一种快速检测CpG胞嘧啶甲基化的方法

脊椎动物基因5＇端的CpG岛甲基化状态能够调控基因的转录，几乎所有的看家基因和近一半的组织特异性表达基因的表达受CpG岛甲基化调控。在正常生理条件下，大部分CpG岛处于非甲基化状态。DNA修复基因、肿瘤抑制基因都是看家基因，在肿瘤组织中其CpG岛常常处于异常甲基化状态，导致基因转录失活。肿瘤抑制基因的异常甲基化成为继基因结构变异之外的又一种重要基因失活方式。     

用变性高效液相色谱检测CpG岛胞嘧啶甲基化

目的 :建立一种新型的CpG岛胞嘧啶甲基化快速检测方法。方法 :用亚硫酸氢钠处理DNA ,再用链特异性聚合酶链式反应 (PCR)对错配修复基因hMLH1启动子含CpG位点的靶序列进行扩增 ;利用变性高效液相色谱 (DHPLC)在部分变性温度下测定靶序列的保留时间 ,并与亚硫酸氢钠 酶切法测定结果进行比较。结果 :用DHPLC对结肠癌细胞株RKO和胃癌细胞株PACM 82的hMLH1启动子进行测定 ,发现RKO细胞PCR产物的保留时间明显长于PACM82细胞 (6 .7min比 6 .2min)。RKO细胞PCR产物保留时间延长是亚硫酸氢钠处理后的模板中胞嘧啶和岛嘌呤含量较PACM 82高所致。从此结果分析 ,可以判断出RKO的hMLH1启动子已甲基化 ,而PACM82细胞未甲基化。此结论与酶切法结果完全一致。结论 :新方法可以快速检测CpG岛胞嘧啶甲基化。     

CpG岛甲基化表型肺癌的分型标记及临床病理特征

目的 比较新的CpG岛甲基化表型(CIMP)筛选标记基因和经典CIMP筛选标记基因在CIMP肺癌筛选中的作用,并分析CIMP肺癌的临床病理特征.方法 取第二军医大学长海医院呼吸科50例肺癌患者的肺癌组织和癌旁组织,提取DNA,进行甲基化转换后,利用甲基化特异性PCR (MSP)对新的CIMP筛选标记基因(SHISA3、CTSL1、C1ORF103和TMEM200B)和经典的CIMP筛选标记基因(CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3)的启动子CpG岛区域进行扩增,采用琼脂糖凝胶电泳分析其甲基化状态.运用SPSS统计软件对结果进行统计分析.结果 肺癌组织发生明显的甲基化,所研究的8个基因甲基化水平均明显高于癌旁组织(P=0.014).其中RUNX3甲基化与淋巴结转移及功能状态(PS)评分有关(P值分别为0.017、0.018).年龄＞60岁的肺癌患者甲基化率高于≤60岁者(P=0.031).吸烟对CTSL1基因甲基化的影响也很大(P=0.018).结论 CpG岛甲基化表型肺癌具有独特的临床病理特征;新的和经典的甲基化基因组合在CIMP肺癌筛选上都具有较高的灵敏度和特异性.     

甲基化特异性熔点曲线分析检测FMR1基因CpG岛甲基化状态方法的建立

目的建立一种可靠的检测脆性X智力障碍1基因(FMR1)CpG岛甲基化状态的方法。方法用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行脱氨基修饰,以修饰后的DNA为模板,利用荧光定量PCR仪扩增FMR1基因CpG岛序列并进行熔点曲线分析,并对PCR产物进行克隆测序,验证其甲基化状态。结果分析包含10个CpG位点FMR1基因CpG岛105bp片段显示,非甲基化与甲基化引物扩增产物之间熔点温度相差2.5℃;克隆测序显示两者之间未被修饰的胞嘧啶相差7个。结论所建立甲基化特异性熔点曲线分析方法可以有效地检测FMR1基因CpG岛甲基化状态,为临床诊断脆性X综合征提供依据。     

BRCA1基因CpG岛甲基化所致转录抑制作用具有位点特异性

表遗传 ( Epigenetics)是一种可遗传的 ,非DNA序列改变的 ,能引起基因表达水平的异常。 DNA的甲基化是影响表遗传的主要因素 ,与基因表达抑制、基因功能缺失有关。许多抑癌基因如 p1 6、Rb、BRCA1等 ,通过 DNA的甲基化而失活 ,成为某些肿瘤和遗传性疾病发病的重要机制之一。但是 ,并不是所有的胞嘧啶 5′甲基化与基因表达下降有关。研究表明 ,基因转录抑制可能与基因启动子和第一外显子区域特别是 Cp G岛的甲基化有关。基因的 Cp G岛序列长度在 2 0 0 bp以上 ,在此区域内存在许多的Cp G位点。如 BRCA1基因的 Cp G岛即在 -567～ +…     

