药物胚胎毒性体外试验的研究进展

胚胎是反映环境中有害因素影响的敏感生物标志物，胚胎毒性研究对环境保护、物种质量和数量的保证具有重要的意义。因此在强调可持续发展的当今社会，胚胎毒性研究受到越来越多的重视和关注。目前常用的胚胎毒性检测方法有体内胚胎毒性试验和体外胚胎毒性试验及流行病学调查。本文主要对体外胚胎毒性试验的研究进展进行综述，分别介绍了细胞体外培养法、啮齿类动物胚胎培养法、鸡胚培养法、两栖动物非洲爪蟾胚胎培养法、器官体外培养等方法。通过这些方法可以对待测化合物的胚胎毒性进行初筛，为进一步的体内胚胎毒性研究奠定基础。     

基于妊娠期应用中药安全性评价体系探讨黄芩的胚胎毒性

[目的] 利用妊娠期应用中药安全性评价体系,应用胚胎干细胞实验(EST)方法,通过对中药-含药血清-胚胎蓄积组分的综合评价,揭示黄芩的胚胎毒性,验证妊娠期应用中药安全性评价体系的客观性.[方法]分别将胚胎干细胞D3系(ES-D3)和胚胎成纤维细胞(Balb/c 3T3)在不同浓度黄芩培养液和20%黄芩含药血清培养液中培养,噻唑蓝(MTT)法检测细胞活性,绘制细胞生长曲线,分别计算50%的ES细胞和3T3细胞增殖受抑制的黄芩浓度,即IC₅₀D3和IC₅₀3T3.利用悬滴-悬浮-贴壁方法,体外培养ES细胞向心肌细胞分化,实时定量PCR(Q-PCR)方法检测肌球蛋白重链基因(β-MHC)的表达量,计算50%的ES细胞分化受抑制的黄芩浓度,即ID₅₀D3.利用生物统计公式,预测黄芩及其含药血清的胚胎毒性.[结果]黄芩的IC₅₀D3、IC₅₀3T3、ID₅₀D3分别为25.58、42.20、0.28 μg/mL,预测其具有强胚胎毒性.低、高剂量黄芩含药血清对3T3细胞和ES细胞增殖均呈现抑制作用,ES细胞分化为心肌细胞β-MHC表达量为空白血清表达量的32.5%.[结论]黄芩存在胚胎毒性,应用中药-含药血清的综合评价方法,能够客观准确评价中药的胚胎毒性.     

体外诱导小鼠胚胎干细胞血管形成

目的探讨体外定向诱导胚胎干细胞向内皮细胞分化的条件,模拟体内血管生成和血管新生过程,为研究新血管的形成提供一种新思路.方法体外培养小鼠胚胎干细胞诱导形成胚胎小体,将11 d的胚胎小体种植到胶原中诱发出芽性血管新生;通过免疫组织化学染色方法检测胚胎小体及其出芽向内皮细胞和功能血管的分化.结果胚胎干细胞在体外能自发形成胚胎小体,其内部含有血管样结构,并伴有平滑肌的分化;种植到胶原中的胚胎小体能再现出芽性血管新生.结论胚胎干细胞在体外不但能定向分化成内皮细胞,还能再现体内血管生成、血管新生及动脉生成过程.     

利用细胞饲养层分离培养大鼠胚胎干细胞

目的 从大鼠的早期胚胎分离和培养胚胎干细胞.方法收集大鼠的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,5～6d后取隆起生长的内细胞团块分离后再培养,观察集落的生长情况,并在光镜下观察细胞形态、分化过程及细胞核型的检测.结果细胞集落性生长,符合胚胎干细胞的特征.结论大鼠囊胚在胚胎成纤维细胞饲养层上可发育成胚胎干细胞,并能进行传代.     

基于人胚胎干细胞健康安全评价体系的构建

食品、药品、医疗器械和材料、生物制剂以及环境的质量和健康安全是政府和民众十分关注的热点问题。目前国际标准的健康安全评价检测方法以微生物、动物及其细胞作为载体,不能准确反映人类的生物学特征,预测人体心、肝等靶器官毒性及发育毒性的准确率偏低,在技术层面严重制约了人类健康安全的评价和监控。如何建立准确反映人类生物学特征的健康安全评价体系是关系国民健康安全的重大科学问题［1］。 人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells, hESCs）可真实反映人类生物学特征,并利用其无限增殖和定向分化的特点,可达到检测载体的高度标准化,hESCs技术的发展为体外健康安全评价体系的升级提供了有力支持。 由北京大学牵头,联合浙江大学、中国医学科学院整形外科医院和军事医学科学院,与新加坡国立大学合作,我们完成了科技部国际科技合作一期项目“基于人胚胎干细胞健康安全评价新载体的构建”,并就相关研究成果作为科研工作综述进行发表［2］。在此基础上,合作团队顺利完成了二期项目“创建人胚胎干细胞健康安全预测新体系”,取得了系列成果,现综述如下。     

