人IP10启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在细胞中的表达

目的:构建IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内IP10的基因表达调控和相关的信号转导机制提供重要工具.方法:采用基因重组技术构建含IP10启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRed1-1-IP10;用脂质体瞬时转染HEK293 细胞,观察IP10启动子对脂多糖(LPS)刺激的反应.结果:酶切和DNA 测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的;该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平很低,经LPS 刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论:所构建的IP10启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体是正确的,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于IP10基因表达信号调控机制的研究.     

HMGB1启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及在机械牵张诱导下的活性检测

目的 构建高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein,HMGB1)启动子的红色荧光蛋白报告基因载体.方法 采用基因重组技术构建含HMGB1启动子区的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRedl-1-HMGB1P.经PCR、酶切和DNA测序鉴定后,将重组载体转染HEK293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达以及对机械牵张刺激的反应.以转染空载体pDsRedl-1的细胞作为对照.结果 PCR、酶切和DNA测序表明重组载体pDsRedl-1-HMGB1P的构建正确,该表达载体在HEK293细胞静息状态下表达水平较低,经机械牵张刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.转染空载体pDsRedl-1的细胞未见红色荧光.结论 成功构建了HMGB1启动子的红色荧光蛋白报告基因载体,对机械牵张刺激有很好的反应.     

人内皮细胞一氧化氮合酶红色荧光蛋白报告基因载体的构建与表达

目的：研究血管壁切应力诱导的人血管内皮细胞内皮细胞-氧化氮合酶（eNOS）基因表达的调控机制,构建在哺乳动物细胞中表达的eNOS红色荧光蛋白报告基因载体。方法：从人脐静脉内皮细胞基因组DNA中克隆eNOS启动子,将其构建到红色荧光蛋白载体pDsRedl-l上,经PCR、酶切和DNA测序鉴定后将重组载体转染293细胞,在荧光显微镜下观察其在细胞内的表达和分布情况。结果：PCR、酶切和DNA测序结果均表明重组载体pDseNOSRed的构建正确,该载体能在293细胞中高效表达。由eNOS启动子驱动表达的红色荧光蛋白大部分均匀分布于整个细胞中,转染后12h开始出现,36-48h为表达高峰,120h后红色荧光几乎全部消失。结论：成功构建了eNOS红色荧光蛋白报告基因载体,该载体能在哺乳动物细胞中高效表达,为研究血管壁切应力诱导血管内皮细胞eNOS基因表达的调控机制提供了一个重要而又方便的工具。     

α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达

目的构建α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具。方法克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子（TGF-β1）刺激的反应。结果酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体;该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1,刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光。结论成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究。     

S100A8启动子的克隆及转录活性检测

目的 构建小鼠S100A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖(LPS)、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性.方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达.结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加.结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础.     

S100A8启动子的克隆及转录活性的检测

目的 构建小鼠S100 A8基因启动子序列的报告基因载体,通过报告基因技术检测在静息、脂多糖（LPS）、PolyI:C及NaASO2等刺激下该段启动子的转录活性。方法 采用PCR从小鼠脾组织基因组DNA扩增S100A8启动子序列(-826～+468);将其克隆至pDsRed1-1载体上,重组质粒经过PCR、酶切及测序分析正确无误后转染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,荧光显微镜下观察静息、LPS、PolyI:C和NaASO2刺激下红色荧光蛋白表达。结果 正确扩增出小鼠S100A8启动子片段(-826～+468);成功构建其红色荧光蛋白报告基因载体,证实该质粒转染RAW 264.7细胞后静息状态下仅可见少量而微弱的红色荧光,经LPS、PolyI:C和NaASO2刺激后,红色荧光强度和亮度明显增加。结论 小鼠S100A8启动子(-826～+468)在静息状态下即具有转录活性,炎性、氧化应激刺激后S100A8表达增强;该启动子的成功克隆和其报告基因载体的构建,为进一步研究S100A8的基因表达调控机制打下了良好的基础。     

大肠杆菌不同SOD调控序列红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

目的 通过将大肠杆菌BL21中MnSOD、FeSOD以及Cu/ZnSOD调控序列(包括启动子,-3518～+15 bp)与红色荧光蛋白(RFP)连接,构建成含SOD调控序列的红色荧光蛋白报告基因,用以研究不同SOD启动子对RFP的调控作用.方法 采用重组PCR技术,分别构建以MnSOD、FeSOD、Cu/ZnSOD启动子驱动的RFP报告基因载体,并将构建的融合基因通过T克隆转化入大肠杆菌,通过不同浓度Cd2+作用,分别诱导RFP表达.结果 正确构建了三种SOD -RFP融合基因,重组PCR结果与测序结果完全一致;该报告基因在室温静息状态下,红色荧光有微弱表达,经Cd2+诱导后,红色荧光亮度明显增强,其中MnSOD调控序列驱动的RFP表达最为明显.结论 该报告基因载体的成功构建,为研究SOD的基因表达调控机制和研制检测环境中污染物的微生物传感器提供了重要基础和工具.     

