不同转移潜能人前列腺癌细胞KAI1基因的表达

目的：探讨人前列腺癌细胞转移潜能与ＫＡＩ１基因表达的关系。方法：运用Ｎｏｒｔｈｅｍ印迹杂交检测ＫＡＩ１基因在不同转移潜能人前列腺癌细胞中的表达，以甲基化分析与聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）研究ＫＡＩ１低表达的机制。结果：在转移性人前列腺癌细胞系ＰＣ３和ＰＣ３Ｍ中不论其转移潜能强弱，ＫＡＩ１ ｍＲＮＡ表达均降低。甲基化分析未发现ＫＡＩ１基因５’－启动子部位ＣＣ＾ｍ５ＧＧＧＧ甲基     

用变性高效液相色谱检测CpG岛胞嘧啶甲基化

目的 :建立一种新型的CpG岛胞嘧啶甲基化快速检测方法。方法 :用亚硫酸氢钠处理DNA ,再用链特异性聚合酶链式反应 (PCR)对错配修复基因hMLH1启动子含CpG位点的靶序列进行扩增 ;利用变性高效液相色谱 (DHPLC)在部分变性温度下测定靶序列的保留时间 ,并与亚硫酸氢钠 酶切法测定结果进行比较。结果 :用DHPLC对结肠癌细胞株RKO和胃癌细胞株PACM 82的hMLH1启动子进行测定 ,发现RKO细胞PCR产物的保留时间明显长于PACM82细胞 (6 .7min比 6 .2min)。RKO细胞PCR产物保留时间延长是亚硫酸氢钠处理后的模板中胞嘧啶和岛嘌呤含量较PACM 82高所致。从此结果分析 ,可以判断出RKO的hMLH1启动子已甲基化 ,而PACM82细胞未甲基化。此结论与酶切法结果完全一致。结论 :新方法可以快速检测CpG岛胞嘧啶甲基化。     

COMPARATIVEANALYSISOFCONVENTIONALCRANIONTOMYWITHSTEREOTACTICDRAINAGEUSINGUR0KINASEINCASESWITHSPONTAN

ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥＡＮＡＬＹＳＩＳＯＦＣＯＮＶＥＮＴＩＯＮＡＬＣＲＡＮＩＯＮＴＯＭＹＷＩＴＨＳＴＥＲＥＯＴＡＣＴＩＣＤＲＡＩＮＡＧＥＵＳＩＮＧＵＲ０ＫＩＮＡＳＥＩＮＣＡＳＥＳＷＩＴＨＳＰＯＮＴＡＮＥ０ＵＳＩＮＴＲＡＣＥＲＥＢＲＡＬＨＥＭＡＴＯＭＡ...     

肿瘤转移抑制基因KAI1/CD82在不同转移潜能癌细胞中的表达

目的 探讨新发现的肿瘤转移抑制基因ＫＡＩ１／ＣＤ８２与人癌细胞转移潜能的关系,方法 应用Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交及聚合酶链反应－单链构象多态性分析（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）方法,检测３组８种不同转移具有转移性的前列腺癌细胞系ＰＣ３和ＰＣ３Ｍ及高转移性的人肺ＰＧ细胞,ＫＡＩ１ｍＲＮＡ的表达降低（积分吸光度分别为０．０３１９,０．０２６６和０．０５４９）而在无转移性的人肺ＰＡａ细胞则为高表达（积分吸光度     

日本血吸虫谷胱甘肽转移酶基因在真核表达载体中的亚克隆

目的 将日本血吸虫谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因片段克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶＫ ,以便以进行酸疫苗的研究。方法 特定核苷酸引物的设计和合成,ＴＲＩＺＯＬ试剂以日本血吸虫成虫ＲＮＡ〈ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＧＳＴ基因编码序列,将扩增产物连接ＰＧＥＭ－Ｔ克降体,再亚克隆到真核表达载体ＰＢＫＣＭＶ中。结果 ＲＴ－ＰＣＲ法特异性扩增出ＳｊＧＳＴ编码基因片段。其大小约为６７０ｂｐ,经双酶切、ＰＣＲ鉴定表明所构     