利用慢病毒载体构建稳定干扰β-catenin的人胚胎干细胞系

目的建立β-catenin稳定干扰的人胚胎干细胞系。方法利用β-catenin慢病毒干扰质粒PLKO.1-puro-β-catenin转染包装细胞293FT制备重组慢病毒,并感染人胚胎干细胞,采用嘌呤霉素筛选稳定表达shβ-catenin人胚胎干细胞克隆;试验分为稳定转染β-catenin干扰质粒组(Shβ-catenin)、稳定转染空白载体组(VECTOR)和对照未感染组(WT)三组,RT-PCR检测干扰后β-catenin mRNA表达;进一步免疫荧光检测干扰后细胞β-catenin和OCT4的蛋白表达。结果β-catenin特异性shRNA的慢病毒感染人胚胎干细胞后,获得稳定表达shβ-catenin的人胚胎干细胞系,Shβ-catenin组β-catenin mRNA表达明显降低,只有WT组mRNA表达的1%,而VECTOR组和WT组之间无明显差异;免疫荧光染色进一步验证shβ-catenin组中基本无β-catenin蛋白的表达,但表达多能性标记OCT4。结论通过β-catenin特异性shRNA慢病毒载体构建了稳定干扰β-catenin的人胚胎干细胞系。     

细胞因子对人类胚胎干细胞分离克隆的影响

目的 观察白血病抑制因子、干细胞因子、碱性成纤维细胞生长因子对人类胚胎干细胞分离克隆的影响。方法在基础细胞培养液中加入不同的细胞因子组合，培养后观察人类胚胎干细胞集落形成数和各组的最高传代数。结果 细胞因子添加与否对人类胚胎干细胞原代培养无显著的影响，而对后继培养有显著影响。结论 在人类胚胎干细胞初代培养时可以不添加细胞因子，细胞的克隆过程中添加细胞因子有利于细胞的生长。     

小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

目的：探讨小鼠胚胎干细胞饲养层细胞的制备。方法：小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞培养胚胎干细胞。另在无饲养层细胞培养液中,含白血病抑制因子条件下培养小鼠胚胎干细胞,观察两种情况下胚胎干细胞的生长情况。结果：小鼠胚胎成纤维细胞呈放射状或旋涡状走行,胚胎干细胞呈克隆状生长。结论：胚胎干细胞能良好生长,且保持未分化状态。     

两种培养条件下人胚胎干细胞生长状况的比较

目的:比较胚胎干细胞株在两种不同培养体系下生长状况,验证两种不同培养体系对于人胚胎干细胞全能性的维持与延续.方法:将人类胚胎干细胞株分别接种于传统的培养体系以及mTESR1的培养体系,观察在不同培养体系下人类胚胎干细胞状态及克隆形态之间的差别.对生长于不同培养体系下的胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色以及用RT-PCR的方法检测人胚胎干细胞全能性.结果:生长在传统培养体系中的胚胎干细胞,细胞克隆薄且扁平,与周围的饲养层细胞边界清晰,克隆中心的细胞容易出现分化.单个胚胎干细胞核质比高,核仁明显.生长mTESR1体系中的胚胎干细胞,细胞克隆较传统培养体系下的大,呈单层细胞生长,细胞排列紧密,单个胚胎干细胞的细胞核大,核仁明显,核质比高.生长在不同培养体系下的人胚胎干细胞碱性磷酸酶染色均呈现阳性,免疫荧光染色及RT-PCR均验证了细胞的全能性.结论:两种不同培养体系均能维持胚胎干细胞的全能性.mTESR1培养条件更加简便,能更清楚观察与分析单个细胞的形态,适合人胚胎干细胞的维持培养.     

