超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.     

超声联合微泡介导缺氧诱导因子-1α基因转染293T细胞的实验研究

目的:探讨超声联合微泡造影剂介导缺氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胚肾293T细胞的转染效率。方法:将6孔板中的293T细胞悬液分为3组,A组:质粒+超声辐照组,加入质粒,终浓度为15μg/孔;B组:载基因微泡+超声辐照组,加入载基因质粒微泡混合液,质粒的终浓度为15μg/孔,微泡的终浓度为200μl/孔;C组:对照组,每孔中仅加入单纯质粒DNA,终浓度15μg/孔。A组和B组均接受超声辐照,超声照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,辐照时间30s。超声辐照转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性定量观察各组细胞基因的转染效率。结果:转染48h后,荧光显微镜观察到转染成功的细胞内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组的基因转染效率分别为(5.6±0.5)%、(30.5±1.0)%、(0.1±0.1)%。结论:超声辐照联合微泡能够介导治疗性基因的体外细胞转染,为冠心病心肌缺血的HIF-1α基因治疗奠定基础。     

超声微泡介导内皮抑素基因转染人脐静脉内皮细胞的实验研究

目的：探讨超声微泡介导内皮抑素（endostatin,ES）基因对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells ,HUVECs）转染的效率及可行性。方法 HUVECs种于24孔板内,培养24 h后加入5μg pIRES2-EGFP-ES质粒及超声造影剂SonoVue微泡,启动超声照射进行转染,设定MI分别为0.7、1.0、1.5,辐照时间分别为10 s、30 s、60 s、120 s,微泡浓度分别为10％、20％、50％。转染24 h后观察绿色荧光蛋白表达,计数活细胞数,MTT检测细胞增殖抑制率。结果超声爆破微泡介导了内皮抑素基因转染HUVECs,并具有强度、时间及微泡浓度依赖关系,但随着强度、微泡浓度增加及辐照时间延长,细胞凋亡率增加、细胞活力下降,转染率随之下降,当超声强度MI1.5、辐照时间60 s、微泡浓度20％转染率相对最高。结论超声微泡可介导内皮抑素基因转染脐静脉内皮细胞,但转染受多因素影响,在相对最佳转染条件下可实现内皮抑素的高表达。     

自制辅助装置完成超声微泡介导pEGFPC1-Akt1基因转染

目的初步探讨超声微泡介导基因转染的可行性.方法 自制辅助装置,联合应用超声辐射和SonoVue超声微泡介导pEGFPC1-Akt1基因转染293FT细胞,用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因,转染后荧光显微镜下计数细胞转染率.实验分4组:A组,单纯质粒组;B组,质粒+微泡组;C组,质粒+超声组;D组,质粒+超声+微泡组.结果自制辅助装置制作成功,符合实验要求的条件.转染结果为 A组和B组未见荧光表达,C组转染率约为4.26%,D组转染率为34.56%,D组转染率高于C组(P<0.05).结论 使用自制辅助装置,联合应用超声辐射和微泡法能够有效介导pEGFPC1-Akt1基因转染.     

超声微泡造影剂介导pEGFP-N_1质粒转染HGFs的实验研究

目的 探讨超声破坏微泡介导pEGFP-N_1质粒转染人牙龈成纤维细胞的可行性、优化转染的条件及转染效率.方法 体外原代培养HGFs.以pEGFP-N_1质粒为报告基因,微泡造影剂为载体,用超声辐照介导质粒pEGFP-N_1转染HGFs.实验组分为质粒组、微泡+质粒组、超声+质粒组、超声+微泡+质粒组,超声+微泡+质粒组按不同的转染条件分成亚组.转染48 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,MTT检测HGFs活性.结果 超声微泡介导pEGFP-N_1质粒对HGFs的转染效率明显高于其他实验组(P<0.05).优化转染条件后,频率300 KHz,声强1.5 W/cm~2,连续波,辐照时间60 s,微泡浓度10%,质粒浓度6.67 μg/ml时,转染率较高.结论 在一定条件下,超声微泡造影剂能够促进外源基因对HGFs的转染.     

