乙型肝炎病毒DNA复制状态与原发性肝癌的关系研究

目的 探讨血清乙型肝炎病毒(HBV)DNA复制与原发性肝癌(PHC)的关系.方法 选取2008年7月-2009年12月在我院门诊就诊并初次确诊且从未经过抗病毒治疗的PHC患者60例,采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法(ELISA法)检测HBV感染和HCV感染的血清标志物;采用荧光定量聚合酶连反应(PCR法)对HBV感染者行HBV-DNA定量检测.结果 60例PHC患者中,单纯HBV感染者53例(占88.3%).53例单纯HBV感染的PHC患者中,45例(84.9%)合并肝硬化;血清HBV-DNA阳性率为90.6%(48/53);HBV-DNA定量＜102 copies/ml 5例(占9.4%),102～104 copies/ml者8例(占15.1%),＞104copies/ml者40例(占75.5%).结论 大部分PHC患者存在HBV感染,且随着病毒载量的上升,PHC的构成比上升.可见,HBV感染与PHC发病有关,且PHC的发生与HBV-DNA活动性复制呈正相关.     

肾组织中乙型肝炎病毒DNA和RNA的存在及其意义

目的 探讨肾组织中乙型肝炎病毒（HBV）DNA和RNA的存在及其致病作用。方法 通过原位杂交检测27例HBV相关肾炎患者肾组织中HBV DNA和RNA的存在和分布情况,探讨HBV在肾组织中的致病机理。结果 患者肾组织中存在HBV和RNA,其分布与HBV抗原基本一致,主要存在于肾小管上皮细胞胞浆和细胞核内,以及肾小球系膜区,毛细血管袢等处;肾小管上皮细胞内HBV DNA和RNA阳性率分别为81．5％、63．0％,显著高于肾小球内的48．1％、25．9％（P＜0．05）。结论 HBV在肾组织,特别是在肾小管上皮细胞中存在并复制。复制时表达的抗原,与来自循环的抗原相似,都可能导致免疫复合物形成或细胞免疫而损伤肾脏致病。肾小管间质病变与小球病变同样决定HBV相关肾炎病情的进展和预后。     

重型乙型肝炎的病毒复制状况

In order to elucidate the relationship between hepatitis B virus (HBV) replication and severity of hepatitis B, HBV serological markers and HBV-DNA in 56 patients with chronic hepatitis B were detected using the methods of ELISA and PCR, respectively. The results showed that the positive prevalence of HBeAg and/or HBV-DNA in chronic severe hepatitis B (5/25) was much lower than that in non-severe chronic hepatitis B (26/31) (P < 0.01). The study provides the suggestive evidence that viral replication is significantly reduced in severe hepatitis B. Also, increased replication of HBV appears to be not the cause of hepatic necrosis in severe hepatitis B.     

石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒DNA的检测

石蜡包埋肝组织中乙型肝炎病毒ＤＮＡ的检测骆抗先，梁炽森，何海棠，侯金林，陈伟华，章廉检测肝内乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸（ＨＢＶＤＮＡ），一般从组织匀浆中提取ＤＮＡ，用斑点或Ｓｏｕｔｈｅｒｍ吸印转移杂交。我们曾报告１０９例慢性无症状ＨＢＶ携带者（ＡｓＣ）...     