胚胎干细胞的应用研究

胚胎干细胞(ES)是来源于早期胚胎内细胞团(ICM)或原始生殖细胞(PGC)的一种多能细胞,具有体外无限复制和高度分化潜能的特性。目前,胚胎干细胞已逐渐应用在胚胎干细胞体外测试(EST)与新药开发,移植治疗与细胞替代治疗,转基因动物与克隆上,并已取得了一定的研究成果。     

一种皮肤致敏体外替代方法介绍-人细胞系激活试验

过敏性皮炎是由过敏原引起的皮肤病,主要是指人体接触到某些过敏原而引起皮肤红肿、发痒、脱皮等皮肤病症。目前,化学物致敏性评价主要依赖于动物实验。近年来,在动物福利和政府监管的推动下,采用体外培养细胞代替动物模型进行化学物致敏性的研究已成为趋势。人细胞系激活试验主要通过检测人THP-1细胞接触化学物后细胞表面标志物以及信号通路的变化判断其是否具有致敏性。该试验方法已被欧美和日本的多个实验室验证其可行性,但目前其临床应用价值还未被完全认可。随着研究的逐步深入,新的标志物和评定方法也在不断被开发和验证。     

Genotoxic Effects of PAH Containing Sludge Extracts in Chinese Hamster Ovary Cell Cultures

Objective:Many studies have been conducted in order to evaluate the genotoxicity of chemicals and waste materials,which utilized in vivo test protocols.The use of animals for routine toxicity testing is now questioned by a growing segment of society^[1].Methods:Keeping the above fact in mind,we have conducted in the present study the gentoxicity evaluation of oily sludge samples generated from a petroleum refinery and petrochemical industry and ETP sludge from petroleum refinery using DNA damage,chromosomal aberration,p^53 protein induction and apoptosis in short term in vitro mammalian Chinese Hamster Overy cell cultures.Results:It is evident from the results that the oily sludge compounds derived from petroleum refinery and petrochemical industry could cause DNA damage,chromosomal aberration,p^53 protein accumulation and apoptotic cell death on exposure to oily sludge extracts in the presence of metabolic activation system(S-9 mix),however,ETP sludge extract could not cause significant genotoxicity in comparison to oily sludge extract and negative control.Conclusion:the effect may be attributed to polycyclic aromatic hydrocarbons present in the samples as evidenced from GC-MS.     

紫外线作用肿瘤细胞后基因表达谱的变化

目的分析紫外线(UV)对人原发性肝癌细胞株基因表达谱的影响。方法以限制片段差异显示聚合酶链反应(RFDD-PCR)技术分析紫外线照射人原发性肝癌细胞株前后基因表达谱的变化。结果获得表达序列标签共257条。其中差异表达序列标签116条,含开启表达序列标签38条,关闭表达序列标签23条,表达增强序列标签40条,表达降低序列标签15条。结论紫外线可引起人原发性肝癌细胞株基因表达谱发生变化,这些表达发生变化的基因在肿瘤生物学中的作用有待进一步研究。     

直接多肽结合试验组合人细胞系活化试验预测皮肤致敏物的探讨

目的 建立直接多肽结合试验（DPRA）和人细胞系活化试验（h-CLAT）的皮肤致敏组合检测方法，对化学品及植物提取物的致敏性进行初筛。方法 选择12种化学品和7种植物提取物为受试物，把不同受试物分别与两种肽（半胱氨酸肽和赖氨酸肽）共孵育24 h，采用高效液相色谱法分析反应后多肽消耗。同时将不同浓度的受试物与体外培养的人急性单核细胞白血病细胞（THP-1）共孵育24 h，通过流式细胞仪检测暴露后细胞表面标志物CD86和CD54的变化。再进一步比较DPRA和h-CLAT预测结果的一致性。结果 DPRA方法和h-CLAT方法准确区分了12种化学品的皮肤致敏性，其中2种判定为阴性，10种判定为阳性，两种方法检测结果一致。DPRA对植物提取物致敏性的预测中，除绿茶提取物无法判定外，其余6种均为皮肤致敏疑似物质。h-CLAT预测中，除绿茶提取物、马齿笕提取物和人参果提取物为非致敏物，其余4种植物提取物为致敏物。DPRA与h-CLAT预测的一致性为0.57。结论 DPRA与h-CLAT的简单组合可以实现对单一化合物的准确预测，对于复杂混合物可实现初步预测，确认需要进一步组合其他方法。     

PST在ERCP治疗中的疗效及安全性分析

目的:探讨经内镜乳头括约肌预切开术在ERCP治疗中的疗效及安全性。方法:回顾性分析我院2006年6月至2007年6月230例行ERCP取石治疗患者,其中对24例常规方法不能胆道深部插管者行乳头预切开术(PST)并取石治疗,观察术后患者的临床症状评分、血淀粉酶、大便隐血试验和住院时间等指标并进行比较。结果:EST组成功率89.57%,高淀粉酶血症发生率19.77%,住院时间中位数7 d;PST组成功率100%,高淀粉酶血症发生率26.32%,住院时间中位数6 d。两组病例在临床症状评分、高淀粉酶血症发生率、大便隐血试验阳性率和住院时间等方面均无明显差异。结论:乳头预切开术是ERCP诊疗困难时成功进入胆道的一项重要技术手段,正确的预切开术和常规ERCP同样有效、安全。     

