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1.
目的:筛选和鉴定抗戊型肝炎病毒(HEV)开放读码框架2(ORF2)的人源化噬菌体单链可变区抗体。方法:以大肠杆菌表达的重组HEV ORF2多肽做为固相包被抗原,从半合成的人源化噬菌体抗体库中经过4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验(ELISA)、DNA序列分析鉴定,获得抗原结合活性较强的抗-HEV ORF2单链可变区抗体,并以间接酶标法用该抗体对戊型肝炎患者石蜡包埋肝组织中的HEV ORF2抗原进行免疫组织化学鉴定。结果:筛选到的抗-HEV ORF2的单链可变区抗体基因。酶切和序列分析表明,该抗体基因由795bp组成:ELISA和免疫组织化学结果显示,抗-HEV ORF2人源化噬菌体单链可变区抗体能与重组HEV ORF2抗原特异性结合,并能够特异性识别戊型肝炎患者肝组织中的HEV抗原。结论:此法  相似文献   

2.
利用基因工程技术在大肠杆菌中表达抗人C1q轻链可变区基因C1qVL。将质粒pGEM-C1qVL中的C1qVL基因克隆进表达载体pBV220中,在大肠菌中成功地表达出抗人C1q轻链可变区片段(pC1qVL),并利用计算机分析软件进行了氨基酸序列同源性分析。本研究为进一步抗人Cq1FV抗体的研制及用于自身免疫性发病机制的研究打下了一定基础。  相似文献   

3.
肝癌单克隆抗体可变区基因的克隆及序列分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:获取抗人原发性肝癌单克隆抗体重、轻链可变区基因。方法:从分泌高亲和力的抗人原发性肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞株SM8.11中提取细胞的总RNA,以随机引物反转录合成cDNA,以特异引物进行PCR,扩增了单抗的重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)基因,并进行了序列分析。结果:VH基因片段长度为351bp,编码117个氨基酸残基;VL基因片段长度为324bp,编码107个氨基酸残基。两者均有4个  相似文献   

4.
目的:用抗-HEV ORF2单克隆抗体和抗-HEV ORF2单链可变区抗体研究急性戊型肝炎的免疫病理学,探讨二者在临床病理诊断中的应用价值。方法:(1)以杂交瘤技术制备的抗-HEV单克隆抗体(McAb,monoclonal antibody)作为第一抗体,用免疫组化LSAB法检测急性戊型肝炎患者肝组织中的HEV抗原。(2)用抗-HEV ORF2单链可变区抗体以间接酶标法检测肝组织内的HEV抗原。结果:用抗-HEV单克隆抗体从14例急性戊型肝炎肝标本中检出9例HEV抗原阳性者(64.28%),其中8例阳性标本用抗-HEV ORF2单链可变区抗体检测HEVAg均为阳性。HEV抗原在肝细胞浆表达以胞浆弥漫型为主,尚可见膜型表达。HEV抗原阳性细胞集中分布有病变明显区,伴淋巴细胞浸润,病变较轻区也可见随机散在分布,部分  相似文献   

5.
抗癌胚抗原单区抗体的质粒构建及表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 对抗癌胚抗原单区抗体进行表达研究。方法 采用PCR技术将已获得的抗癌胚抗原(CEA)原单克隆抗体E7B10重,轻链可变区基因(VH、VK)进行改造后分别克陲是大肠杆菌表达质粒PET-24α(+)中,并进行表达,结果 显示重、轻链可变区在大肠杆菌中获得高铲表达,基力体总蛋白的20%与25%,SDS-PAGE和Western blot图谱显示表达产物分子量为13KD、12KD,与其基因编旧白 理  相似文献   

6.
目的:为使外源性 T N F, I F N 基因和内源性主要组织相容性复合物Ⅰ类( M H CⅠ)分子基因表达呈现“正反馈”式放大效 应,构建在 H L A B7 启动子调控、 I R E S连接下协同表达 T N Fα和 I F Nβ基因的重组腺病毒载体。方法和结果:从p G L3 B7 T N F及p I R I F中切下 B7pro T N F和 I R E S I F Nβ基因片段,先后插入p Bluescript Sk (+ ), 构建成p B L B7 T N I R I F。回收 T N Fα I R E S I F Nβ基因片段,连入 Ad C M V Link1 中,构建成 C M V 启动子驱动表达的 Ad C M V T N I R I F(+ )。回收 B7pro T N F I R E S I F Nβ基因片段,连入缺失 E1 和 E3 区及启动子的 Ad BglⅡ中, 构建成 H L A B7 启动子驱动表达的 Ad B7 T N I R I F(- )。结论:此两种载体为“正反馈”式放大肿瘤免疫原性提供一条新途径。  相似文献   