HCC患者GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化状态研究

目的 检测人原发性肝癌（HCC）中抑癌基因GSTP1的启动子区CpG岛甲基化的状况，并探讨其在肝癌发生中的作用。方法 以已知的GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化阳性的乳腺癌细胞株MCF-7为阳性对照，以11例正常人外周血单核细胞（PBMC）DNA为阴性对照，用甲基化特异性PCR（MSP）的方法对26例肝细胞癌患者的癌、远癌组织中GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化的状态进行检测。结果 在26例原发性肝癌中GSTP1基因启动子区CpG岛甲基化在癌组织为88％（23／26），在远癌组织中为69％（18／26）；而在11例正常人外周血单核细胞均为甲基化阴性。结论 抑癌基因GSTP1基因启动子区CpG岛高甲基化可能是肝癌发生早期的分子事件，在人原发性肝癌的发生发展中具有重要的作用。     

乳腺癌及良性病变中P16蛋白与基因5'CpG岛甲基化的病理意义的探讨

目的：探讨P16蛋白在乳腺良生病变,乳腺导管内癌,浸润性导管癌中的表达,p16基因5＇CpG岛甲基化在原发性乳腺癌组织中与P16蛋白失表达的关系及意义.方法：用限制性酶PCR检测45例乳腺浸润性导管癌及15例乳腺良性病变p16基因中5＇CpG岛甲基化状态,甲基化检测结果与免疫组织化学方法检测的P16蛋白表达结果进行比较.结果：p16蛋白在乳腺癌中强表达,但随组织学分级升高,淋巴结的转移,肿瘤直径的增加,p16蛋白表达率降低.p16基因甲基化与p16蛋白表达负相关,且与组织学分级相关.结论：p16基因甲基化是其失表达的可能机制之一.     

变性高效液相色谱法筛选鼻咽癌相关基因单核苷酸多态性

目的 利用变性高效液相色谱法（DHPLC）结合测序筛选和鉴定鼻咽癌基因的单核苷酸多肽性（SNPs)。方法 PCR扩增30例鼻咽癌患者和28例正常对照者6p21.3区域基因PPP1R11，PP1R10，FLOT1，KIAA0170的4个外显子与1个内含子片断，采用DHPLC技术对扩增片断进行基因变异检测，将不同的类型PCR片断进行全序列测定并与参考序列对照分析。结果 在5个片断中初步鉴定出4个未见报道的新SNP位点，验证了4个已知的SNPs位点和基因型。结论 DHPLC预测结合全序列测序是一种高效，经济，简便，可靠的SNP筛选方法。     

人原发性肝癌中p16基因表达及CpG岛甲基化状态的研究

目的：进一步探讨人原发性肝癌中p16基因mRNA转录水平变化与其基因启动子区CpG岛甲基化的关系，及其在肝癌发生中的意义。方法：采用狭缝印迹杂交检测20例人原发性肝癌及相应的癌旁、远癌组织及2例正常人肝组织中p16基因mRNA表达水平，以甲基化特异性PCR分析各组织中p16基因启动子区CpG岛的甲基化状况，并进行统计分析。结果：20例人原发性肝癌中14例（70％）p16 mRNA水平比远癌组织显著降低；13例（65％）显示p16基因启动子区CpG岛甲基化，其中84．6％（11例）伴p16 mRNA转录水平降低。结论：人原发性肝癌中存在高频率的p16基因表达失活，其主要机制可能是启动子区CpG岛甲基化抑制了基因的转录，在人原发性肝癌的发生发展中有重要作用。其临床诊断和治疗意义有待进一步深入研究。     

变性高效液相色谱分析检测人类糖皮质激素受体基因变异

目的：以变性高效液相色谱分析(DHPLC)检测糖皮质激素受体基因(NR3C1)在中国人群中的变异情况：方法：提取64例中国人基因组DNA，参照文献所报道的引物序列，PCR方法扩增糖皮质激素受体基因编码区(2～9α外显子)及其邻近的部分内含子序列，琼脂糖凝胶电泳鉴定产物后，以DHPLC检测PCR产物，对洗脱曲线异常者进行DNA测序。结果：经DHPLC分析和DNA测序证实，研究人群的NR3C1基因中存在8处变异，5处为新发现；其中有2组变异呈紧密连锁的单倍型，均为首次报道，它们在人群中的基因型频率达3．1％与14.1％；另一处变异出现频率相对较低。结论：成功地建立了以DHPLC检测NR3C1基因变异的方法及技术参数，证实在中国人群中NR3C1基因存在变异，其中2种频率较高的单倍型为新发现。     