微泡造影剂结合超声介导绿色荧光蛋白质粒转染大鼠移植静脉的实验研究

目的 探讨微泡造影剂及超声辐照介导基因转染移植静脉桥的可行性.方法 建立SD大鼠颈外静脉颈总动脉旁路移植模型,选择增强型绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)为报告基因.将大鼠颈外静脉段浸泡入粘附质粒的微泡中,予超声照射,再将静脉段间置植入颈总动脉,7 d后,取出静脉段行快速冰冻切片,荧光显微镜下观察血管平滑肌内荧光表达,同时进行苏木精-伊红染色行病理观察.结果 微泡造影剂结合超声辐照组的荧光强度显著高于质粒浸泡+超声辐照组、质粒+微泡造影剂组及单纯质粒浸泡组(P<0.05).苏木精-伊红染色观察血管组织并无坏死灶出现.结论 微泡造影剂结合超声辐照可以实现基因靶向转染至大鼠移植静脉桥的血管平滑肌中.     

携自杀基因微泡转染卵巢癌细胞株SKOV_3的超声参数及转染效率

目的:探究超声介导携Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv1tk)自杀基因微泡转染SKOV3细胞的超声参数及转染效率.方法:超声在不同微泡浓度与辐照时间(8,15,30,60s间隔1s)组合下辐照SKOV3细胞,MTT法筛选最适辐照时间和微泡浓度.将实验分成6组分别进行以下处理:超声辐照组,脂质体+超声辐照组,脂质体+微泡+超声辐照组,微泡+超声辐照组,裸质粒组(阴性对照),脂质体组(阳性对照).用裸质粒及脂质体处理后分别转染pcDNA3.1-EGFP/hsv1tk质粒;采用荧光显微镜、流式细胞技术分别定性和定量检测各组转染效率;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测hsv1tk基因的表达.结果:MTT检测在超声强度0.5W/cm2,频率1MHz,微泡浓度0.56×1011个/L,辐照时间8s间隔1s条件下,超声辐照微泡转染对细胞活性无明显抑制.经此条件转染后荧光显微镜下可观察到脂质体+微泡+超声辐照组的绿色荧光强度最强;流式细胞技术检测表明,微泡+超声辐照组转染效率为(11.74±0.19)%,比超声辐照组(2.19±0.22)%高,而脂质体+微泡+超声辐照组(25.62±0.08)%均高于其他各组(P<...     

人TLR9真核表达载体在HEK293T细胞中的表达

目的 构建人Toll样受体9(TLR9)全长序列与绿色荧光蛋白GFP的重组质粒,观察融合蛋白在HEK293T细胞内表达并检测其应答CpG DNA的能力.方法 PCR法扩增TLR9全长,限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切绿色荧光真核表达质粒pcDNA3/GFP和TLR9全长,构建重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP,脂质体转染人胚肾293T细胞(HEK293T),荧光显微镜下观察绿色荧光融合蛋白在细胞内的表达与分布;将重组质粒与NF-κB荧光素酶报告质粒pGL2-luc共转染HEK293T细胞,CpG DNA(10 mg/L)刺激后,化学发光法检测细胞内荧光素酶活性.结果 成功构建pcDNA3-TLR9/GFP质粒,经酶切及测序分析证实载体构建正确;转染细胞后,在荧光显微镜下观察到TLR9/GFP融合蛋白大量表达;重组质粒与pGL2-luc共转染细胞,应用荧光报告系统检测显示,CpG DNA刺激后荧光素酶活性显著高于生理盐水对照组(P<0.01).结论 重组质粒pcDNA3-TLR9/GFP在HEK293T细胞中表达的TLR9/GFP绿色荧光融合蛋白,能够识别CpG DNA并诱导增加胞内NF-κB转录活性.     

