腺病毒介导的eNOS基因转移时血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因转染血管平滑肌细胞（VSMC）的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC，应用聚合酶（PCR），逆转录PCR（RT－PCR）技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率；应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果：外源性eNOS基因成功导入了VSMC；VSMC中有eNOS基因mRNA的表达；外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后，可显著抑制VSMC的生长，DNA合成减少。结论：腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC，并可有抑制细胞生长。     

腺病毒介导的eNOS基因转移对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的 :探讨腺病毒载体介导的内皮型一氧化氮合酶 (eNOS)基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC)的效率及其对冠状动脉旁路移植术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 :构建带有eNOS基因的复制缺陷型重组腺病毒转染体外培养的VSMC ,应用聚合酶链 (PCR)、逆转录PCR(RT PCR)技术和免疫组化法检测外源基因转染及表达效率 ;应用MTT法和流式细胞仪检测eNOS基因对VSMC的抑制作用。结果 :外源性eNOS基因成功导入了VSMC ;VSMC中有eNOS基因mRNA的表达 ;外源性eNOS蛋白呈高效表达。eNOS基因重组腺病毒载体转染细胞后 ,可显著抑制VSMC的生长 ,DNA合成减少。结论 :腺病毒介导的eNOS基因可高效地转染VSMC ,并可有效抑制细胞生长。     

P53病毒增强型质粒-脂质体复合物对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的:研究腺相关病毒增强型质粒载体介导的p53基因对血管平滑肌细胞（VSMC）的作用,探讨其用于防治冠状动脉旁路术后移植血管再狭窄等心血管内外科疾病的可能性。方法：构建了野生型p53基因的腺相关病毒增强型质粒表达载体,通过阳离子脂质体Dosper介导,体外转染杂VSMC。聚合酶链技术检测的基因表达。应用细胞计数及DNA合成分析技术,测定p53基因对VSMC增殖的抑制效应。结果：外源性p53基因可有效导入VSMC并表达;p53基因导入可显著抑制细胞生长,DNA合成减少。结论：野生型p53基因腺相关病毒增强型质粒载体转染VSMC可有效地抑制细胞增殖。     

降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞

目的：观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ,ＣＧＲＰ）基因对人脐静脉内皮细胞的作用,探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法：构建含有ＣＧＲＰｃＤＮＡ的逆转录病毒载体,体外转染人脐静脉内皮细胞。用ＲＴＰＣＲ及放射免疫法分析检测基因表达水平。应用细胞计数及流式细胞仪观察ＣＧＲＰ基因对内皮细胞生长的影响。结果：逆转录病毒载体能有效地将外源性基因导入血管内皮细胞并稳定表达。导入ＣＧＲＰ基因可以促进内皮细胞的分裂增殖,从而加速损伤内皮的修复。结论：ＣＧＲＰ基因有可能作为动脉粥样硬化及再狭窄基因治疗的有效候选基因     

降钙素基因相关肽基因体外转染人脐静脉内皮细胞

目的 观察逆转录病毒载体介导的降钙素基因相关肽（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｇｅｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄｐｅｐｔｉｄｅ，ＣＧＲＰ）基因对人脐静脉内皮细胞的作用，探讨其应用于动脉粥样硬化和经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄基因治疗的可行性。方法 构建含有ＣＧＲＰｃＤＮＡ的逆转录病毒载体，体外转染人脐静脉内皮细胞，用ＲＴ－ＰＣＲ及放射免疫法分析检测基因表达水平，应用细胞计数及流式细胞仪观察ＣＧＲＰ基因对内皮细胞生长的     

腺病毒对内皮及成纤维细胞和血管环转染及基因表达的研究

目的：比较腺病毒对不同血管内皮及成纤维细胞的转染和对人冠状动脉搭桥动脉静脉血管的转导，为携带目的基因的腺病毒治疗血管狭窄提供更好的转染途径。方法：腺病毒Ad5CMVLacZ体外转染血管内皮细胞（HUVEC）和成纤维细胞（PA317）并间接转导入胸廓内动脉和大隐静脉血管环，运用β-半乳糖苷酶活性X－gal组织化学染色，观察转染情况，并进行动态分析。结果：腺病毒载体能使外源性基因有效地转入HUVEC、PA317及两种血管环并获得蛋白表达；两种血管环在转染10d后仍有β-半乳糖苷酶蛋白的表达，且大隐静脉有新内膜形成和中膜的增厚。结论：从细胞水平上证明腺病毒载体能将治疗性目的基因导入各种血管细胞及动静脉血管并获得表达，提示血管内膜和外膜都是腺病毒有效转染的途径；临床上无论动脉或静脉的血管狭窄都可能通过用腺病毒作为载体进行基因治疗和预防。     