siRNA抑制乙型肝炎病毒在HepG2.2.15细胞中的复制与表达

目的 探讨靶向HBV S基因的siRNA表达质粒在HepG2.2.15细胞中对HBV病毒的复制与表达的抑制效应及其抗病毒活性.方法 设计并构建了两个靶向HBV S基因的siRNA表达质粒S1和S2,随机设计的用于对照的非同源siRNA表达质粒S3.首先在HepG2.2.15细胞中通过实时荧光定量PCR评估该siRNA表达质粒对HBV mRNA表达的抑制效应,接着在HepG2.2.15细胞中通过ELISA方法进一步枪测它们的抗病毒活性细胞上清液中HBV标志性蛋白HBsAg、HBeAg的表达水平.结果 在siRNA表达质粒转染HepG2.2.15细胞后48 h,HBV S基因mRNA表达量下降64%～88%,HBsAg和HBeAg的表达水平分别降低了60%～82%和56%～78%.S1+S2联合使用转染细胞中显著抑制HBV病毒的复制与表达的效率,而对照组S3无抑制效果.结论 发现靶向HBV S基因的siRNA表达质粒能够在HepG2.2.15细胞中有效的抑制HBV病毒的复制与表达,并能够降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平.S1+S2联合使用转染细胞中可以显著抑制HBV的复制与表达的效率.RNAi可能成为防治HBV感染有效的全新的抗病毒防御策略.     

乙型肝炎患者病毒前S1抗原与病毒DNA的关系探讨

目的探讨乙型肝炎患者病毒前S1抗原与病毒DNA的关系.方法对186例乙型肝炎大三阳患者分别进行前S1抗原和DNA检测,前S1用酶联免疫法,DNA用蛋白印迹法.结果两法的阳性检出率分别为95.2%和88.2%,前S1抗原法检出率略高(RRR>-25%);两法检测结果呈变量关系(γ=0.038,P>0.05).结论作为反映乙肝病毒复制和传染性的血清学标志,前S1抗原和DNA与HBeAg相一致,与非PCR DNA法比较,前S1抗原法灵敏度稍高,可以作为非PCR DNA检测法的加强和补充.     

重型乙型肝炎的病毒复制状况

为了解重型乙型肝炎时乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）的复制状况，应用酶联免疫吸附实验和聚合酶链反应测定了５６例乙型肝炎病人的ＨＢＶ复制指标。慢性重型肝炎病人的ＨＢｅＡｇ和／或ＨＢＶ－ＤＮＡＰＣＲ阳性率明显低于非重型慢性肝炎（Ｐ＜０．０１），表明ＨＢＶ复制活跃不一定是重型肝炎发生的因素之一。进一步证明ＨＢＶ本身并无致肝细胞损伤作用     

利用重叠延伸PCR快速构建中国株乙型肝炎病毒的感染性克隆

目的：体外扩增中国株乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）的基因组全长序列,快速构建中国株HBV感染性克隆,建立中国株HBV体外复制细胞模型。方法：设计保守引物,扩增HBV全长基因组序列。对扩增到的HBV基因组进行DNA测序及计算机辅助分析,确定病毒的基因型。通过重叠延伸PCR（splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR）技术,构建1.3倍基因组长度的HBV感染性克隆质粒pHBV1.3。将pHBV1.3质粒转染人肝癌细胞系HepG2,采用Western Blot、酶联免疫吸附试验及Real-PCR检测病毒复制及表达情况。检测该感染性克隆对临床抗病毒药物阿德福韦的敏感性。结果：成功扩增到1株C基因型HBV全长基因组,其GenBank登陆号为KF495606。构建了中国株HBV感染性克隆pHBV1.3（C）质粒,该质粒能在肝癌细胞株中进行有效的复制、转录和表达。阿德福韦能在体外抑制该HBV感染性克隆的复制,抑制程度依赖于药物浓度。结论：利用SOE-PCR可快速构建HBV感染性克隆,所构建的感染性克隆能介导高水平病毒复制,可用于HBV复制机制和抗病毒等方面的研究。     

