应用RD—PCR方法制备K562细胞表达谱芯片基因探针

目的：收集K562细胞表达谱芯片的基因片段。方法：培养K562细胞，抽提其mRNA，反转录为cDNA，应用限制性显示PCR技术（RD－PCR）分离K562细胞不同组别的产物片段，分别行PCR扩增。结果：制备了可用于基因芯片制作的基因探针片段。结论：RD－PCR方法适合于基因芯片探针的收集。     

银染mRNA差异显示方法的建立

目的：建立银染mRNA差异显示方法，为差异表达基因片断的分离克隆奠定基础，方法：采用随机引物和锚定引物各1条，建立差异显示反转录聚合酶链式反应（DDRT－PCR）和银染方法，对DDRT－PCR过程中各实验影响因素进行优化，割取差异条带进行二次扩增。结果：当总RNA用量为0．2ug，引物浓度为0．6－1．0umol/L,dNTP浓度为200unmol/L,MgCl2浓度为1．6－2.0mmol/L，时，同时起始5个循环的退火温度为50℃，扩增效率最佳，特异性好，背景 干净，结论：DDRT－PCR方法简便，灵敏，高效，可用于分离差异表达基因。     

靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：构建介导 RECQL4 RNA 干扰的 shRNA 慢病毒表达载体。方法将人工合成的 RECQL4 siR－NA 经 PCR 扩增后与线化的 pLKO．1慢病毒表达载体连接,经测序鉴定后,将 pLKO．1－RECQL4－shRNA 与慢病毒包装质粒共转染入 HEK －293T 细胞,产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度。体外感染人结肠癌细胞 RKO 后,实时定量 PCR 和 Western blot 检测 RECQL4 mRNA 和蛋白的沉默效果。设置未加入任何慢病毒表达载体的 RKO 细胞为未感染组,感染 pLKO．1－scramble －shRNA 慢病毒载体为阴性对照组。结果基因测序结果证实成功构建 pL－KO．1－RECQL4－shRNA 慢病毒表达载体。测定包装后的慢病毒颗粒滴度为6.70×107 IU／mL。感染 RKO 细胞后,RECQL4的 mRNA 和蛋白表达量均低于阴性组和未感染组。结论成功构建靶向 RECQL4基因的 shRNA 慢病毒表达载体,可有效抑制人结肠癌 RKO 细胞 RECQL4 mRNA 和蛋白的表达。     

胃癌高表达基因erk的PCR扩增,克隆和鉴定

对在胃癌高表达的EPH家族基因erk胞外的配体结合区基因扩增及克隆．方法：从胃癌患者手术切除标本中提取RNA，反转录为cDNA，以计算机辅助分析设计并合成引物进行RT－PCR，并将扩增片段克隆入pUC19质粒，用酶切及PCR方法筛选鉴定阳性克隆．结果：RT－PCR扩增片段与设计相符，且特异性好，无非特异产物出现，表明所设计引物符合要求．酶切及巢式PCR、PCR－RFLP方法证明克隆片段正确插入pUC19的HindIII和BamHI位点，并将重组克隆命名为pGE42．结论；克隆的完成为进一步研究该基因在胃癌的发生中的作用，寻找其胞外配体及进行表达产物的细胞定位等工作打下基础．     

人β-防御素-3基因的克隆和序列测定

目的 克隆人β-防御素－3的基因。方法 提取人皮肤组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法克隆人β－防御素－3基因。PCR产物连接入pGEM-T-EASY载体，转化DH－5α受感态细胞，蓝白筛选，对酶切及PCR鉴定含有目的片段的克隆进行测序。结果 获得预期大小的PCR产物，经序列鉴定证实为人β－防御素－3基因。结经 获得了人β-防御素－3基因。     

应用RD-PCR方法制备K562细胞表达谱芯片基因探针

目的收集K562细胞表达谱芯片的基因片段。方法培养K562细胞,抽提其mRNA,反转录为cDNA,应用限制性显示PCR技术(RD-PCR)分离K562细胞不同组别的产物片段,分别行PCR扩增。结果制备了可用于基因芯片制作的基因探针片段。结论RD-PCR方法适合于基因芯片探针的收集。     