I型糖尿病合并肺癌患者HLA—DQA1启动子的核苷酸序列

应用聚合酶链反应产物与序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ／ＳＳＯＰ），ＰＣＲ产物单链的构象（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ直接测序等方法，鉴定１例Ｉ型糖尿病合并肺癌患者ＨＬＡ－ＤＱＡ１等位基因及ＤＱＡ１启动子核苷酸序列。结果显示该患者携带ＨＬＡ－ＤＱＡ１０５０１／ＤＱＡ１０３０１等位基因；启动子区核苷酸序列第一位１５５位为Ｇ／Ａ杂合型，且－１６１至－１６３ｂｐ发生ＣＡＡ碱基缺失突变。该突变可能影响顺序     

外周淋巴细胞FMR—1mRNA的检测

采用逆转录ＰＣＲ技术检测人外周淋巴细胞ＦＭＲ－１ｍＲＮＡ表达。对１０名在临床筛查中被认为可能患有脆性Ｘ综合征的男性学生进行了检测，其中２例可疑男性样品中未检测出ＦＭＲ－１ｍＮＲＡ表达。ＤＮＡ印迹杂交和异常甲基化ＰＣＲ检测证实这２例患者同样有ＦＭＲ－１基因５＇ＣｐＧ岛甲基化和（ＣＧＧ）ｎ扩展。     

Ⅰ型糖尿病合并肺癌患者HLA－DQA_1启动子的核苷酸序列

应用聚合酶链反应产物与序列特异性寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ／ＳＳＯＰ）、ＰＣＲ产物单链构象分析（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）和ＰＣＲ直接测序等方法，鉴定１例Ⅰ型糖尿病合并肺癌患者ＨＬＡ－ＤＯＡ_１等位基因及ＤＱＡ_１启动子核苷酸序列。结果显示该患者携带ＨＬＡ－ＤＱＡ_１（０５０１）／ＤＱＡ_１（０３０１）等位基因；启动子区核苷酸序列第－１５５位为Ｇ／Ａ杂合型，且一１６１至一１６３ｂｐ发生ＣＡＡ碱基缺失突变。该突变可能影响顺式调控元件与反式因子的相互作用，并在转录水平调控ＨＬＡ－ＤＱＡ_１的表达。这种突变是否与肺癌发病相关，有待深入研究。     

非霍奇金淋巴瘤细胞增殖活性和组织学恶性程度及预后的关系

１３１例非霍奇金淋巴瘤（ＮＨＬ）按国际工作分类分低、中、高度恶性（ＬＧ、ＭＧ、ＨＧ）３组。对ＮＨＬ和１４例反应性增生淋巴组织（ＲＬＨ）作核分裂计数（ＭＦ），银染核仁组成区（ＡｇＮＯＲｓ）计数，并用ＭＢＣ法检测部分病例的增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）和Ｋｉ＿６７抗原。ＭＦ、ＡｇＮＯＲｓ、ＰＣＮＡ及Ｋｉ＿６７检测结果有较好相关性（ｒ值０．６１２，Ｐ＜０．０１），均和ＮＨＬ恶性度呈正相关，ＬＧ、ＭＧ、ＨＧ及ＲＬＨ组间有显著性差异（Ｐ＜０．０１，但ＬＧ和ＲＬＨ组Ｐ＞０．０５），表明细胞增殖活性的检测有助于了解ＮＨＬ恶性度，但不能区分ＬＧ和ＲＬＨ。ＭＧ中弥漫小裂细胞型（ＤＳＣ）细胞增殖活性低于同组其它类型（Ｐ＜０．０５），但与ＬＧ无显著性差异（Ｐ＞０．０５），预后相对较好，拟属ＬＧ。ＭＦ、ＡｇＮＯＲｓ和ＰＣＮＡ值越高，生存期越短，表明细胞增殖活性有助于预测ＮＨＬ预后。ＭＦ和ＡｇＮＯＲｓ经济易行；Ｋｉ６７全面反映增殖细胞的数量，仅用于冰冻切片；ＰＣＮＡ可用于石蜡切片，便于回顾性研究。     