基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素对血管内皮细胞的影响

目的:研究肺癌A549细胞体外转染重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因后,其产物对血管内皮细胞增殖的抑制作用。方法:体外培养肺癌A549细胞,分为3组:实验组、缺陷型腺病毒组、PBS组。以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将血管内皮抑素基因导入体外培养的肺癌A549细胞,ELISA检测外源基因内皮抑素,在体外培养的肺癌A549细胞中的表达。体外培养血管内皮细胞,以MTT法评价重组血管内皮抑素基因腺病毒(Ad.Endostatin)转染肺癌细胞后含内皮抑素的上清液对内皮细胞增殖的抑制作用。结果:ELISA检测结果:重组腺病毒介导的血管内皮抑素基因在转染的肺癌A549细胞中高效表达,在转染肺癌细胞后第1天即有内皮抑素的表达,在第3天达到高峰,5～7天后逐渐减弱。缺陷型腺病毒组及PBS组未见有表达。MTT检测结果:Ad.Endostatin转染肺癌A549细胞后表达的内皮抑素可抑制体外培养的血管内皮细胞的增殖,而缺陷型腺病毒组及PBS组对血管内皮细胞的增殖未见有抑制作用。结论:腺病毒介导的血管内皮抑素基因转染肺癌细胞表达之血管内皮抑素,能很好抑制血管内皮细胞的生长和增殖,为进一步开展肺癌基因治疗打下基础。     

磁性壳聚糖纳米介导eNOS基因转染受损平滑肌细胞初探

目的:探讨磁性壳聚糖(后简称磁聚糖)纳米载体对血管平滑肌细胞的毒性及介导内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因对受损血管平滑肌细胞的转染效率、表达及对细胞增生的影响。方法:原位共沉淀法制备磁聚糖并耦合eNOS质粒;MTT法检测磁聚糖对血管平滑肌细胞生长的毒性;分别以重组腺病毒表达载体(AdCMV-eNOS)、磁聚糖-eNOS和磁聚糖空载体在外加磁场下转染受损血管平滑肌细胞,免疫荧光染色及RT-PCR测定eNOS表达,流式细胞术检测转染效率及血管平滑肌细胞周期和凋亡情况。结果:在浓度低于20 mg.ml-1时,磁聚糖对血管平滑肌细胞的生长无明显毒副作用;磁聚糖-eNOS组转染效率[(58.7±3.6)%]较AdCMV-eNOS组[(78.1±2.5)%]低,但两组均检测到eNOS mRNA和蛋白表达,且两组受损血管平滑肌细胞G0/G1期细胞较磁聚糖空载体组明显增多(P<0.01),S/G2-M期细胞减少(P<0.01),3组的细胞凋亡无显著差异(P>0.05)。结论:正常浓度的磁聚糖对血管平滑肌细胞生长无抑制作用,该载体能成功介导eNOS基因的转染,延缓受损后血管平滑肌细胞增生周期。     

腺病毒对内皮及成纤维细胞和血管环转染及基因表达的研究

目的比较腺病毒对不同血管内皮及成纤维细胞的转染和对人冠状动脉搭桥动脉静脉血管的转导,为携带目的基因的腺病毒治疗血管狭窄提供更好的转染途径.方法腺病毒Ad5CMVLacZ体外转染血管内皮细胞(HUVEC)和成纤维细胞(PA317)并间接转导入胸廓内动脉和大隐静脉血管环,运用β-半乳糖苷酶活性X-gal组织化学染色,观察转染情况,并进行动态分析.结果腺病毒载体能使外源性基因有效地转入HUVEC、PA317及两种血管环并获得蛋白表达;两种血管环在转染10d后仍有β-半乳糖苷酶蛋白的表达,且大隐静脉有新内膜形成和中膜的增厚.结论从细胞水平上证明腺病毒载体能将治疗性目的基因导入各种血管细胞及动静脉血管并获得表达,提示血管内膜和外膜都是腺病毒有效转染的途径;临床上无论动脉或静脉的血管狭窄都可能通过用腺病毒作为载体进行基因治疗和预防.     