7.
小鼠红细胞分化相关因子cDNA片段的克隆与分析   总被引:3,自引:1,他引:2  
目的克隆与小鼠红细胞终末分化相关因子的基因,并对其表达特性进行分析。方法用致贫血Friend病毒(FVA)诱导BALB/c小鼠脾脏产生大量FVA原红细胞,后者经分离纯化并在促红细胞生成素作用下进行体外培养。采用减除杂交与PCR相结合的方法,用未经培养的FVA诱导的原红细胞(0hFVA原红细胞)的cDNA对培养36h的FVA诱导的成红细胞(36hFVA成红细胞)的cDNA进行多次减除杂交和PCR扩增,构建上述36hcDNA的质粒减除文库并进行差异筛选。对阳性克隆进行核苷酸序列测定及Northern印迹分析。结果获得1个472bp的cDNA片段,其中含有1个309bp的开放阅读框架,编码102个氨基酸。经GenBank进行同源比较,未发现同源序列,已被GenBank接受,(编号AA114369)。Northern印迹分析表明,该cDNA在培养36h的FVA中、晚幼红细胞中呈差异表达,其mRNA全长约为500~600bp左右。将其暂命名为小鼠红细胞分化相关因子(MEDRF)基因。结论MEDRF基因在红细胞分化的中、晚幼阶段特异表达,表明MEDRF是一个新的与红细胞终末分化相关的因子。  相似文献   

8.
目的:获取抗CD4单克隆抗体(McAb)可变区基因,为构建抗CD4嵌合抗体打下基础。方法 从分泌抗人CD4 McAb的杂交瘤细胞系中提取总RNA,用家族特异性引物进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR),分别扩增出重链可变区(VH)基因及轻链可变区(VL)基因。将PCR产物克隆至pGEM-T载体,然后转化JM109细菌。并用全自动 DNA序列分析仪对VH及VL基因序列进行测定。结果:VH基因为351  相似文献   

9.
HPV16L1ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达   总被引:4,自引:0,他引:4  
目的:获得足够量的人乳头瘤病毒16型(HPV16)L1融合蛋白及含HPV16L1ORF序列的基因重组体。方法:通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX-1,表达后进行菌体蛋白质Western blotting免疫印迹分析。结果:HPV16L1基因重组体的构建成功,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Western blotting检测中个有抗  相似文献   

10.
人黑色素瘤单抗VH—TNF融合蛋白基因的构建和表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
韩骅  陈常庆 《医学争鸣》1998,19(1):15-17
在大肠杆菌中表达人黑色素瘤单抗VH-TNF融合蛋白基因。方法;在人肿瘤坏死因子基因上游插入了抗黑色素瘤单抗Mel3的重链可变区基因,将此融合基因插入大肠杆菌表达系统pGEX-2T的GST基因下游,IPTG诱导表达,表达产物经凝血酶消化后,测定其对L929细胞的杀伤活性,并进行SDS-PAGE,用抗TNF抗体进行蛋白印迹分析。  相似文献   

11.
抗人AFP单链抗体基因的构建和在大肠杆菌中的表达   总被引:3,自引:0,他引:3  
目的 构建抗人 AFP单链抗体 (Sc Fv)的基因并转入大肠杆菌 BL - 2 1(DE3)中诱导表达。分离纯化Sc Fv并鉴定其生物活性。方法 用 RT- PCR方法从能分泌特异性抗人 AFP单克隆抗体的杂交瘤细胞中分离纯化抗体 VH和 VL基因。用重叠延伸 PCR方法将 VH和 VL拼接在一起 ,构建抗人 AFP单链抗体的基因。将 Sc Fv基因克隆至 p GEM- T载体构建 ,用限制性内切酶切以及测序鉴定。将 Sc Fv基因连接到 p ET32 (a )质粒 ,转化 BL - 2 1(DE3)细菌。抗性生长的克隆用异丙基硫代 -β- D-半乳糖苷 (IPTG)诱导 4 h。溶解细菌并纯化 Sc Fv,通过 SDS-PAGE电泳及竞争抑制 EL ISA实验检测其活性。结果 获得的 VH含 339bp,来自小鼠 Ig Gγ链 ,VL含 312 bp,来自小鼠κ链。 VH和 VL通过编码 (G4 S) 3连接肽的 4 5 bp序列连接在一起构成含 6 96 bp的 Sc Fv基因。 BL - 2 1(DE3)中表达的 Sc Fv抗体与融合蛋白 (Trx A)融合在一起并以包涵体的形式存在。 Trx A- Sc Fv相对分子质量约 4 0× 10 3,Sc Fv相对分子质量约 2 4× 10 3。竞争 EL ISA实验显示 :Trx A - Sc Fv可抑制 4 1%的 Mc Ab与抗原结合 ,而Sc Fv抗体则可抑制 5 3%的 Mc Ab与抗原结合。结论 我们成功构建了由 6 96个碱基组成的抗人 AFP单链抗体的基因 ,并在大肠杆菌获得了  相似文献   