小鼠衰老相关新基因Arzc的克隆

目的鉴别和克隆与小鼠衰老相关的新基因.方法采用改进的差异显示反转录聚合酶链反应(DDRT-PCR)技术分析正常老化和年轻BALB/C小鼠大脑皮层mRNA的差异表达,差异显示的新表达序列标签(EST)经Northern杂交验证后,作为出发序列,利用生物信息学方法设计引物,以小鼠大脑皮层总RNA的反转录产物为模板通过PCR克隆全长cDNA.结果差异显示分析共获得表达差异明显的EST 42条,序列同源性分析显示其中29条为已知基因cDNA片段,13条可能为新EST.对新EST进行Northern杂交验证后,对确证在正常老化鼠皮层表达明显下调的1个EST,通过生物信息学方法克隆全长cDNA,得到1个新的1 382 bp的cDNA序列,命名为Arzc,获得GenBank注册号AY344585.该序列含有1个261 bp的开放阅读框,推测的编码多肽包含86个氨基酸残基,与噬菌体编码的重组酶/整合酶的一段氨基酸序列有较高同源性.结论鉴别并克隆到一个可能与小鼠衰老相关的新基因Arzc.     

基于THP-1细胞的皮肤致敏体外检测方法

目的建立基于人细胞系的替代皮肤致敏动物实验的体外检测方法(h-CLAT),并对化学品、日用化学产品和化妆品植物原料进行皮肤致敏性检测。方法体外培养人急性单核细胞白血病细胞(THP-1),不同浓度受试物与细胞共孵育24 h,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物CD86和CD54活化的差异,并对11种已知皮肤致敏化学物质和9种未知样品进行皮肤致敏性预测。同时对未知样品进行豚鼠局部封闭涂皮法验证。结果使用h-CLAT方法准确区分了11种参考物质的皮肤致敏性,9种受试样品中,7种样品被判断为阴性皮肤致敏物质,2种植物提取物被确认为皮肤致敏疑似物质。9种样品的预测结果与动物实验一致。结论 h-CLAT体外检测方法可以代替部分动物测试,用于可溶性皮肤致敏物质的预测。     

一种提高错误定位效率的测试用例选择方法

为提高错误定位的效率,提出了多种测试用例约简与选择的方法,然而,过度的约简与不适的选择造成了部分测试信息丢失,引起了错误定位有效性的损失。本文提出了一种相似测试用例选择方法,用以约简测试集。该方法能消除偶然测试用例对错误定位准确性造成的偏差,通过为每个失败测试用例选择执行轨迹与其相似的成功测试用例的方式,最大限度地保留测试的全部信息;基于选择出的测试用例信息,利用已有的错误定位方法输出程序语句的可疑值列表。以Siemens程序集作为实验对象,证明了本文测试用例选择方法能显著提高错误定位的有效性。     

预测致癌性的遗传毒理学试验组合的选择和序贯判别方法

本文把序贯判别方法应用于以遗传毒理学试验预测化学品的致癌性,优化预测的社会效益。给出了遗传毒理学试验组合的较佳选择方案以及实用的序贯判别方法。推荐以沙门氏菌回变试验为第一个试验,啮齿类骨髓微核试验为第二个试验,哺乳动物细胞SCE试验或哺乳动物细胞UDS试验或啤酒酵母有丝分裂重组试验为第三个试验。本文还改进了Titterington处理缺失数据的统计方法。     

A primary care experience of open access to exercise stress test

This study described the practice profile of an open access exercise stress test (EST) service to the primary care physicians at a teaching hospital in 2000. We performed a retrospective review of all ESTs ordered and conducted by the primary care physicians. A total of 145 ESTs were conducted, of which 80.7% were referred for assessment of chest pain. Proportions of positive, negative, uninterpretable and inconclusive ESTs were: 22.1%, 52.8%, 18.1% and 6.9%. Typical chest pain was independently associated with a positive EST in this study (p = 0.008, OR 5.50, 95% CI 1.56-19.37). Although referral to the open access EST service seemed appropriate, there is a need to reduce the number of uninterpretable and inconclusive results.