot 和RT-PCR 检测FasL、Caspase-8 和Caspase-3 等凋亡因子的表达。结果化疗组、阴性质粒+ 化疗及DcR3 siRNA+ 化疗组均可抑制移植瘤的生长,与对照组比较,3 组抑瘤率平均值分别为（35.87±4.58）%、（40.68±4.16）%和（90.25±2.53）%,4 组间差异有统计学意义（F =47.736,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组抑瘤率较化疗组增加;对照组、化疗组、阴性质粒+ 化疗以及DcR3 siRNA+ 化疗组移植瘤重量平均值分别为（0.95±0.03）、（0.63±0.04）、（0.67±0.02）和（0.17±0.06）g,4 组间差异有统计学意义（F =85.531,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组瘤重较化疗组减轻;对照组、化疗组、阴性质粒+化疗组、DcR3 siRNA+化疗组凋亡率平均值分别为（6.3±2.21）%、（14.8±2.65）%、（14.5±3.06）%和（54.6±3.23）%,4 组间差异有统计学意义（F =104.225,P =0.000）,DcR3 siRNA+ 化疗组凋亡率较化疗组增加;DcR3siRNA+化疗组的FasL、Caspase-8 和Caspase-3 蛋白表达较其他各组上升（P =0.000）。结论沉默DcR3 可激活FasL/Caspase 凋亡途径,促进细胞凋亡,增加胰腺癌细胞移植瘤对化疗的敏感性。     

Bcl-2、Bak及caspase-9、3在维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞凋亡中的作用

目的探讨维生素E琥珀酸酯(VES)对体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。方法以体外培养的人胃癌SGC-7901细胞为肿瘤模型,给予不同浓度水平的VES处理不同时间后,采用四甲偶氮唑盐比色(MTT)法观察VES对人胃癌细胞的生长抑制作用;用Annexin-V-FITC方法检测VES对胃癌细胞的凋亡诱导作用;采用Western blotting方法检测VES处理后的胃癌细胞中Bcl-2和Bak蛋白表达及caspase-9、caspase-3酶原的表达。结果(12.5～50.0)μmol/L的VES作用于人胃癌细胞24h后就可以抑制胃癌细胞的生长,呈明显的剂量依赖关系;Annexin-V-FITC和PI双染流式细胞仪检测结果表明,50μmol/LVES处理SGC-7901细胞12h后即可以引起细胞凋亡,且随作用时间的延长凋亡越明显。Western blotting结果显示,VES可以调节胃癌细胞中与凋亡相关的Bcl-2和Bak蛋白的表达,同时促进caspase-9、caspase-3酶原的裂解与活化。结论调节Bcl-2和Bak蛋白的表达,并裂解caspase-9、caspase-3是VES在体外发挥对人胃癌细胞的生长抑制和凋亡诱导作用的可能机制之一。