人CAT启动子红色荧光蛋白报告基因载体的构建及功能鉴定

目的 构建人过氧化氧酶(CAT)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为进一步研究CAT表达调控奠定基础.方法 以人类基因组DNA为模板,PCR获得-404～+16大小的肩动子片段,将其定向插入pDsRed1-1载体,构建pDsRed-CATp红色荧光蛋白报告基因载体.瞬时转染NIH/3T3细胞,观察CAT启动子对H_2O_2刺激的反应.结果 pDsRed-CATp经双酶切及DNA测序分析鉴定准确无误;该载体瞬时转染N1H/3T3细胞,静息状态呈现弱转录,H_2O_2刺激后,转录水平明显增强.结论 成功构建CAT启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,对H_2O_2刺激反应良好,为研究CAT基因表达调控提供了有效的工具.

Abstract：

Objective To construct a red fluorescent protein reporter gene driven by human catalase gene promoter. Methods The red fluorescent protein reporter gene plasmid pDsRed-CATp containing human catalase gene promoter was constructed by gene recombination technique. The plasmid was transiently transfected into NIH/3T3 cells to observe their response to H_2O_2 stimulation. Results The plasmid was constructed correctly as verified by double enzyme digestion and sequence analysis. The plasmid was lowly expressed in resting NIH/3T3 cells, but the expression level increased obviously after stimulation by H_2O_2. Conclusions A red fluorescent protein reporter gene plasmid driven by human catalase gene promoter has been constructed successfully with a sensitive response to H_2O_2 stimulation. This system provides a convenient tool for the study of the regulatory mechanism of catalase gene expression.     

RU486调控的红色荧光蛋白真核载体的构建及表达

目的 构建一种带有DsRed红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,并在体外验证其调控表达作用.方法 利用分子生物学技术,将DsRed基因和启动子,以及RU486系统构建成真核可凋控载体pRSl7.RUDsRed.在转染MFC细胞后,运用荧光显微镜和流式细胞技术检测该载体的调控表达.结果 PCR和限制性酶切及测序均证实了载体的正确性.没有RU486时,几乎没有红色荧光蛋白的表达,加入诱导剂RU486后,可以实现红色荧光蛋白的高效表达.结论 成功构建了带有红色荧光蛋白报告基因并可经RU486诱导的真核表达载体,实现了对目的 基凶表达的有效调控,为进一步的基因调控研究和和基因治疗奠定了基础.     

低氧调控p53RFP基因启动子活性的初步研究

目的 观察低氧对p53RFP基因表达及启动子活性的影响，探索低氧反应元件(HRE)是否参与了低氧对p53RFP基因启动子活性的调控。方法 将HEK293细胞置于低氧条件下培养，实时定量PCR及Western blot检测p53RFP mRNA及蛋白表达水平；通过定点突变技术构建HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体并转染HEK293细胞，分别置于常氧和低氧条件下培养，双荧光素酶报告基因检测系统检测启动子活性。结果 低氧处理不同时间点p53RFP mRNA表达水平均显著增加，差异有统计学意义(F=96.493,P<0.001);低氧组p53RFP及HIF-1α蛋白表达量均呈时间依赖性递增。成功构建了HRE突变型p53RFP启动子双荧光素酶报告基因载体，双荧光素酶报告基因检测显示，与常氧组相比，低氧条件下野生型p53RFP基因启动子活性增加(t=-19.504,P<0.001),HRE单突变或双突变后启动子活性均较野生型降低(F=160.891,P<0.001)。结论 低氧可诱导p53RFP基因表达上调；成功构建了HRE突变型p53RFP双荧光素酶报告基因载...     