HLA－DQA1启动子区多态性与胰岛素依赖型糖尿病发病的关系

应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物直接序列分析，鉴定早发及迟发胰岛素依赖型糖尿病（ＩＤＤＭ）患者ＨＬＡ－ＤＱＡ１５′－上游启动子区（ＱＡＰ）的核苷酸序列。结果表明，早发ＩＤＤＭ的ＱＡＰ－９２ｂｐ位发生胞嘧啶被胸腺嘧啶取代（Ｃ→Ｔ－９２）；迟发糖尿病在－１４６ｂｐ位置发生胸腺嘧啶（Ｔ）被胞嘧啶（Ｃ）取代，即Ｔ→Ｃ－４６。提示启动子区不同位置单个碱基取代，可能不同程度上改变其与ＤＮＡ结合蛋白的亲和力，而导致ＨＬＡ－ＤＯＡ１异常诱导表达。     

胃癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态及其与蛋白表达的关系

目的：探讨胃癌组织中hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化及蛋白的表达与胃癌生物学行为的关系,并分析hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化与其蛋白表达的相关性。方法：采用甲基化特异性PCR（methylation-specific PCR,MSP）技术和免疫组织化学SP法检测45例患者胃癌组织、正常胃组织中hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化情况及蛋白的表达。结果：hMLH1基因启动子区CpG岛在胃癌及正常组织中的甲基化阳性率分别为33.3%和0（P〈0.05）;hMLH1蛋白在胃癌及正常组织中的阳性率分别为57.8%和95.2%（P〈0.05）;hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化及蛋白的表达与胃癌的临床病理参数无关（P〉0.05）;hMLH1基因启动子甲基化与hMLH1蛋白表达呈明显的负相关（P〈0.05）。结论：hMLH1基因启动子区CpG岛的异常甲基化是引起蛋白表达缺失的主要原因,hMLH1蛋白表达缺失与胃癌的发生有关。     

胃癌及癌前病变组织中hMLH1基因启动子甲基化与MSI的关系

目的研究散发性胃癌中hMLH1基因启动子区5′端CpG岛甲基化、微卫星不稳定性（MSI）发生的情况及两者之间的关系，探讨胃癌发生的分子机制。方法采用PCR扩增-聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染法检测（BAT25、BAT26、BAT40、D2S123、D5S346）5个位点的MSI，甲基化特异性-PCR（MSP）检测hMLH1甲基化异常情况。结果30例胃癌标本中检出hMLH1甲基化8例．占26．7％；50例胃癌前病变中检出hMLH1甲基化9例．占18．0％；30例正常胃黏膜未见hMLH1甲基化。30例胃癌中微卫星高度不稳定（MSI-H）7例，均榆测到hMLH1甲基化（100．0％）；低度不稳定（MSI-L）1例，未检测到hMLH1甲基化；稳定（MSS）22例，hMLH1甲基化仅1例（4．5％）。微卫星不稳定的15例胃癌前病变组织中，hMI，H1甲基化8例（53．3％），而微卫星稳定35例胃癌前病变组织中，hMLH1甲基化仅1例（2．9%）。结论①胃癌中存在hMLH1基因启动子甲基化，hMLH1基因甲基化可能参与了胃癌的发生。②hMLH1基因启动子甲魅化在胃癌前病变阶段就已经存在，町能是胃癌发生的早期事件之一。③hMLH1基因甲基化和MSI密切相关，它是导致胃癌组织出现MSI的重要吲索，MSI在胃癌发生、发展过程中发挥一定作用。     

散发性结直肠癌中hMLH1基因启动子区CpG岛MVPs图谱的绘制与分析

目的 绘制散发性结直肠癌患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化可变位点(methylation variable positions, MVPs)图谱,分析MVPs图谱与hMLH1蛋白表达的关系,寻找CpG岛中影响蛋白表达的关键CpG位点.方法 采用重亚硫酸盐测序方法检测患者hMLH1基因启动子区CpG岛甲基化状态;采用免疫组化方法检测相应蛋白表达水平.结果 CpG岛1(CGI-Ⅰ)甲基化阳性率为20 %(6/30);CpG岛2(CGI-Ⅱ)甲基化阳性率为13.33 %(4/30).hMLH1蛋白表达阳性率为50 %(15/30).经χ2检验,CGI-Ⅰ甲基化与hMLH1蛋白表达缺失存在显著性差异(P＜0.05)、CGI-Ⅱ甲基化与hMLH1蛋白表达缺失无差异(P＞0.05).结论 CGI-Ⅰ甲基化可能导致hMLH1蛋白不表达,其中1～28 CpG位点为导致hMLH1蛋白表达缺失的关键区域.     