血液癌胚抗原mRNA指标在诊断消化系统恶性肿瘤方面的应用价值

目的：通过分析血液癌胚抗原mRNA(CEAmRNA)在不同消化系统疾病时检测结果的差异，探讨CEA－mRNA指标在诊断消化系统恶笥肿瘤等方面的应用价值。方法：以54例消化系统恶性肿瘤患者（肿瘤组）和42例非恶性肿瘤的良性消化道病人（非肿瘤组）为研究对象，应用反转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测血液标本（CEAmRNA)，结果：血液标本CEAmRNA阳性检测结果为：恶性肿瘤组31例（57．4％），非肿瘤组1例（2．4％），两组阳性结果的判别具有显著性（P＜0．001），血液标本RT－PCR检测CEAmRNA指标诊断恶性消化系统肿瘤的特性异为97．6％，敏感性为57．4％，结论：在诊断消化系统恶性肿瘤等方面，CEAmRNA是一个特异性和敏感性较好且很实用的指标，可以常规应用。     

原位逆转录PCR检测干细胞因子mRNA在白血病细胞的表达

目的：探索应用原位逆转录PCR（RT－PCR）检测低拷贝的干细胞因子mRNA在白血病细胞表达的可行性。方法：在普通的PE480型PCR仪进行原位RT－PCR，检测干细胞因子mRNA在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞的表达。结果：直接法和间接法原位RT－PCR法可以检测到干细胞因子mRNA在K562、HL-60和慢性粒细胞性白血病细胞表达，而常规的原位杂交则为阴性。结论：（1）干细胞因子在K562、HL－60和慢性粒细胞性白血病细胞均有表达，但是表达量较低，应用原位RT－PCR可进行检测；（2）在普通的PE480型PCR仪上可以进行原位PCR。     

检测癌胚抗原信使核糖核酸诊断肺癌及癌细胞微转移的研究

目的：评估检测组织标本癌胚抗原信使核糖核酸（CEA－mRNA)指标在诊断肺癌细胞微转移方面的应用价值。方法：以肺癌组织及其切缘组织为研究标本、非癌性疾病的肺病变组织及其切缘组织为对照标本,应用反转录套式聚合酶链反应（RT－NP－PCR）技术,检测组织标本CEA－mRNA指标。结果：31份肺癌组织及其切缘组织CEA－mRNA阳性率分别为83．9％（26／31）和38．7％（12／31）,11份对照组织均无阳性发现。对于肺癌,CEA－mRNA指标的特异性为100％、敏感性为84．8％。结论：检测肺癌组织及其切缘组织CEA－mRNA指标,诊断肺癌与肺癌转移具有较高的应用价值。     

检测组织标本CEA－mRNA在诊断消化道恶性肿瘤方面的应用

目的：探讨CEA－mRNA指标在诊断消化道恶性肿瘤方面的应用价值。方法：采集新鲜肿瘤组织及此肿瘤标本的远端边缘组织、良性消化道疾病组织为检测标本,应用套式反转录聚合酶链反应（RT－PCR）检测CEA－mRNA。结果：肿瘤组织37例（84．1％）、肿瘤远端边缘组织13例（29．5％）、良性疾病组织3例（12．5％）CEA－mRNA阳性。三组CEA－mRNA结果的差别具有显性（P＜0．01）,肿瘤远端组织与良性疾病组织检测CEA－mRNA结果的差别无统计学意义（P＞0．05）。CEA－mRNA指标诊断消化道恶性肿瘤的特异性为87．5％、敏感性为84．1％。结论：检测组织CEA－mRNA指标诊断消化道恶性肿瘤的特异性和敏感性均较高,尤其在检测组织远端微小瘤灶方面有较大优势。     

氧化低密度脂蛋白通过激活内皮细胞受体诱发一氧化氮的产生

目的：探讨氧化低密度脂蛋白内皮受体LOX1在氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein, ox-LDL）对内皮细胞产生一氧化氮（nitric oxide, NO）影响中的作用。方法：反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测LOX1mRNA的表达,酶法检测NO含量。结果：ox-LDL可上调内皮细胞LOX1mRNA的表达,同时诱发内皮细胞产生NO,且呈浓度依赖效应,应用LOX1抑制剂可抑制这一作用。结论：ox-LDL可诱发内皮细胞NO的产生,呈浓度依赖效应,LOX1介导了这一作用。     