Bad蛋白磷酸化和剪切修饰对神经胶质瘤细胞凋亡的调控作用*

Bcl-2相关死亡启动子同源基因编码蛋白Bad是线粒体凋亡通路的开关蛋白。药物处理和各种内源性信号通过改变其特殊位点的磷酸化状态和对其生化构型进行剪切修饰,实现对神经胶质瘤细胞内促凋亡或促生存信号通路的下游调控。Bad还可介导细胞周期蛋白的促凋亡作用,使之与细胞周期阻滞保持一致。Bad不仅是抗胶质瘤药物的作用焦点,也是其基因治疗的理想候选物。     

Expression of c-fos and c-jun proteins in the marginal division of the rat striatum during learning and memory training

Background A new brain region, the marginal division (MrD) , was discovered at the caudal margin of the neostriatum. The MrD was shown to be involved in learning and memory in the rat. The aim of this study was to investigate the expression of the immediate-early genes c-fos and c-jun in the MrD of the striatum during learning and memory processes in the rat, immunocytochemical and Western blot methods were used to examine Y-maze trained rats.Methods The rats were divided into three groups, namely the training, pseudotraining, and control groups. After Y-maze training, the expression of the immediate-early genes c-fos and c-jun in the MrD of the rats was investigated using immunocytochemical and Western blot methods.Results After one hour of Y-maze training, the expression of c-jun and c-fos proteins was significantly enhanced in the MrD; the c-jun protein, in particular, was more intensely expressed in this region than in other parts of the striatum. The expression of these two proteins in the training group was significantly higher than in the pseudotraining and control groups. In addition, positive expression was also found in the hippocampus,cingulum cortex, thalamus, and in other areas. Western blot disclosed two immunoreactive bands for the anti-c-fos antibody (47kD and 54kD) and two immunoreactive bands for the anti-c-jun antibody (39kD and 54kD). Conclusions These results indicate that the immediate-early genes c-fos and c-jun participate in signal transduction during the learning and memory processes associated with Y-maze training in rats.     

c-myc和k-ras基因多态性与辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的关联性分析

目的：探讨c-myc和k-ras基因多态性与辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的关系。方法：采用 ⁶⁰Co（剂量率0.382 Gy•min^-1,总剂量7 Gy）分别照射C57BL/6J和BALB/c小鼠建立小鼠胸腺淋巴瘤模型,6个月后处死小鼠,取胸腺组织,用Promega DNA纯化试剂盒提取胸腺淋巴瘤细胞基因组DNA,以聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）方法对c-myc基因rs51048361（C/T）、k-ras基因rs30221756（A/G）和rs30161609（T/C）单核苷酸多态性进行检测。结果：⁶⁰Co照射引起2种小鼠的胸腺瘤发生率不同,对应的 rs51048361位点基因型分别为C/C和T/T,rs30221756位点基因型分别为A/A和G/G,rs30161609位点基因型分别为T/T和C/C。结论：辐射敏感性不同的C57BL/6J和BALB/c 小鼠 ⁶⁰Co照射后rs51048361、rs30221756和rs30161609　位点基因型不同,推测c-myc和k-ras基因多态性与辐射诱发胸腺淋巴瘤有关联。     

宫颈癌组织抑癌基因P33ING1及P53表达的临床意义

目的:探讨抑癌基因P33ING1在宫颈癌中表达的临床意义及其与P53相互关系. 方法:应用Envision免疫组化法检测宫颈癌50例,宫颈不典型增生15例患者P33ING1和P53基因蛋白的表达,并与正常宫颈及宫颈炎组20例进行对照. 结果:对照组及宫颈不典型增生组织中P33ING1均呈阳性表达(100%),而宫颈癌组中表达率明显下降62.0%,与前两组之间差异有显著性(P<0.01);且宫颈癌组中P33ING1表达与肿瘤、淋巴结转移及分化有关(P<0.01). 结论:宫颈癌组织P33ING1表达明显下降,并与P53蛋白的表达呈负相关.     

p16及p15基因预测葡萄胎恶变的价值

①目的 探讨p16、p15基因及蛋白缺失与葡萄胎恶变的关系。②方法 应用PCR和免疫组化技术检测40例葡萄胎和25例早孕正常绒毛中p16、p15基因的纯合性缺失及蛋白表达情况。③结果早孕绒毛中p16、p15基因、蛋白表达均为阳性。葡萄胎中p16、p15基因及蛋白表达缺失率均高于早孕绒毛组织，差异有显著性（χ^2=11．152、14．388，P〈0．05）。葡萄胎恶变组P16、P15蛋白表达联合阴性率高于无恶变组（χ^2=4．675，P〈0．05）；葡萄胎恶变组中，伴随清官前子宫大于妊娠月份、同时发生黄素囊肿且大于6cm、清宫后HCG持续2个月才消退者，其P16、P15蛋白表达联合阴性率均高于非恶变组，差异有显著性（χ^2=4．412，P〈0．05；P=0．014、0．038）。④结论 葡萄胎的发生、发展与p16、p15基因、蛋白表达缺失有关。葡萄胎中P16、P15蛋白表达缺失可望成为预测葡萄胎恶变倾向的指标。     