腺病毒载体介导肝细胞生长因子基因对冠状动脉再狭窄的预防作用

目的应用重组腺病毒载体介导的肝细胞生长因子（HGF）基因转染血管内皮细胞（VEC）及血管平滑肌细胞（VSMC），探讨HGF基因对其凋亡的诱导作用。方法以肝细胞中抽提的总RNA为模板，反转录cDNA，采用RT-PCR技术获得HGF基因，并引入酶切位点，转染大肠埃希菌，筛选阳性菌落，经酶切及测序证实后，转染腺病毒，制造病毒包涵体，经3轮扩增，制备高效表达HGF基因腺病毒载体（Ad—HGF）。以此感染VEC及VSMC，设为Ad-HGF组；再以人工合成HGF培养VEC及VSMC为阳性对照组（HGF组）；以未感染Ad-HGF的细胞为阴性对照（对照组）。并采用流式细胞仪检测缺氧情况下各组细胞的凋亡率。结果VEC的Ad—HGF、HGF组细胞凋亡率均低于对照组，差异均有极显著性意义（均P〈0．01），但VSMC的3组细胞凋亡率差异无显著性意义（P＞0．05）。结论腺病毒载体介导HGF基因感染VEC后能在缺氧情况下有效地阻止VEC发生凋亡，但不能有效抑制VSMC凋亡，提示对冠状动脉再狭窄有预防作用。     

外源性Rb基因导入对U937细胞周期和p21基因表达的影响

目的 利用RLb基因重组腺病毒载体(AdCMV-RLb)，将外源性RLb基因导入U937细胞，研究其对细胞周期、细胞凋亡及原癌基因p21表达的影响。方法 AdCMV-Rb导入U937细胞后，用流式细胞术分析细胞周期和细胞凋亡率及Rb蛋白和p21蛋白的表达；RT-PCR检测原癌基因p21的表达。结果 AdCMV-Rb可以高效导入U937细胞，RLb基因导入使U937细胞主要阻滞在G1期，细胞凋亡率在RLb基因导入24h后无明显改变，48h后凋亡率增高；Rb蛋白和p21蛋白表达增强；RT-PCR结果显示Rb基因的导入可以上调p21基因的表达。结论 外源性Rb基因的导入可以上调原癌基因p21的表达，使得U937细胞周期阻滞在G1期。     

外源性Rb基因转染对头颈肿瘤的抑制作用

目的　探讨外源性 Rb基因对头颈肿瘤的抑制作用。方法　运用携带 Rb基因的复制缺陷型腺病毒转染口腔鳞癌细胞株 0 12 ,观察其体内和体外的抑癌效果。结果　腺病毒表达载体可有效地将外源性 Rb基因转染 0 12细胞并使其表达。体内、体外抑瘤实验表明 :导入 Ad- Rb基因的肿瘤细胞 ,其细胞生长曲线明显受抑制 ,Ad- Rb基因治疗组裸鼠肿瘤生长最为缓慢 ,与 DL312和 PBS对照组比较有显著性差异 (P<0 .0 5 )。结论　腺病毒介导的外源性 Rb基因可有效地转染入口腔鳞癌细胞株 ,并抑制其生长。     

p16β基因重组腺病毒质粒的构建及对喉癌细胞的作用

目的探讨野生型p16β对体外喉癌Hep-2细胞周期信号传导的干预作用。方法以重组腺病毒为载体，构建p16β的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β质粒，并在293细胞中包装、纯化。将已纯化的重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β在体外转染Hep-2喉癌细胞，采用MTT实验、流式细胞术（FCM）、免疫组化、Western blot等实验手段检测Hep-2细胞的抑制／杀伤作用及其细胞周期信号、DNA含量、细胞凋亡率的变化；检测P16蛋白的表达和Hep-2细胞的超微结构变化。结果本研究成功地构建和制备了高滴度的AdEasy-GFP-p16β重组腺病毒，并高效地转移到Hep-2细胞内和表达P16蛋白，有效地抑制了Hep-2细胞的生长。被转染的Hep-2细胞被有效地阻滞在G0／G1期，提高了转染细胞的凋亡率。结论重组腺病毒AdEasy-GFP-p16β能高效感染Hep-2细胞，表达P16蛋白；有效抑制Hep-2细胞增殖；干预Hep-2细胞周期的信号传导机制和细胞周期，诱导凋亡，从而抑制肿瘤细胞增殖活性。     