乙型肝炎病毒DNA转染与鸭乙型肝炎病毒DNA感染原代鸭肝细胞对比研究

目的探讨HBVDNA复制和表达的跨种属特异性,为HBVDNA转染跨种属原代肝细胞模型的建立提供实践基础和理论依据.方法分离培养原代鸭肝细胞(PDH),电转线性HBVDNA(转染组,1.19×1012拷贝/1×107PDH)或急性感染DHBV(感染组,4×108病毒颗粒/1×107PDH),分别于转染/感染后ld、3d、5d等时点检测PDH培养上清或裂解液中HBsAg、HBeAg与DHBsAg(采用IMX系统或ELISA检测);并采用DotBlotting检测PDH裂解液中总HBVDNA.于转染/感染后2d提取PDH总DNA采用SouthemBlotting分析HBVDNA与DHBV复制型式.以单纯电击或未感染的PDH为对照组.结果转染后1d、3d和5d各时点转染组PDH裂解液中HBsAg分别为15.24、14.55和5.13(P/N值,阳性≥2.1),HBeAg均为阴性;PDH培养上清中HBsAg与HBeAg均阴性;感染组各时点PDH上清中DHBsAg分别为14.6、31.53、34.73(S/N值,阳性≥2.1);上述各项指标于对照组均为阴性.DotBlotting显示转染组与感染组PDH各时点的裂解液中HBVDNA与DHBVDNA均为阳性,对照组为阴性;SouthernBlot分析显示转染组HBVDNA与感染组DHBV均为游离复制型,可见4.0kb以下分子涂抹带,包括rcDNA、cccDNA(scDNA)和ssDNA等复制中间体;未见整合型HBVDNA-高分子区(4～24kg)涂抹带.结论HBVDNA在PDH中的复制和表达与DHBV感染组相似,可能为肝细胞内环境依赖性,无严格种属特异性限制.     

K83A变异MxA蛋白抑制HBV复制体外研究

目的研究K83A变异MxA蛋白抑制HBV复制活性。方法将pcDNA3.1-MxA(wild-type)重组质粒(WT组)、pcDNA3.1-MxA-K83A重组质粒(K83A组)和pcDNA3.1空质粒(对照组)分别与pU19-1.24HBV重组质粒按2∶1比例瞬时共转染HepG2细胞,转染3d后western blot检测MxA蛋白表达,Abbott检测各组细胞上清HBsAg和HBeAg表达,定量PCR检测上清和细胞内HBV DNA水平,统计学分析结果。结果MxA、K83A组有较好的MxA蛋白表达;与对照组相比,K83A组和MxA组上清HBeAg分别下降73%和71%(P<0.05),上清HBV DNA水平分别下降2.22lg和2.11lg(P<0.01),细胞内HBV DNA水平下降1.89lg和1.78lg(P<0.01)。结论K83A变异不影响MxA蛋白抑制HBV复制活性。     

Toll样受体4介导抑制Bewo细胞中乙型肝炎病毒的复制

目的探讨Toll样受体4（TLR4）介导的天然免疫对Bewo细胞中乙型肝炎病毒（HBV）复制的影响。方法首先用TLR4配体LPS处理Bewo细胞,观察细胞TLR4 mRNA表达的动力学。然后将2μg 1.3倍HBV全基因重组质粒pcDNA3.1（＋）-HBV1.3转染Bewo细胞,12h后,以LPS处理3d。最后,用抗TLR4处理Bewo细胞1h后,加入10μg/ml LPS刺激。采用荧光定量RT-PCR、微粒子酶免疫分析法（MEIA）和荧光定量PCR法分别检测细胞TLR4 mRNA表达、HBsAg、HBeAg及HBV DNA水平。结果 LPS可显著诱导Bewo细胞TLR4 mRNA表达（P〈0.05）,呈时间和剂量依赖性;与对照组比较,LPS可显著抑制HBV复制（P〈0.001）,LPS对HBV DNA、HBsAg及HBeAg的抑制率（%）分别为29.70±6.03、32.12±5.98和33.89±1.28。抗TLR4可显著逆转LPS对HBV复制的抑制作用（P〈0.01）。结论 TLR4介导的天然免疫可一定程度地抑制Bewo细胞中HBV复制,为防治HBV宫内感染提供了新的途径。     

