三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较

目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2,而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

基于SRY基因的人血迹性别快速鉴定的方法学研究

目的:在案发现场快速准确的锁定犯罪嫌疑人性别,缩小嫌疑人范围,为基层公安机关案件侦查提供技术支持。方法:通过对碱裂解法进行改良并建立人类凝固血液的基因组DNA提取方法;根据Y染色体的SRY基因序列设计特异性引物,优化PCR扩增反应条件,扩增产物经SYBR Green I染色后紫外光下观察。结果:改良碱裂解法中组2所得DNA浓度为(271.08±143.28)ng/μL,显著优于组1所得(P0.05),且经ITS序列验证均能扩增出目的条带;在PCR扩增产物加入SYBR GreenⅠ染料后于紫外光下观察,男性血样的PCR扩增产物呈现绿色荧光,而女性血样的PCR扩增产物未有荧光。结论:使用改良碱裂解法中的组2快速提取案发现场凝血DNA,进行特异性PCR扩增后,观察加入SYBR Green I后的PCR产物紫外光下是否有绿色荧光即能判断性别,该方法准确、可靠,较常规方法缩短1~2 h。     

荧光染料SYBR GreenⅠ及EB在定量PCR中敏感性比较

目的比较荧光染料SYBR Green I及EB在定量PCR诊断中检测DNA的敏感性.方法分别用琼脂糖凝胶电泳SYBR Green I染色及EB染色,检测26例21-三体综合征患者及20例正常人DNA PCR扩增产物,并进行光密度分析比较.结果SYBR Green I染色于24个循环PCR产物带型清楚,可准确定量检测;EB染色则在28个循环才能进行定量分析.结论荧光染料SYBR Green I染色较EB染色测量DNA敏感、快捷,在定量PCR技术中值得推广应用.     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测microRNA

目的:用改进的RNA加尾和引物延伸RT-PCR法实时定量检测组织中的microRNAs(miRNAs),并评价其敏感性和特异性.方法:提取组织中的小于200 bp的RNA,用poly(A)聚合酶在其3'末端加尾,再用5'带40 nt延伸序列的单碱基锚定Olig-dT引物进行反转录,得到约80 nt的cDNA,然后用特异引物进行SYBR Green实时定量PCR扩增.结果:该法线性范围宽,可检测低丰度的miRNAs,能特异区分3'末端碱基不同的亚型,但对序列中间个别碱基不同的亚型不能鉴别.对15种miRNA在大鼠心、肝和大脑皮层的相对表达的检测验证了该法的可靠性.另外,海马组织中的miRNAs表达与大脑皮层组织有一定差异.熔解曲线的单一峰型和电泳检测到的单一条带都证明了扩增的特异性.结论:该法可快速、敏感地检测不同组织中大多数miRNAs的表达差异,可用于寻找组织特异及疾病相关的miRNAs.     

新型核酸染料SYBR-Green在检测基因扩增产物中的应用

目的：将核酸SYBR—Green染料应用于端粒酶活性检测和食物中毒致病菌的PCR—SSCP分析。方法：采用TRAP法检测A549肺腺癌细胞株、293细胞株、HL—60白血病细胞株端粒酶活性。金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、腊祥芽胞杆菌标准株增菌后，进行PCR—SSCP分析。在上述两种检测方法中，扩增产物电泳后均采用SYBR—Green染色。结果：TRAP—SYBR—Green染色法检测HL—60白血病细胞株端粒酶活性的灵敏度可达15个细胞左右。PCR—SSCP检测常见食物中毒致病菌的敏感性可达10～15个鼠伤寒沙门氏菌细胞。结论；SYBR—Green染色法用于端粒酶活性的检测和致病菌的PCR—SSCP分析，具有快速、简便、灵敏度高、安全的特点。     

急性髓细胞性白血病病人TCRζ链基因表达特点

目的 建立实时定量PCR方法检测TCRζ链表达水平的方法,了解急性髓细胞性白血病病人外周血TCRζ链基因表达水平.方法 采用SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR和相对定量分析法检测31例急性髓细胞性白血病患者(M1型6例,M2型15例,M3型10例)和30例正常人外周血的单个核细胞的TCRζ链表达情况,以β2微球蛋白基因(Β2m)作为内参,根据相对定量公式2-△△α计算急性髓细胞性白血病患者与正常人TCRζ链表达差异倍数.结果 与正常人相比,急性髓细胞性白血病患者TCRζ链表达特点可以分为表达缺失(16%)、表达下降(26%)和表达上升(58%)三种情况.而三种不同亚型急性髓细胞性白血病之间的TCRζ链表达模式相似.结论 本研究成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光实时定量PCR和相关定量分析TCRζ链表达水平技术,并首先报道了急性髓细胞性白血病病人TCRζ链表达水平的变化.     

SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响

目的 建立SYBR Green Ⅰ Real-time PCR检测HBV-DNA方法,并检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响.方法 提取HepG2.2.15细胞DNA,PCR扩增后纯化,PCR纯化产物梯度稀释作为标准品,采用SYBR Green Ⅰ Real-time PCR 检测,建立标准曲线,并分析方法的特异性、灵敏度、重复性和稳定性.运用建立的SYBR Green Ⅰ 方法检测IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA影响,并与Taqman方法进行比较.结果 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法特异性、重复性及稳定性均较好,线性范围为107~102copies,检测灵敏度可达102copies.IFN-CSP对HepG2.2.15细胞内HBV-DNA具有抑制效果,且呈剂量依赖性.SYBR Green Ⅰ 方法与Taqman商业试剂盒检测结果差异无统计学意义.结论 SYBR Green Ⅰ Real-time PCR方法简便快速、结果准确、价格低廉,可以满足HBV-DNA拷贝数检测的需要.     

实时定量PCR检测大鼠神经激肽1受体mRNA方法的建立及评价

目的:建立检测大鼠神经激肽1(NK1)受体mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法,为检测大鼠NK1受体基因表达提供有效的手段.方法:提取大鼠中脑总RNA,扩增NK1受体基因片段,将其克隆入pMD-18T载体,制作NK1受体标准品质粒;应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料,对连续稀释的标准品质粒进行实时...     

鸭乙型肝炎病毒核酸荧光定量PCR方法的建立及应用

目的：建立鸭乙型肝炎病毒核酸(DHBV DNA)荧光定量的方法。方法：根据DHBV DNAS基因区的序列设计扩增所需3条引物，通过偶联反应用AmpliSensor荧光信号标记半巢式引物，经过前期不对称扩增、半巢式扩增及在线检测建立DHBV DNA阳性标准品QPCR的标准曲线，并将70份鸭血清分别用荧光定量PCR方法和地高辛标记的DHBV DNA探针斑点杂交的方法检测，比较结果的相关性。结果：DHBV DNA阳性标准品经过30次循环后，扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，可以看出有180bp、70bp两个片段，与设计的片段大小相符，扩增产物的浓度与标准品的起始浓度成正比，扩增指数的数值大小与该循环时己合成的扩增产物的量成正比，起始浓度的大小与要合成的一定扩增产物的量所需的循环次数成反比。用荧定量PCR方法和斑点杂交的方法检测血清中DHBV DNA的结果有良好的相关性(r＝0．97，P＜0.01，ν＝58)。结论：荧光定量PCR方法可作为检测DHBV DNA含量的一个重要手段。     

Comparison of polymerase chain reaction and catalyzed signal amplification in situ hybridization methods for human papillomavirus detection in paraffin-embedded cervical preneoplastic and neoplastic lesions

BACKGROUND: Two molecular methods for HPV genotyping in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue were evaluated: in house polymerase chain reaction assay (PCR) with consensus and type-specific primers and a novel procedure of in situ hybridization-a catalyzed signal amplification system (CSA-ISH, Genpoint, DAKO, Glostrup, Denmark). The number of HPV positive cases and detected viral types were compared in cervical biopsies and cone specimens according to histopathological diagnosis. Primer efficiency in detecting various types of HPV by PCR method was evaluated. METHODS: DNA samples (101) were used as a template to amplify with three pairs of consensus (MY09/11, GP5+/6 +, CPI/IIG) and four type-specific HPV primers (HPV-6/11, 18, 16 and 33). The according histological tissue sections were analyzed with CSA-ISH method, using commercial HPV biotinylated probes HPV-6/11, 16/18 and 31/33/51. RESULTS: The degree of concordance for PCR and CSA-ISH was 64.4%. In 63 of 101 samples (62.4%), HPV was detected by PCR, while only 35 (34.7%) were positive using CSA-ISH. CSA-ISH found lower percentages for all HPV types, except HPV-6/11. A lower percentage of positive results in all high-grade lesions was detected by CSA-ISH. Multiple infections were detected by PCR in only one sample and in three samples by CSA-ISH. Detection with My09/11 primers followed by Gp5+/6+ primers, in nested reaction, gave the highest number of positive results: 58 of 63 (92%). None of the samples diagnosed as condylomata planum or CIN I was positive for HPV-6/11 (low risk type), which was detected exclusively in condylomata acuminatum group. CONCLUSIONS: A significantly higher number of positive samples was detected with PCR than with CSA-ISH method. CSA-ISH method should be improved, especially in detecting HPV in high-grade lesions. CSA-ISH may be more accurate in detection of multiple infections. GP5+/6+ in nested reaction after MY09/11 detected the highest number of positive results. Samples diagnosed as benign lesions positive on HPV-X must be monitored as possible candidates for progression. CIN I lesions, which were HPV negative, probably will not progress. This finding may be important in planning therapy and avoiding unnecessary treatment.     