融合蛋白表达质粒pUL54S-EGFP的构建及在AD293细胞中的表达

目的 探讨构建人巨细胞病毒(HCMV)截短UL54(UL54S)基因融合增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达质粒pUL54S-EGFP转染人胚肾293细胞,瞬时表达UL54S和EGFP的可行性.方法 采用PCR法扩增UL54s基因并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N1中,采用脂质体法转染AD293细胞后通过荧光显微镜和流式细胞仪分析EGFP的表达情况.结果 重组质粒pUL54S-EGFP转染AD293细胞12h后即可见到荧光蛋白的表达,至48h表达达高峰;转染48h pUL54S-EGFP组平均转染率为47%.平均荧光强度为547.结论 重组质粒pUL54S-EGFP可在人胚肾293细胞内瞬时表达UL54S和EGFP融合蛋白,EGFP的表达可报告UL54基因的表达,质粒pUL54S-EGFP构建成功.     

负载LMP－1基因的树突状细胞诱导CTL对鼻咽癌细胞的杀伤效应

目的：探讨超声联合微泡造影剂能否增强绿色荧光蛋白（GFP）质粒pEGFP—C3－LMP－1转染树突状细胞（Dendriticcells,DC）,进而探讨转染LMP－1基因的DC诱导细胞毒性T淋巴细胞（cTL）对鼻咽癌（NPc）细胞株的体外杀伤作用。方法：体外培养的人DC分为四组：①单纯质粒组（A组）：加入质粒;②超声照射组（B组）：质粒＋超声辐照;③微泡造影剂组（c组）;质粒＋微泡造影剂;④超声＋微泡造影剂组（D组）：质粒＋微泡造影剂＋超声辐照。荧光显微镜观察GFP质粒在DC内的表达,流式细胞仪评价GFP质粒的转染效率。另将体外培养的DC分为两组用于检测DC表面袁型的表达及体外杀伤实验：①空白对照组,单纯培养的DC;②基因转染组,具体实验方法同上述D组。流式细胞仪检测DC表面分子表型的表达。DC和T细胞混合共培养获得的CTL为效应细胞,LMP－1表达阳性的NPC细胞株C666—1为靶细胞,按效靶比10：1的比例混合培养24h后,MTT法检测CTL对靶细胞的杀伤作用。结果：D组DC内有较多的绿色荧光表达,且转染效率最高（14．86±2．36）％,和其余各组均有显著性差异。LMP—1基因转染组DC表面标志CD80、CD83、cD86、CD40、HLA—DR的表达明显高于对照组。所诱导产生CTL对靶细胞有明显的杀伤作用,其杀伤效率为（41．72±3．53）％,明显高于空白对照组（7．62±2．36）％。结论：超声联合微泡造影剂可有效地介导GFP质粒转染DC。LMP－1基因转染组De诱导产生特异性的CTL对靶细胞有明显的杀伤作用。     

超声联合微泡介导基因转染对内皮细胞骨架的影响

目的 探讨白蛋白微泡在治疗性超声条件下对介导基因转染以及对细胞骨架的影响,同时探讨超声联合微泡介导基因转染的最佳声学参数.方法 六孔板培养大鼠微血管内皮细胞,一组每孔加入eGFP质粒10μg,加或不加微泡,超声条件为连续波,频率2 MHz,机械指数是0.50～1.80.照射时间是30～180 S,24～48 h后观察细胞转染情况.一组超声照射后免疫荧光染色细胞骨架,荧光显微镜观察并测定荧光强度.结果 机械指数为0.50～1.00范围内,基因转染率与机械指数呈正相关(P<0.001),再增加机械指数基因转染率差别无统计学意义.超声照射时间30～90 S范围内,基因转染率以及微管荧光强度改变与超声照射时间呈正相关(P<0.001).再延长照射时间基因转染率差别无统计学意义.同种条件下,微丝蛋白荧光强度改变无统计学意义(P>0.05).结论 超声联合微泡能够显著增加报告基因的转染率并且对细胞骨架无明显的损伤.微泡可以作为临床冠心病基因治疗的安全有效的载体.     