p21-EGFP 融合基因表达载体与卵母细胞的表达定位

目的:通过构建绿色荧光蛋白p21-EGFP融合基因表达载体,观察其在小鼠卵母细胞中的表达及定位,为研究细胞周期蛋白激酶抑制因子p21对小鼠卵母细胞细胞周期的影响提供实验基础.方法:以含有p21的全长序列的质粒为模板PCR扩增p21cDNA , 应用基因重组技术与EGFP 基因融合, 构建以绿色荧光蛋白EGFP为报告基因的重组表达质粒pEGFP-p21.利用显微注射方法注射到小鼠卵母细胞中进行表达,用荧光显微镜直接观察pEGFP-p21融合蛋白在细胞中的分布和定位, Western Blot 方法检测其蛋白的表达.经酶切证实插入片断的正确性.结果:荧光显微镜观察结果显示在空载体pEGFP-C3转染的小鼠卵母细胞中,绿色荧光呈弥散分布,而经注射重组质粒pEGFP-p21 的小鼠卵母细胞中, 绿色荧光主要集中在细胞核内.同时用Western Blot 证实了pEGFP-p21 融合基因的表达.结论:成功的构建了pEGFP-p21 融合表达质粒.同时证明小鼠卵母细胞能高效表达pEGFP-p21 融合基因, 且主要定位于细胞核内.     

p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性

目的:检测肝癌患者血浆中p53基因突变和细胞核中p16基因缺失的机率,研究与疾病发生、发展的相关性并探讨其意义.方法:实验采用聚合酶联链式反应(PCR)扩增p53基因外显子5～8和免疫组织化学方法SP-p16,对其突变和缺失进行分析.结合临床患者有无肝组织以外转移来对比差异性.结果:33例肝癌患者中,有17例结果显示血浆循环核酸p53基因突变;有转移病灶组18例的突变率高于无转移病灶组15例.结论:血浆p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的发生、与疾病的轻重及病灶转移有相关性,突变机率在临床鉴别诊断和治疗预后中有参考价值.     

用于筛选COPS3相互作用蛋白酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-COPS3的构建及鉴定

目的 用COPS3基因片段构建酵母双杂交GAL4系统的诱饵载体pGBKT7-COPS3，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性及对报告基因有无激活作用。方法 运用RT-PCR技术从骨肉瘤细胞系SOSP-9607中扩增出COPS3基因片段，克隆入pUC19质粒，经测序正确后，插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7中，将重组质粒导入酵母菌AH109，检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用。结果 成功获得COPS3基因片段，其表达蛋白对酵母菌AH109无毒性，对报告基因亦无激活作用。结论可以利用酵母双杂交GAL4系统来研究与COPS3相互作用蛋白。     

低pH液复灌对兔心肌缺血再灌注的保护作用与Bcl-2、Bax表达的关系

目的探讨低pH液复灌对体外循环(extracorporeal circulation,ECC)下兔缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)心肌的保护作用与Bcl-2、Bax表达的关系。方法成年新西兰大白兔30只,完全随机分为5组(n=6):对照组(C组)不停跳,体外循环180 min;缺血再灌注组(I/R组)全心缺血40 min,再灌注120 min;pH=7.4组与pH=6.9组于再灌注前2 min予37℃的95%O2+5%CO2饱和的pH值为7.4或6.9的K-H液灌注;缺血后处理组(P组)再灌注的前2 min给予缺血后处理。体外循环结束后,光镜观察心肌形态学变化;ELISA测定血清肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)浓度;RT-PCR检测Bcl-2、Bax mRNA的表达;免疫组化检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果与I/R组比较,pH=6.9组和P组心肌组织损伤较轻,cTnI浓度较低(P<0.05),pH=6.9组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平明显增高[(1.058 1±0.165 7)vs(0.648 2±0.070 8),(0.233 1±0.022 5)vs(0.156 5±0.019 2),P<0.05],Bax mRNA和蛋白表达水平明显降低[(1.353 3±0.138 1)vs(1.901 7±0.198 1),(0.173 5±0.015 1)vs(0.247 1±0.021 3),P<0.05];pH=6.9组和P组之间Bcl-2、Bax表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论体外循环下再灌注初短暂低pH(pH=6.9)液复灌可以模拟缺血后处理的心肌保护作用,其保护机制与调节Bcl-2、Bax的表达有关。