高效液相色谱法检测结核分枝杆菌链霉素耐药基因突变

目的 采用变性高效液相色谱(DHPLC)法和测序法来分析结核分枝杆菌链霉素耐药基因rpsL和rrs基因突变,从而检测是否对链霉素耐药.方法 215株结核分枝杆菌临床分离株(经常规方法证实,115株为链霉素耐药,100株为敏感),测定链霉素最小抑菌浓度(MIC),同时采用DHPLC和测序法检测rpsL和rrs基因突变.结果 85.2%(98/115)的链霉素耐药株携有rpsL和(或)rrs基因突变,其中rpsL基因突变占大多数(76.5%,88/115).对98株带有基因突变的菌株的分析表明,rpsL,rrs基因的突变类型与MIC之间未见密切关系.100株敏感株未检出基因突变.DHPLC法与测序法结果完全一致.结论 本工作建立的DHPLC法可以认为是结核分枝杆菌链霉素耐药分析的一种有效的工具.     

利用高效液相色谱法测定天麻素的含量研究

目的:应用高效液相色谱技术测定化工合成天麻素的含量。方法:以YWG-C18为固定相,乙腈-磷酸二氢钠为流动相,UV检测波长为220nm,天麻素进样量为4～12μL。结果:与峰面积呈良好的线性关系,回归方程为Y=0.2852X-35.730,r=0.9998,平均回收率为101.4%,相对标准偏差为1.27%(n=9)。结论:该方法简便,重复性好,结果准确可靠,样品测定周期短,可作为天麻素含量的测定方法。     

高效液相色谱法测定人血浆中汉防己甲素

本文建立了人血浆中汉防己甲素的高效液相色谱测定法。采用C18柱 ,以含 0 0 3%三乙胺的甲醇∶水 (80∶2 0 )为流动相 ,检测波长 2 82nm ,安定为内标 ,样品用乙醚提取。汉防己甲素线性范围 0 2 89～ 4.6 18μg·ml-1,平均加样回收率 95 8% ,日内及日间变异少于 5 %。方法简便、快速、可靠 ,可用于汉防己甲素的生物样本分析。     

高效液相色谱法测定兔血浆间硝苯地平浓度

目的：测定兔血浆中间硝苯地平的浓度。方法：采用高效液相色谱内标定量法，粒径为３μｍ的Ｃ１８色谱柱，流动相为９５％甲醇：水（４５：２０，ｖ／ｖ），紫外检测波长为５３５０ｎｍ，使兔血浆中的间硝苯地平得到良好分离。结果：间硝苯地平的相对保留时间为７ｍｉｎ，最低检测浓度为１０ｎｇ／ｍｌ，血浆药物浓度在０￣５７６０ｎｇ／ｍｌ范围内具良好线性关系，日内变异系数为２．１％￣７．０％，日间变异系数为３．７％￣９．     

多重连接依赖式探针扩增和变性高效液相色谱法检测Duchenne型肌营养不良症患者DMD基因的缺失/重复突变

目的比较多重连接依赖式探针扩增法(MLPA)和变性高效液相色谱法(DHPLC)检测Duchenne型肌营养不良症(DMD)患者DMD基因缺失/重复突变的效果。方法选择2004年10月~2005年10月在我院确诊的22位无关DMD男性患者,采用MLPA法对经DHPLC技术检测过的患者的DMD基因的缺失/重复突变进行突变筛查,同时对先证者的23位女性亲属进行基因的缺失/重复突变检测。结果DHPLC技术和MLPA法均检测出11位先证者具有DMD基因缺失突变,3位先证者具有DMD重复突变;MLPA法除能更精确地检测出上述突变外,还检测出DHPLC法未检测出的两位患者的DMD基因存在缺失突变。16个家系中18位可能的女性携带者中,12位经检测为缺失/重复突变携带者。两种方法均未检测到6位先证者及其女性亲属DMD基因具有缺失/重复突变。结论与DHPLC法和传统的多重PCR方法相比,MLPA法检测DMD基因的缺失/重复突变位置更为准确。MLPA法可用于检测先证者及家系中女性携带者DMD基因的缺失/重复突变。     