携带野生型PTEN基因的重组腺病毒治疗子宫内膜癌的体外研究

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染子宫内膜癌细胞后的表达,并探讨其对肿瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用及机制.方法:细菌内同源重组方法构建Ad-PTEN,体外转染PTEN基因突变的子宫内膜腺癌RL95-2细胞中,X-gal染色检测转染效率.应用RT-PCR、Western印迹、细胞免疫组化检测Ad-PTEN在RL95-2细胞中的转录及表达; 应用细胞计数、MTT实验, 观察Ad-PTEN对RL95-2细胞生长的影响;应用光镜、透射电镜观察外源性PTEN基因表达对RL95-2细胞形态学及超微结构的影响;应用流式细胞分析仪(FCM)检测Ad-PTEN对RL95-2细胞周期分布的影响、凋亡诱导作用及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶casapase-3的激活.结果:外源性野生型PTEN基因经腺病毒介导成功转入RL95-2细胞,3种方法均检测出有PTEN mRNA及PTEN蛋白的表达,当感染复数(MOI)为50时,体外转染效率达到100%.Ad-PTEN显著抑制RL95-2细胞生长并诱导其凋亡.此外, Ad-PTEN还能诱导RL95-2细胞周期G0/G1期阻滞以及caspase-3的激活.结论:重组腺病毒Ad-PTEN是高效的基因转移系统,能将PTEN目的基因转移到丧失该基因功能的子宫内膜癌RL95-2细胞中,对RL95-2细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,其机制可能包括细胞周期G0/G1阻滞及caspase-3 蛋白酶的激活.     

人K562细胞糖皮质激素受体基因阻断模型的建立

目的 利用腺病毒载体介导的RNAi技术，建立糖皮质激素受体基因阻断的人K562细胞模型。方法 将针对糖皮质激素受体发挥RNAi效应的合成寡核苷酸序列连入含有绿色荧光蛋白基因的腺病毒穿梭质粒pRNAT-H1.1/Adeno中，在含有pAdEasy-I病毒骨架的BJ5183大肠菌内进行同源重组；重组体通过脂质体介导转染293T细胞，并在293细胞内包装为具有感染能力的病毒颗粒，通过反复感染扩增病毒以达感染靶细胞的适当滴度，通过绿色荧光表达来监测腺病毒扩增；应用Western blot法检测人K562细胞感染病毒后糖皮质激素受体蛋白的表达。结果 重组腺病毒穿梭质粒psiGR/Adeno和重组腺病毒pAdEasy-siGR的成功构建；转染腺病毒载体的293T细胞表达绿色荧光，随着时间逐渐增强并且出现明显的细胞病变效应，经过3轮扩增，病毒达到合适的滴度；受腺病毒感染的K562细胞内糖皮质激素受体蛋白表达明显降低。结论 可以成功构建针对糖皮质激素受体基因的RNAi腺病毒载体，为进一步研究糖皮质激素受体的生物学功能奠定基础。     

人SMOC1重组腺病毒载体的构建及其在主动脉瓣间质细胞中的表达

目的:利用AdEasyTM vector system构建携带人SMOC1基因的重组腺病毒表达载体,感染人主动脉瓣间质细胞(hAVICs)并检测外源性SMOC1在细胞中的表达和对细胞增殖的影响?方法:用PCR的方法扩增SMOC1 cDNA,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并测序鉴定?经NotⅠ和XhoⅠ双酶切后接入pShuttle-CMV穿梭载体,构建重组腺病毒的穿梭质粒pShuttle-CMV-SMOC1?将经PmeⅠ线性化的pShuttle-CMV穿梭载体与pAdEasyTM DNA电穿孔共转化BJ5183重组细菌,获取重组腺病毒质粒pAdEasy-SMOC1,再将经PacⅠ线性化的重组病毒骨架质粒转染HEK293A包装细胞,包装并扩增重组腺病毒(Ad-SMOC1)?用Ad-SMOC1感染hAVICs,以Western blot法和免疫荧光染色法检测重组SMOC1在hAVICs中的表达与定位,用MTS法检测SMOC1对主动脉瓣间质细胞增殖的影响?结果:成功构建并包装表达SMOC1蛋白的重组腺病毒,该重组腺病毒在体外能有效感染hAVICs并高表达SMOC1蛋白,且其介导表达的SMOC1蛋白主要定位于hAVICs的胞浆和胞膜上,MTS分析表明重组SMOC1能够显著促进主动脉瓣间质细胞的增殖? 结论:成功地构建了携带人SMOC1基因的重组腺病毒,并证实SMOC1具有促进增殖的作用?本研究为进一步研究SMOC1在瓣膜间质细胞中的作用奠定了实验基础?     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.