p38 MAPK介导降钙素基因相关肽刺激HaCaT细胞分泌CCL27的研究

目的观察降钙素基因相关肽(CGRP)对HaCaT细胞珠分泌趋化因子CCL27的影响,并探讨其作用机制。方法以CGRP孵育体外培养的HaCaT细胞,应用RT-PCR方法测定CCL27的mRNA表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定上清液中趋化因子CCL27,Western blot测定CGRP对p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化的作用。应用p38 MAPK抑制剂SB203580及CGRP受体拮抗剂CGRP8-37预处理,观察CGRP对上清液中趋化因子CCL27分泌的影响。结果应用CGRP孵育后,HaCaT细胞的趋化因子CCL27的mRNA表达上升,上清液中分泌量增加。CGRP诱导p38 MAPK磷酸化,而SB203580及CGRP8-37可抑制这一作用,并部分抑制CGRP诱导的上清液中趋化因子CCL27的分泌及其mRNA表达。结论 CGRP可引起HaCaT细胞分泌趋化因子CCL27,其作用机制部分依赖于p38 MAPK的磷酸化。     

载脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)促进单核细胞源性巨噬细胞产生前列腺素E2 (PGE2)和前列腺素D2 (PGD2)

 目的 探讨人单核细胞THP-1源性巨噬细胞产生的Lipocalin型前列腺素D合酶(lipocalin type prostaglandin D synthase,L-PGDS)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)和前列腺素D2 (PGD2)与载脂蛋白A-Ⅰ (apolipoprotein A-Ⅰ,apoA-Ⅰ)抗动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作用之间的关系。 方法 采用MTT法确定合适的给药浓度。用不同浓度(0、12.5、25、50、100和200 μg/mL) apoA-Ⅰ处理体外培养的THP-1细胞源性巨噬细胞24 h后,逆转录 聚合酶链式反应法(RT-PCR)检测L PGDS mRNA表达的变化,酶联免疫测定法(ELISA)检测PGE2和PGD2 蛋白表达的变化。结果 apoA-Ⅰ处理24 h的巨噬细胞中L-PGDS mRNA、PGE2和PGD2蛋白的表达均显著高于未用apoA-Ⅰ处理的巨噬细胞( P 均< 0.001);apoA-Ⅰ浓度为50 μg/mL时,作用效果最明显。结论 apoA-Ⅰ的抗AS作用可能与上调THP 1细胞源性巨噬细胞中L PGDS mRNA以及PGE2和PGD2蛋白的表达有关。     

雷公藤内酯醇抑制血管内皮细胞生长因子的表达与合成

目的 探讨雷公藤内酯醇对血管内皮细胞生长因子（VEGF）mRNA表达及VEGF合成与分泌的影响,进一步探讨雷公藤内酯醇降低肾小球肾炎患者尿蛋白的作用机制。方法 以人内皮细胞系ECV－304为研究对象,利用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、流式细胞仪、酶联免疫吸附法（ELISA）检测不同剂量雷公藤内酯醇对佛波脂（PMA）诱导的内皮细胞VEGF mRNA表达及VEGF合成与分泌的影响,并采用RT－PCR检测雷公藤内酯醇对内皮细胞c-jun/c-fos mRNA表达的影响。结果 雷公藤内酯醇可以抑制PMA诱导的内皮细胞VEGF mRNA表达及VEGF合成与分泌,并呈剂量依赖性。同样,雷公藤内酯醇剂量依赖性抑制PMA诱导的内皮细胞c-jun/c-fos mRNA的表达。结论 雷公藤内酯醇抑制内皮细胞VEGF mRNA表达及VEGF合成与分泌可能是其雷公藤内酯醇降低肾小球肾炎患者尿蛋白的作用机制之一。雷公藤内酯醇可能通过影响转录因子AP－1的形成而影响内皮细胞VEGF的表达与合成。     

阿拉瑞林对GnRH受体阳性肝癌细胞Fas/FasL基因表达的影响

目的　探讨Fas Fasl系统在LHRH类似物抑制肝癌细胞增殖过程中的作用。方法　用免疫组织化学方法检测SMMC772 1肝癌细胞中GnRH受体的表达 ;用半定量RT PCR方法 (QRT PCR)观察LHRH类似物对SMMC772 1肝癌细胞中Fas FasL系统mRNA表达的变化。结果　SMMC772 1肝癌细胞呈GnRH及其受体免疫反应阳性。PCR反应产物均与预期长度相符合。Fas FasL mRNA水平随LHRH类似物浓度增加而增大 ,经方差分析各组间有显著性差异 (Fas ,F =16.5 18FasL ,F =111.5 83 ,P <0 .0 1)。结论　SMMC772 1肝癌细胞具有自分泌GnRH的功能 ;Fas FasL系统可能参与了LHRH类似物对肝癌细胞增殖的抑制作用     