人巨细胞病毒的PCR检测

①目的 寻找早期快速检测人类巨细胞病毒（HCMV）感染的敏感方法。②方法 用HCMV即刻早期（IE）基因和晚期（LA）基因的7对待异性引物分别进行普通聚合酶链的反应（PCR），套式PCR（nPCR)和双重PCR，检测血清中的HCMV DNA，比较不同引物及不同PCR方法的灵敏度。③结果 同一基因的不同引物扩增HCMV DNA灵敏度差别无显著意义；LA基因的引物扩增灵敏度高于IE基因的引物；3种方法中以nPCR灵敏度最高，其次为双重PCR，普通PCR最低。④结论 用LA基因的特异性引物进行nPCR是早期快速检测HCMV感染的敏感方法。     

不同镁离子浓度对TTV核酸检测的影响

目的 :确定输血传播病毒TTV核酸检测方法中的最佳镁离子浓度。方法 :根据TTVORF2区基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记探针。结果 :在确定最佳引物浓度之后 ,分别建立不同镁离子浓度的PCR检测体系 ,根据反应曲线选择最佳镁离子浓度。结论 :最佳镁离子浓度应为 4 .0mmol/L。     

鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法。方法分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及Taq Man探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性。结果该方法最低检测线限为1.50×10²copies/μL,批内和批间检测变异系数分别小于0.5%和4%,且对其他常见水禽病毒无特异性扩增。临床应用结果显示检出率明显高于常规RT-PCR方法。结论建立了一种鹅源星状病毒的Taq Man荧光定量PCR方法,该方法特异性强,灵敏度高且重复性良好,适用于鹅源星状病毒的早期检测和定量分析。     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的: 构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品。方法: 用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果: PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上。结论: 本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品。     

检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种高敏感度的检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)DNA的实时荧光定量PCR方法,为针对HSV-2潜伏感染的治疗性疫苗和抗病毒药物疗效提供一个评价方法。方法 依据HSV-2糖蛋白D(gD)基因序列,使用序列比对软件,选取其保守区序列设计引物及TaqMan探针并进行筛选;以gD基因重组质粒pcDNA3-HSV-2 gD作为标准模板,对该检测方法的反应条件进行优化,提高其检测特异性、敏感度和重现性。结果 该检测方法特异性好,检测的最低拷贝数可达到2个拷贝,线性范围为2×10⁰~2×10⁸拷贝/反应,是普通PCR敏感度的10³倍。该检测方法组间和组内变异系数均低于5%,说明该检测方法具有良好稳定性。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法用于检测痕量HSV-2 DNA具有特异、敏感、定量和重现性好的优点。     

聚合酶链反应对输血后丙型肝炎的诊断研究

为研究丙型肝炎病毒血症的诊断,以三组与病毒不同区段互补的引物进行反转录巢式聚合酶链反应检测输血后肝炎17例(急性期14例)。按日本毒株的引物检出35％,按非编码区序列的引物检出76％的HCV RNA,两组引物共检出94％,而按Chiron原型的引物检测6例均阴性。HCV多变异,且血清水平极低,用几组不同保守区段的引物,进行巢式PCR,可以获得较高的检出率。     

PCR方法检测单核细胞增多性李斯特菌的实验研究

目的建立一种快速、简便、准确，适合于基层应用的检测鉴定Lm的方法。方法选取iap基因作为靶序列设计一对引物，用该引物对4株标准株及4株无关茵进行PCR扩增，得到进一步验证。采用PCR和常规方法同时对人工感染的牛奶进行检测鉴定。结果4株标准株获得了预期700bp左右的扩增片段，而同属的L.welshimefi、L．grayi、粪肠球菌和蜡样芽孢杆菌均没有这一特异性条带。检测人工感染牛奶20份，检出率为90％，高于传统分离培养法（60％）。结论建立的PCR法可用于单增李斯特氏菌的快速、特异、敏感诊断。     

中药材鳖甲的位点特异性PCR鉴定研究

目的 本研究旨在建立一种简便、实用的鳖甲DNA分子鉴定方法。方法 根据中华鳖和鳖甲混淆品原动物的125rRNA基因片段的序列数据库,找出中华鳖与其它鳖科动物有明显区别的位点,设计1对能特异性鉴别中华鳖的引物,然后利用鳖甲中残存的DNA,通过PCR拉增,即可准确鉴别鳖甲。结果 用这对引物对不同来源的10块鳖甲进行鉴定结果表明,其中有3块为伪品,结果与DNA序列分析鉴定一致。还测定了斑龟和鳖甲一伪品12SrRNA基因片段序列。结论 该引物配置药材鉴定试盒可在鳖甲类药材鉴定使用。