5-氮-2′-脱氧胞苷对RKO结肠癌细胞株p16/CDKN2基因去甲基化的转录调节作用

目的 探讨DNA5′CpG岛去甲基化对RKO结肠癌细胞株p16／CDKN2抑癌基因的转录调控作用及对细胞株生长增殖的生物学影响,寻找抗癌治疗的新靶点。方法 用特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2′-脱氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine)作用结肠癌细胞株72h后,甲基特异性PCR(Methylation-specific PCR．MSP)、T-A克隆及DNA测序分析甲基化状态,四唑盐(MTT)比色、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光定量PCR(Real-timePCR)、免疫组织化学染色(IHC)及蛋白印迹(Western blot)检测用药前后RKO细胞株生长倍增时间以及对p16／CDKN2 mRNA及蛋白表达的影响。结果 (1)未经5-Aza-deoxycytidine作用的对照组RKO细胞基因组DNA的胞嘧啶保持不变,而经5-Aza-CdR作用的RKO结肠癌细胞基因组DNA的胞嘧啶均已变为胸腺嘧啶;(2)与对照组相比,3组不同浓度5-Aza-2′-deoxycytidine均能明显抑制肿瘤细胞生长,倍增时间分别增加了1．49、1．64、1．87倍;(3)经5-Aza-2′-deoxycytidine作用后,p16／CDKN2基因mRNA表达分别增加了4．89、16．91、19．97倍,而DNA甲基转移酶mRNA表达显著降低;(4)免疫组化染色和蛋白印迹均显示,经处理后的肿瘤细胞p16／CDKN2蛋白表达呈明显增强。结论 DNA异常甲基化与RKO结肠癌细胞有关;特异性甲基转移酶抑制剂5-Aza-2′-deoxycytidine能较好地逆转RKO细胞DNA异常甲基化,并有效地激活因高甲基化所致p16／CDKN2基因沉默的再转录,诱导该基因的表达,从而抑制肿瘤细胞生长。     

变性高效液相色谱快速诊断儿童型脊肌萎缩症

目的建立变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)快速诊断儿童型脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)的新方法.方法 (1) 用二重聚合酶链反应(PCR)扩增运动神经元成活基因(survival motor neuron gene,SMN)外显子7、8及周围部分内含子序列;(2)纯化PCR产物以除去其中的引物、dNTP及缓冲液中的盐粒子等成分;(3)采用多重引物延伸反应特异性检测能将SMN1基因与SMN2基因区分开的3个特异性位点;(4)将延伸反应的产物用DHPLC在完全变性的条件下分析.结果将建立的新方法与传统的PCR-酶切法进行盲法对比试验,检测了30例标本(包含20例SMA患儿和10例正常人群外周血基因组标本)以验证新方法的特异性和可靠性,其诊断结果与PCR-酶切法结果完全一致.结论多重引物延伸反应结合DHPLC分析技术是一种可用于临床SMA基因诊断、产前诊断及胚胎种植前遗传学诊断的高效、灵敏、可靠、快速、简便的新方法.     

HHIP基因启动子区甲基化在食管癌细胞系中的研究

目的 探索人食管癌细胞系Hedgehog信号通路相关基因的表达状况、HHIP基因启动子区甲基化状态与HHIP表达的关系.方法 采用RT-PCR方法检测5个食管癌细胞系Hedgehog信号通路SHH、PTCH1、SMO、HHIP和Gli的表达情况.用基于甲基化敏感酶和甲基化依赖酶酶切、并结合荧光定量PCR方法分析食管癌细...     