实时灰阶谐波超声造影在肝肿瘤中的应用

目的 研究实时灰阶谐波超声造影在肝肿瘤诊断中的价值。方法 对89例共101个肝内占位病灶进行实时灰阶谐波超声造影检查,其中原发性肝癌36例38个病灶,转移性肝癌24例32个病灶,肝血管瘤16例18个病灶,肝脓肿2例,硬化结节5例,局灶性结节性增生2例,肝腺瘤1例,局灶性脂肪肝3例。选用低机械指数成像技术GE Logiq 9超声诊断仪和Bracco公司的SonoVue超声造影剂。结果 注入造影剂后,实时谐波超声造影能显示不同肝肿瘤的造影特点,并能显示肿瘤的血流灌注信号。超声造影正确诊断肝癌和肝良性肿瘤病灶分别为67个（/70）和29个（/31）。其诊断肝癌的敏感性、特异性及准确性分别为95.7%、93.5%、95%。结论 实时灰阶谐波超声造影能反映不同肝肿瘤增强模式及血流动力学变化,可帮助提高肝肿瘤超声诊断的准确性。     

超声/微气泡SonoVue介导体内和体外基因转导的研究

目的初步探讨超声联合微气泡超声造影剂SonoVue介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导的可行性,并研究不同超声波参数和基因用量与转基因效率之间的关系。方法利用不同强度和不同剂量超声波和声学造影剂SonoVue,介导人肝癌细胞株HepG2和BALB／c小鼠右侧胫前肌内增强型绿色荧光蛋白报告质粒的转导,分别直接或组织冰冻切片后在荧光显微镜下观察,并计算转导效率。结果超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养的HepG2细胞和小鼠胫前肌内pEGFP-C1基因转导,HepG2细胞以1MHz 1．5W／cm^2超声波基因转导效果最好;小鼠胫前肌以1MHz3W／cm^2的超声波转基因效果最好。结论超声联合微气泡造影剂SonoVue可介导体外培养细胞和体内肌肉组织基因转导,1MHz超声波是转基因的理想频率。     

超声介导自制白蛋白微泡和声诺维对体外报告基因转染效率的比较研究

目的:探讨超声介导微泡破裂法促进外源基因的安全转移的方法,为临床上肿瘤等疾病的基因治疗研究提供新的思路。方法:以绿色荧光蛋白基因为标记基因,以人大肠癌细胞株SW480为靶细胞,分别以自制白蛋白微泡和声诺维(SonoVue)微泡作为载体,通过超声介导微泡破裂法促进绿色荧光蛋白GFP基因在人大肠癌细胞株的定向转染,以激光共聚焦显微镜来定性和半定量观察GFP在靶细胞的表达情况,以椎虫蓝染色法检测超声作用于细胞的安全性。结果:当超声的强度为0.75W/cm2,作用时间为40s时,对细胞比较安全;自制白蛋白微泡和声诺维微泡的浓度为10%时,分别达到最佳的基因转染效率,两者无显著性差异,但后者的相对表达强度较高。结论:超声介导微泡破裂法促进外源基因的转移是一种比较安全而有效的基因转染方法。     

High mechanical index post-contrast ultrasonography improves tissue structural display of hepatocellular carcinoma