12.
目的 获得胃癌单克隆抗体(简称单抗)MG7的噬菌体呈现型抗独特型单链抗体ScFv(抗-Id ScFv),为研制MG7的抗-Id ScFv重组胃癌瘤苗奠定基础。方法 以MG7单抗与匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联物免疫Balb/c小鼠,取脾分离mRNA。以逆转录聚合酶链反应技术分别扩增抗体重、轻链可变区基因(VH和VL),经linkerDNA连接ScFv基因片段。将ScFv DNA与噬粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1。在辅助噬菌体M13K07的作用下,获得重组噬菌体抗体ScFv。以单抗MG7对重组噬菌体抗ScFv进行四轮筛选后,随机挑取克隆,经噬菌体ELISA筛选抗-IdScFv单克隆,并对其所属抗-Id类型进行初步鉴定。结果 VH、VL和ScFvDNA分析约为340、320和750bp。经富集后,在随机筛检的60个克隆中得到24个噬菌体呈现型抗-IdScFv单克隆,阳性率为40%。在24个克隆中,有5个为β或γ型抗-IdScFv。结论 用噬菌体抗体技术能够成功地获得单抗MG7的抗-IdScFv,为开展用抗-IdScFv防治胃癌的研究创造了条件。  相似文献   

13.
Objective.To generate phage-displayed anti-idiotypic single chain variable fragments(anti-Id ScFv) to MG7 monoclonal antibody(McAb) directed against gastric carcinoma so as to lay a foundation for developing anti-Id ScFv vaccine of the cancer.Methods.Balb/c mice were immunized i.p.with MG7 McAb conjugated with keyhole limpet hemocyain (KLH),and mRNA was isolated from the spleens of the immunized mice.Heavy and light chain (VH and VL) genes of antibody were amplified separately and assembled into ScFv genes with a linker DNA by PCR.The ScFv genes were ligated into the phagemid vector pCANTAB5E and the ligated sample was transformed into competent E.coli TG1.The transformants were infected with M13K07 helper phage to yield recombinant phages displaying ScFv on the tips of M13 phage.After 4 founds of panning with MG7,the MG7-positive clones were selected by ELISA from the enriched phages.The types of the anti-Id ScFv displayed on the selected phage clones were preliminarily identified by competition ELISA.Results.The VH,VL and ScFv DNAs were about 340 bp,320bp and 750 bp respectively.Twenty-four MG7-positive clones were selected from 60 enriched phage clones,among which 5 displayed β or γ type anti-Id ScFv.Conclusion.The anti-Id ScFv to MG7 McAb can be successfully selected by recombinant phage antibody technique,which paves a way for the study of prevention and cure of gastric carcainoma by using anti-Id ScFv.  相似文献   

14.
目的以能与vWF-A3区特异结合的单克隆抗体SZ-123为模板,构建其单链抗体,为深入研究vWF-A3结构与功能的关系提供有力的工具。方法通过逆转录及多聚酶链反应,扩增并克隆单抗SZ-123的可变区基因VH、VL,经测序后加入连接肽,构建成SZ-123单链抗体(SZ-123 ScFV),并在大肠杆菌中进行表达。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western blot方法验证SZ-123 ScFV的免疫原性。结果 VH、VL可变区基因符合小鼠抗体可变区特征,SZ-123 ScFV基因拼接正确。表达产物除少量为分泌型外,主要以包涵体形式存在,表达量占菌体蛋白的20%。经过变性和复性后,获得具有生物活性的高纯度单链抗体片段。结论成功表达了SZ-123单链抗体,该小分子抗体具有特异结合vWF-A3区的能力。  相似文献   

15.
噬菌体呈现技术筛选抗黑色素瘤单链抗体   总被引:2,自引:0,他引:2  
目的:制备黑色素瘤单抗的单链可变区片段,用于肿瘤的诊断或靶向治疗。方法:从杂交瘤细胞提取总RNA,分别扩增出轻重链可变区基因(variable region of heavy chain,VH和variable region of light chain,VLDNA),连接形成单链抗体(single chain fragment variable region,ScFv)DNA,将SeFv与载体pCANTAB 5E的连接产物转化大肠杆菌TGl,经M13K07超感染后,获得噬菌体抗体ScFvcDNA文库,用黑色素瘤细胞LiBr对重组的噬菌体抗体进行3轮吸附-洗脱-扩增亲和筛选后,随机挑选克隆经ELISA筛选鉴定。结果:vH、VL和ScFv分别约为360、330、750bp,从随机筛检的30个克隆中获得10个高亲和性噬菌体呈现型ScFv单克隆。结论:用噬菌体呈现技术制备的黑色素瘤ScFv,可为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础。  相似文献   