限制性内切酶结合半巢式PCR法检测人肝癌P16抑癌基因启动子区甲基化研究

目的 建立甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法,研究原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态.方法 针对P16基因启动子区富含CpG的序列,设计3条引物,进行半巢式降落PCR扩增,检测原发性肝癌P16基因启动子区甲基化状态;并将P16基因启动子区340 bp片段克隆到pMD18-T载体,E.coli JM109扩增此质粒后经CpG甲基化酶M.Sss Ⅰ处理,再用Hpa Ⅱ酶切验证获得P16基因启动子区甲基化阳性的质粒P16Pm 并进行特异性和灵敏度实验.以此甲基化敏感的限制性内切酶结合半巢式降落PCR方法检测40例人原发性肝癌和3例正常人肝组织DNA样品的P16基因启动子区甲基化状态.结果 所采用的Hpa Ⅱ酶切后半巢式PCR方法的特异性强,灵敏度达100 fg;对40例人原发性肝癌组织DNA样品P16基因的启动子区甲基化状态检测显示甲基化阳性率为30%(12/40),3例正常人肝组织均为阴性(0/3).结论 P16抑癌基因启动子区甲基化可能与肝癌发生发展有关.本实验方法简便、成本低廉,并有高度的特异性与灵敏度,在大规模检查中有实际应用价值.     

hMLH1甲基化在散发性大肠癌中的临床意义

目的:了解散发性大肠癌中hMLH1基因启动子区域5'端CpG岛的过度甲基化现象,探讨其与微卫星不稳定性(MSI)在散发性大肠癌发生中的相关性.方法:取散发性大肠癌患者肿瘤组织及其正常对照组织(阴性切缘组织,距肿瘤10 cm以上)标本41对,提取DNA后,以甲基化特异性PCR方法检测标本中hMLH1启动子的甲基化情况,并与相应的临床病理学资料进行统计学分析;将BAT25、BAT26作为检测位点,以自动荧光DNA序列分析法检测MSI,并与甲基化情况进行相关分析.结果:41例散发性大肠癌标本中,75.6%(31/41)存在hMLH1启动子过度甲基化,非甲基化患者年龄(49.2岁)与甲基化患者年龄(63.6岁)相比差异有显著性(P<0.05);43.9%(18/41)的标本表现为MSI阳性;在MSI阳性标本中,94.4%(17/18)有甲基化现象存在,明显高于MSI阴性标本(60.9%,14/23),两者相比差异有显著性(P<0.05).结论:散发性大肠癌中普遍存在年龄相关的hMLH1基因启动子过度甲基化现象,由此引起的MSI可能是老年人大肠癌发病的相关因素之一.     

胃癌形成过程中端粒酶反转录酶基因表达及启动子甲基化状态分析

目的探索端粒酶反转录酶(hTERT)基因表达情况及启动子区甲基化状态在胃癌形成过程中的变化情况。方法提取正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌3组组织样本的基因组DNA。用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增其hTERT基因,用琼脂糖凝胶电泳检测3组组织样本中hTERT基因表达的阳性率;用亚硫酸氢盐修饰上述各组标本DNA,然后检测修饰后的hTERT序列:启动子区CpG位点,未发生甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U);在启动子区不含CpG位点的位置,进行引物设计,然后利用PCR进行扩增。扩增产物序列与原序列比对,观察启动子区甲基化情况。结果 hTERT基因在胃癌组表达的阳性率最高,在癌前病变组表达的阳性率明显降低,而在正常胃黏膜组中不表达,3组组织样本hTERT表达阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。hTERT启动子区甲基化程度在胃癌组中最高,在胃癌前病变组中明显降低,而在正常胃黏膜中甲基化程度最低,3组组织样本hTERT启动子区甲基化程度比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 hTERT启动子区甲基化程度在正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌中依次升高,故hTERT启动子区甲基化程度的变化可作为胃癌形成过程中肿瘤早期诊断的潜在分子生物学标志。     

基因甲基化与急性淋巴细胞白血病的关系

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病(ALL)发生机制中的作用。 方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应方法检测82例ALL患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况。 结果：31例ALL患者存在p16基因的甲基化,1例p16基因纯合缺失;p16存在甲基化与纯合缺失的患者初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16基因正常表达者。 结论：p16基因甲基化在ALL发生机制中有一定的作用,可作为评估ALL预后的一个指标。