选择性环氧化酶抑制剂对肾癌细胞BCL-2表达的影响

目的：探讨环氧化酶抑制剂NS398对肾癌786—0细胞生长及bcl-2基因和蛋白表达的影响。方法：用不同浓崩的NS398（0、50、100、150μmol／L）处理肾癌786—0细胞不同时间,采用MTr比色法分析细胞生长抑制率。用不同浓度NS398到理肾癌786—0细胞24h,RT—PCR检测bcl-2mRNA表达的变化,Westernblot检测bcl-2蛋白表达的变化。结果：随着NS398《浓度及处理时间的增加,肾癌786—0细胞生长抑制率升高;随着NS398剂量的增加,bcl-2 mRNA及蛋白的表达水平逐渐减少。结论：NS398可呈剂量和时间依赖性抑制肾癌786—0细胞的生长,呈浓度依赖性减少bcl-2 mRNA及蛋白的表达。NS398可崩通过抑制bcl-2的表达,抑制肾癌786—0细胞的生长。     

乌司他丁对脂多糖诱导的巨噬细胞NO释放和iNOSmRNA表达的影响

目的 探讨乌司他丁对脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7细胞一氧化氮(NO)释放和诱生型一氧化氮合酶(iNOS mRNA)表达的影响。方法 应用LPS激活RAW264.7细胞株,与不同浓度组乌司他丁(100～10000U/ml)共同孵育,Griess试剂法测定NO释放量;实时荧光定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术分析iNOS mRNA的表达。结果 高浓度的乌司他丁(1000～10000U/ml)能抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO的表达(P<0.05),下调iNOS mRNA含量(P<0.05);低浓度乌司他丁(100U/ml)对LPS诱导的RAW 264.7细胞NO、iNOS mRNA表达与LPS单独处理组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高浓度乌司他丁抑制LPS诱导的巨噬细胞NO释放和iNOS mRNA表达,这种抑制与浓度相关。     

稳定转染ShRNA-TRAP对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响

目的探讨稳定转染靶向端粒酶调节相关基因TRAP的小发夹RNA对胃癌细胞株SGC-7901的长效影响。方法构建特异性作用于TRAPmRNA的小发夹RNA质粒表达载体,转入SGC-7901细胞,筛选的阳性克隆细胞继续压力培养3个月,采用RT-PCR法检测TRAPmRNA的表达,MTT法检测细胞生长,同时检测细胞凋亡、hTERTmRNA、端粒酶活性。结果稳定转染ShRNA-TRAP后,SGC-7901细胞的TRAPmRNA表达明显下降,hTERTmRNA和端粒酶活性降低;细胞增殖能力降低,细胞凋亡率增加。结论ShRNA-TRAP能长效的抑制TRAPmRNA的表达,下调hTERTmRNA转录及端粒酶活性,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,可作为抑制端粒酶的肿瘤基因治疗策略的补充。     

凝血酶对U937细胞uPAR mRNA表达的影响

目的 研究凝血酶通过凝血酶受体（ＴＲ）对细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达的影响。方法 在凝血酶、灭活凝血酶、和抗ＴＲ小肽多抗等作用下,以ＲＴ－ＰＣＲ法测定培养Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ的表达量。结果 凝血酶增强ｕＰＡＲ ｍＲＮＡ表达呈现凝血酶剂艇时间的依赖性。其作用机制与凝血酶和细胞膜上ＴＲ间的结合、以及凝血酶的蛋白水解活性有关。高浓度凝血酶或中等浓度凝血酶在延长作用时间长,对Ｕ９３７细胞ｕＰＡＲｍ     

RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 Mrna

目的 建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素－１（ＥＴ－１）ｍＲＮＡ的方法。方法 采用逆转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后,对胎鼠大脑皮质ＥＴ－１ ｍＲＮＡ进行检测,并以ＲＴ－ＰＣＲ后产物的ＯＤ值来反映起初ＥＴ－１ ｍＲＮＡ的模板相对含量。结果 在一定ＴａｐＤＮＡ酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下,ＥＴ－１ ｍＲＮＡ经ＲＴ－ＰＣＲ扩增后产