Background The advent of second generation agent-SonoVue and low mechanical index real-time contrast enhanced ultrasonography （CEUS） imaging have been shown to improve the diagnostic performance of uhrasonography in hepatocellular carcinoma （HCC）. But no report has described the effect of high mechanical index （MI） post-CEUS. This study aimed to investigate the value of post-CEUS in displaying tissue structures of HCC. Methods Seventy-six HCCs in 65 patients were included in the study. Each patient underwent three scans, high-MI （ MI ： 0. 15 - 1.6 ） pre-contrast ultrasound, low-MI （ MI ： 0. 04 - 0. 08 ） CEUS with contrast agent SonoVue, and high-MI post-contrast ultrasound, which was performed within 3 minutes after CEUS. The size, boundary, echogenicity, internal echotexture and posterior acoustic enhancement of the HCCs in the conventional scans before and after CEUS were evaluated. According to pathological evidence, diagnosis rates of pre-contrast, CEUS and post-contrast scans were determined and compared. The potential mechanism of post-contrast ultrasound imaging was also discussed. Results Compared with pre-contrast, post-contrast ultrasound showed improvement in image quality in most HCCs： twenty-six （34. 2% ） more lesions showed well defined margins and fourteen （18.4%） more nodules showed halo sign; twenty-three （30. 3% ） lesions demonstrated enlarged in sizes; changes in echogenicity were seen in 30 lesions （39.5%） ; eighteen （23.7%） more lesions showed heterogenecity and 20 （26. 3% ） more lesions showed “mosaic”or “nodule-in-nodule” sign; twelve （15.8%） more lesions showed posterior acoustic enhancement. Post-contrast ultrasound showed increased diagnostic accuracy of 93.4% （71/76）, compare with 88.2% （67/76） of CEUS alone. Conclusions High-MI post-contrast ultrasound utilizes harmonic signals during the rupture of microbubbles, and significantly improves the display of echo-characteristics of HCCs in ultrasound images, which adds diagnostic values for CEUS. Post-contrast ultrasound could play an important role in tissue characterization, and may be included in CEUS protocols.     

Clinical Value of Contrast-enhanced Ultrasound in Differentiating Benign and Malignant Focal Liver Lesions

To explore the clinical value of contrast-enhanced ultrasound （CEUS） in differentiating benign and malignant focal liver lesions （FLLs） with SonoVue, CEUS was used to examine 113 patients with focal liver lesions （FLLs） in our hospital during July 2005 to December 2006. All the patients underwent contrast-enhanced CT （CECT） or contrast-enhanced MRI （CEMRI）. Except for patients with focal fatty sparings （n=18） and with hemangiomas （n=8）, all the patients were confirmed by operation or ultrasonic-guided liver puncture biopsy. A sulfur hexafluoride gas-based contrast agent was used with a MI of 0.15 to 0.17. Forty-eight cases of malignant FLLs, including 30 hepatocellular carcinomas （HCCs）, 2 cholangiocarcinomas and 16 metastatic tumors, were detected. Seventy-eight cases of benign FLLs, including 33 hemangiomas, 9 focal nodular hyperplasias （FNHs）, 19 focal fatty sparings, 5 abscesses, 7 regenerative nodules and 2 inflammatory pseudo-tumor, were involved. The contrast pattern of benign and malignant FLLs was quite different. CEUS has higher specificity and sensitivity than conventional ultrasound in differentiating benign and malignant FLLs.     

实时超声造影在肝癌射频消融治疗效果评价中的应用研究

目的：探讨肝癌射频消融（radiofrequency ablation,RFA）后实时超声造影（contrast-enhanced ultrasound,CEUS）对判断治疗效果的临床应用价值。方法：对经RFA治疗的205例肝癌患者205个病灶术后1个月分别进行常规超声和低机械指数（MI〈1.0）CEUS检查（造影剂为SonoVue）,比较分析常规超声与CEUS在评价肝癌射频消融效果及局部复发中的应用价值。所有患者均同期行增强CT或增强MRI检查。结果：常规超声检查提示92个病灶（44.9%）周边出现低回声区,或于病灶局部检及血流信号,常规超声判断消融不全或局部复发的敏感性为77.5%,特异性为76%;CEUS检查提示80个病灶（39.0%）于动脉期可见造影剂局部充填,CEUS判断消融不全或局部复发的敏感性为97.5%,特异性为98.4%。结论：与常规超声比较,CEUS可以更准确判断RFA术后消融程度及局部复发情况,与增强CT/MRI相当,可为射频治疗术后疗效的判断提供可靠的影像学依据。     

Combined pluronic P85- and ultrasound contrast agents-mediated gene transfection to HepG2 cells

This study examined the effect of P85 (a pluronic block copolymer) and microbubble (MB)ultrasound contrast agents under ultrasound irradiation on gene transfection and expression.The pEGFP plasmids tha...     