正常人血和尿中麦芽糖的廓清

目的建立麦芽糖分析方法,研究正常志愿者输入不同浓度麦芽糖溶液的廓清变化。方法用高效液相色谱仪分析血浆和尿样中的麦芽糖;12名男性健康志愿者,分别接受以0.2、0.3、0.5g.kg-1.h-1的给药速率静脉滴注麦芽糖注射液4h,在滴注前和滴注后不同时间点采集血样、不同时间段收集尿液测定麦芽糖和葡萄糖。结果血样分析麦芽糖的准确性和回收率的变异系数(RSD)分别在3.68%～4.58%和0.44%～4.83%之间;尿样分析准确性和回收率的RSD分别在2.91%～7.62%和0.95%～8.27%之间。健康志愿者以0.2、0.3、0.5g.kg-1.h-1的给药速率静脉滴注麦芽糖注射液4h后,血中麦芽糖的浓度随给药剂量的增加而成比例增加,具有良好的剂量依赖性(r>0.99)。3个高、中、低不同浓度的麦芽糖在输入12h后血中麦芽糖的浓度均回到起始点,麦芽糖在血中消除较快。在输入麦芽糖后2h,尿中麦芽糖和葡萄糖排出增加,2～4h达高峰,6h后减少,24h完全回到零点。结论在0.2～0.5g.kg-1.h-1的给药速率下,输注麦芽糖基本不会导致体内血糖浓度的明显升高,在上述浓度下具有很好的廓清能力。建议除需要立即补充大量能量时,可考虑采用较快的输注速率,常规补充能量时宜采用不超过0.3g.kg-1.h-1的输注速率。     

一种快速检测尿中微量白蛋白的高效液相色谱法

目的:建立一种快速检测尿中微量白蛋白的高效液相色谱检测方法。方法:采用新的流动相建立分子筛-高效液相色谱法测定人血清白蛋白标准液和尿液白蛋白, 对该法进行方法学性能研究并分析56 例糖尿病患者的尿液标本。结果:色谱柱Agilent Zorbax GF-250 以0.1% 甲酸水溶液与乙腈(85:15) 为流动相, 流速1 mL/min, 检测波长205nm 时, 人血清白蛋白标准液和尿液白蛋白均在1.7 min 出峰。在5~2000 mg/L 范围内线性关系良好(r²=0.9969);检测低限为2 mg/L;批内和批间变异系数分别为3.98% 和4.05% (20 mg/L)、3.55% 和3.60%(200 mg/L) 及4.65% 和4.74% (2000mg/L);回收率分别为95.3%, 98.1% 和97.2%。56 例糖尿病患者标本, 高效液相色谱法能检出30 例微量白蛋白尿, 免疫散射比浊法检出15 例, 高效液相色谱法的检出率明显高于免疫散射比浊法(P<0.05)。结论:采用甲酸水溶液与乙腈为流动相的分子筛- 高效液相色谱法能较其他方法检出更多的微量白蛋白, 且快速, 灵敏度高, 适合临床常规测定。     

应用变性高效液相色谱技术筛查一个正常血钾性周期性麻痹家系的SCN4A基因突变

目的 应用变性高效液相色谱(DHPLC)技术筛查一发生Met1592Val替换的正常血钾性周期性麻痹(normoKPP)家系的SCN4A基因,证实该突变为疾病相关突变,并总结其在此家系的临床表型特点。方法 总结一normoKPP家系14例患者的临床特点,应用DHPLC技术筛查SCN4A基因全部24个外显子,并对发现异常洗脱峰者进行测序。结果 该家系具有典型的normoKPP临床特征,无肌强直表现及早显、性别偏移现象,病程呈良性过程,发病早晚与症状严重程度及预后无相关。DHPLC筛查发现在外显子1及24存在杂合二倍体,测序及连锁分析证实位于外显子1的突变为良性多态性,外显子24的Met1592Val替换为疾病相关突变。结论 国人存在Met1592Val突变,此突变可导致normoKPP。normoKPP与高钾性周期性麻痹临床表现相似,两者可存在共同突变。     

高效液相色谱法测定人血浆罗哌卡因的浓度

目的 建立测定人血浆罗哌卡因浓度的高效液相色谱方法。方法 LC-6A高效液相色谱仪，色谱柱为Hy—persilC18（150mm×4．6mm，5μm）。以布比卡因为内标，流动相采用乙腈：水=17：83（V／V），流速2．0ml／min，在紫外检测波长210nm处进行检测。结果 本方法标准曲线线性方程为Y=1．1236X＋0．0245（y=0．9997，线性浓度范围为0．025～2．5mg／L）；最低检测限为0．0125mg／L；平均方法回收率为99．63％；日间、日内精密度RSD均〈9％。结论 本方法简便、灵敏、快捷、准确，可用于临床上罗哌卡因血药浓度的监测和药代动力学研究。