以S区为靶位的小干扰RNA抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的以乙型肝炎病毒（HBV）S基因区为靶位,构建表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro,体外观察siRNA抗HBV的效果。方法以HepG2．2．15细胞为靶细胞,利用脂质体Metafectene转染表达siRNA的质粒载体pSilencer3．1-H1hygro于细胞中,用时间分辨免疫荧光分析法（IFMA法）检测细胞上清中HBsAg和HBeAg,用定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测细胞上清DNA,用逆转录（RT）-PCR检测HBV mRNA。结果成功构建了表达siRNA的转录质粒载体,siRNA可抑制HBV的抗原表达和病毒复制,1、2、4μgsiRNA对HBsAg的抑制率分别为75％、82％、89％;对HBeAg的抑制率分别为32％、38％、43％;对HBVDNA的抑制率分别为30％、43％、49％;对HBVRNA的抑制率分别为30％、70％、90％。结论靶向HBVS区的siRNA能抑制HBV的抗原表达和复制;siRNA抑制作用呈剂量依赖性和序列特异性。     

乙型肝炎病毒感染正常人肾小管上皮细胞的实验研究

目的探讨正常人肾小管上皮细胞（HKC）对乙型肝炎病毒（HBV）的易感性。方法（1）体外培养的HKC传至6孔板中,接种密度为1×10^6个／ml,孵育24h后分受感染和阴性对照两组。受感染组加入0．5mlHepG2．2．15细胞上清液（已知该体外培养的细胞系可随细胞传代释放HBV病毒颗粒）;阴性对照组加入015mI10％FCS—DMEM／F-12培养液。两组HKC继续孵育72h,消化、离心沉淀,PBS清洗,实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）检测两组HKC中的HBVDNA。（2）将HKC细胞传代并接种至2个6孔板中盖玻片上制作细胞爬片,接种密度为1×10^6个／ml,24h后行HBV感染实验。然后将两个6孔板分别作为：（1）受感染组：往六孔板中加入制备好的感染用HepG2．2．15细胞上清液2ml;（2）阴性对照组：往六孔板中加入2mI10％FCS—DMEM／F－12培养液。将HepG2．2．15细胞分别传代并接种至6孔板中盖玻片上制作细胞爬片,接种密度为1×10^6个／ml,24h后作为阳性对照组：往六孔板中加入2ml10％FCS—DMEM培养液继续孵育72h,原位杂交检测各组中的HBVDNA。结果实时荧光定量聚合酶链反应检测到受感染组HKC的基因组中HBVDNA的存在,受感染组HKC原位杂交检测HBVDNA阳性,呈核型。结论体外培养的正常HKC对HBV易感。     

高水平乙型肝炎病毒复制诱导肝细胞QSG-7701凋亡

目的 观察高水平的HBV复制对QSG-7701细胞可能产生的致病效应.方法 采用磷酸钙沉淀方法转染质粒pUC18-HBV1.2(实验组)和空质粒pUC18(对照组)至QSG-7701细胞,细胞计数观察细胞生长曲线.转染后4 d,采用荧光实时定量PCR方法检测培养上清中HBV DNA水平;免疫荧光细胞化学染色检测细胞内的HBsAg表达;电子显微镜和末端脱氧核苷酸转移酶介导duTP缺口末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡;Oliga信号传导基因芯片检测实验组和对照组的基因差异表达.结果 对照组细胞转染6 d后细胞数量增加(8.3±1.2)倍,凋亡细胞极少见.实验组在转染后6 d细胞数量仅增加(1.1±0.2)倍,HBsAg阳性细胞35.4%±6.7%,细胞凋亡占15.2%±4.3%.基因差异表达谱分析显示与细胞生长和凋亡相关的部分基因如CASP3(2.7981)、CASP7(2.2643)、3-Apr(3.5013)、CDC2(0.4380)、MAPK6(0.4447)和MAP3K2(0.2785)等表达水平发生显著改变.结论 高水平的HBV复制明显抑制QSG-7701细胞生长,并诱导部分细胞发生凋亡.     