Clinical value of contrast-enhanced ultrasound in differentiating benign and malignant focal liver lesions

Summary To explore the clinical value of contrast-enhanced ultrasound (CEUS) in differentiating benign and malignant focal liver lesions (FLLs) with SonoVue, CEUS was used to examine 113 patients with focal liver lesions (FLLs) in our hospital during July 2005 to December 2006. All the patients underwent contrast-enhanced CT (CECT) or contrast-enhanced MRI (CEMRI). Except for patients with focal fatty sparings (n=18) and with hemangiomas (n=8), all the patients were confirmed by operation or ultrasonic-guided liver puncture biopsy. A sulfur hexafluoride gas-based contrast agent was used with a MI of 0.15 to 0.17. Forty-eight cases of malignant FLLs, including 30 hepatocellular carcinomas (HCCs), 2 cholangiocarcinomas and 16 metastatic tumors, were detected. Seventy-eight cases of benign FLLs, including 33 hemangiomas, 9 focal nodular hyperplasias (FNHs), 19 focal fatty sparings, 5 abscesses, 7 regenerative nodules and 2 inflammatory pseudo-tumor, were involved. The contrast pattern of benign and malignant FLLs was quite different. CEUS has higher specificity and sensitivity than conventional ultrasound in differentiating benign and malignant FLLs. This project was supported by a key program from the National Natural Sciences Foundation of China (No. 90209009).     

还原性多肽共载基因和化学治疗药载体的构建与体外评价

目的 制备一种应用于共载基因和化疗药的硫辛酸（LA）修饰的非内吞机制进入细胞的固有无序正常蛋白-细胞质定位的内化肽6（CL）的纳米复合物(LA-CL),并考察其对HEK293细胞的转染效率、胞摄取情况,以及体外释放规律。方法 以不同比例（2.5%、5%、10%、20%）半胱氨酸作为交联剂,合成四种不同交联度的LA-CLss (LA-CLss1, LA-CLss2,LA-CLss3, LA-CLss4),利用1H-NMR和凝胶色谱鉴定合成的LA-CLss。取增强绿色荧光蛋白质粒(plasmid Enhanced Green Fluorescent Protein, pEGFP) 和LA-CLss以不同氮磷比（N/P）（2.5, 5, 10, 20, 40, 80）自组装形成纳米复合物,粒度测定仪测定复合物的粒径和zeta电位,琼脂糖凝胶电泳测定载体LA-CLss对pEGFP的包裹能力以及保护作用。用超声乳化法制备载多西他赛的载药胶束,并用芘荧光探针法测定其临界胶束浓度。用LA-CLss/ pEGFP纳米复合物与人胚肾HEK293细胞共同培养,考察不同交联度复合物的细胞转染情况。结果 通过核磁结果确定LA-CLss合成成功;在N/P=40时,HEK293细胞对LA-CLss3/ pEGFP的转染效率高于其他四种 复合物(LA-CLss, LA-CLss1,LA-CLss2, LA-CLss4)。超声乳化法制备的载药胶束包封率为85.25 ± 0.04%,载药量为8.81 ± 0.02%。细胞摄取结果表明该载体可以有效地将基因递送进细胞内。体外释放实验结果表明该多肽胶束具有还原性条件敏感释药行为。结论 制备的LA-CLss纳米复合物有望成为一种高效的共载基因和化疗药的载体。