16.
目的构建人源噬菌体抗体库,从中筛选出抗PeroxiredoxinⅠ(PrxⅠ)肺腺癌人源单链抗体。方法提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH和VL连接得到单链抗体(ScFv);将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。PCR检测TG1中ScFv基因插入率;1%琼脂糖凝胶电泳鉴定SfiI和NotI双酶切质粒的结果;以肺腺癌细胞株D549及在肺癌中高表达的抗氧化蛋白PrxI为靶抗原对抗体库进行筛选富集。将阳性克隆用IPTG诱导表达。用SDS-PAGE及Westernblotting鉴定该抗体;用ELISA法、免疫细胞化学法鉴定该抗体与人肺腺癌细胞的结合特异性。结果成功构建噬菌体单链抗体库。ScFv基因插入率为77%,双酶切鉴定检测到目的条带。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第6轮为第1轮的180倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中6个与A549细胞呈阳性反应,阳性率为60%。SDS-PAGE及Westernblottin...  相似文献   

17.
鼠抗脂多糖单链噬菌体抗体库的构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 构建一个鼠源性的抗脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)单链噬菌体抗体库 ,以供进一步生物医学应用。方法 用纯LPS免疫BALB/c小鼠 4个星期后 ,从脾细胞中提取总RNA ,用RT PCR技术扩增出小鼠抗体重链、轻链可变区基因 (VH ,VL) ,然后用Linker将VH ,VL交联形成单链抗体可变区片段 (ScFv)。经NotI、SfiI双酶切后与经同样双酶切的pCANTAB5E噬菌粒载体相连 ,转化入感受态大肠杆菌TG1,构建鼠抗LPS单链噬菌体抗体库 ,并随机抽取转化后的 4个大肠杆菌TG1菌落 ,以检测外源DNA的转入情况。结果 ELISA法检测小鼠血清中抗LPS的效价为 1∶12 80 0。提取的总RNA浓度为 12 .3 813 μg/ml ,纯度较好。扩增出的VH长约 3 4 0bp ,VL长约 3 2 0bp ,ScFv长约 80 0bp。转化入TG1后有约 1.9× 10 7个菌落 ,抽提 4个菌落后经SfiⅠ、NotⅠ双酶切的结果显示有 1个菌落的质粒转化进了外源DNA片段。结论 成功地构建出了一个有效库容量为 4.75× 10 6的鼠抗LPS单链噬菌体抗体库。  相似文献   

18.
目的:构建人源抗乳腺癌单链抗体(scfv)基因片断。方法:首先利用乳腺癌患者癌旁淋巴组织提取总RNA,然后通过RT—PCR分别扩增VH和VL基因片断,再将经纯化的VH和VL基因片断通过“重叠-延伸-拼接PCR”(SOE—PCR)而形成单链抗体(scfv)基因片断。结果:构建了750bp的人源抗乳腺癌单链抗体(scfv)基因片断。结论:成功地构建了人源抗乳腺癌单链抗体基因片断,为进一步构建人源抗乳腺癌单链抗体库提供了试验基础。  相似文献   

19.
重症肌无力抗乙酰胆碱受体单链抗体基因的构建   总被引:2,自引:2,他引:0  
[目的 ]构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 .[方法 ]应用PCR技术及基因克隆技术分两步完成重链和轻链可变区基因的克隆 ,再对构建的单链抗体A 7基因进行序列测定检测其核苷酸序列 .[结果 ]构建的重组质粒经序列分析 ,重链可变区基因长度为 36 9bp ,轻链可变区基因长度为 32 1bp ,单链抗体基因长度为 735bp ;单链抗体A 7基因正确地插入在载体质粒pHEN 2开放读码框架内 .[结论 ]成功地构建重症肌无力抗乙酰胆碱受体主要免疫原区单链抗体A 7基因 ,为进一步制备基因工程抗体奠定了基础 .  相似文献   

20.
目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处理污染的DNA,与NS-1细胞进行同步对照,通过RT-PCR,扩增获得2F9单抗VL基因和VH基因,分别克隆入pGEM○R-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。结果:2F9单抗VL基因全长321 bp,编码107个氨基酸,归属于小鼠Ig的Vκ基因,氨基酸序列分析结果显示,VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸;其VH基因全长360 bp,编码120个氨基酸,归属于小鼠Ig的VH基因,氨基酸序列分析结果显示,VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别是2F9单抗的VL和VH基因,为2F9基因工程抗体研究奠定了坚实的基础。  相似文献   

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