乙型肝炎病毒 P区RNA干扰抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒表面抗原和e抗原分泌的实验研究

目的观察针对乙型肝炎病毒（HBV）P区基因的RNA干扰（RNAi）表达载体pGE—HBVP在HepG2．2．15（2．2．15）细胞中抑制HBV表面抗原（HBsAg）和e抗原（HBeAg）的分泌效应,以阐明HBVP区小干扰RNA（siRNA）抑制HBV复制和蛋白表达的影响。方法构建并鉴定pGE—HBVP,将此载体转染至完整HBV复制模型2．2．15细胞,用化学发光免疫检测法检测并分析转染后不同时间段细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的含量变化,并用免疫细胞化学方法观察转染后细胞中HBsAg的表达变化。结果成功构建了5个针对HBVP区的RNAi表达载体pGE—HBVP1～pGE—HBVP5,其中pGE—HBVP1和pGE—HBVP2具有明显的HBsAg和HBeAg分泌抑制效应和表达抑制效应。抑制率最高的pGE—HBVP2在转染2．2．15细胞效率为30％～40％的基础上,转染后24、48、72和96h培养上清中的HBsAg分泌抑制率分别为28．88％、32．28％、29．10％和18．42％,HBeAg的分泌抑制率分别为38．33％、27．50％、33．41％和12．60％。细胞免疫细胞化学结果显示,pGE-1空载体转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为82％,而pGE—HBVP2转染后2．2．15细胞的HBsAg的表达阳性率约为50％,和pGE-1空载体相比阳性率显著下降。结论针对HBVP区的RNAi可以抑制HBV病毒抗原的分泌和表达。     

应用RNA干扰治疗小鼠急性乙型肝炎病毒感染

目的建立小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,在此基础上观察小干扰RNA(siRNA)对HBV复制和表达的影响。方法通过尾静脉注射1.3倍的HBV真核表达质粒pHBV1.3建立小鼠急性乙型肝炎感染模型,再将其与针对乙型肝炎病毒核心区的siRNA表达载体(pSI C)共注射,于注射后第6天取血测血清HBsAg(ELISA),做肝组织HBcAg免疫组化,通过RT PCR检测肝组织HBVC区mRNA转录子的水平。同时设立PBS对照组、无关干扰组与突变干扰组。结果转染后第6天血清HBSAg在pHBV1.3感染组中高表达(A值为4.08～9.04,平均值为5.07±1.07,A值≥2.1为阳性),肝内HBcAg阳性率为5%～10%;pSI C干扰组HBSAg,HBcAg的表达均受到抑制,血清HBsAg阴性,A值为0.04～1.5,平均值为0.62±0.59,与感染组相比有显著性差异(P<0.01),肝内HBcAg几乎无表达,RT PCR示肝内HBVCmRNA水平明显降低。而无关干扰pGFP及突变的干扰序列pSI Cmut则无此作用。结论RNAi技术能特异,高效地抑制小鼠体内HBV的复制和表达,提示siRNA作为一种新型抗病毒药物的巨大潜能,而通过水动力法建立的小鼠急性乙型肝炎病毒感染的动物模型,一定程度上解决了长期以来缺乏合适的HBV感染动物模型的问题,为今后进行药物筛选及抗病毒治疗的研究拓展了新的思路。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞的分离培养及功能研究

目的　研究慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞 (DC)免疫诱导T淋巴细胞增殖的能力及其与DC免疫功能的相关性。方法　慢性乙型肝炎患者 1 0例 ,从外周血中分离单个核细胞 ,在含rhGM -CSF、rhIL - 4、TNF -α的完全培养基中诱导培养为DC ,并与同种异体T细胞作用 ,用液体闪烁仪观察DC对T细胞增殖的作用。另选取健康成人 1 0例作为正常对照。结果　慢性乙型肝炎患者组DC其诱导同种异体T淋巴细胞增殖的能力每分钟液闪计数 (cpm为 1 0 635± 876) ,明显低于正常对照组 (cpm为 42 91 8±7889,P <0 .0 1 )。结论　慢性乙型肝炎患者外周血DC免疫功能低下