激光打孔技术用于冷冻精子复苏后体外受精的研究

目的 比较精子冷冻前后体外受精率的变化,以及卵子经过激光打孔后,与新鲜精子及冷冻复苏精子体外受精,比较受精率的变化.方法 冷冻2个近交系小鼠和5个品系的基因工程小鼠的精子,比较新鲜精子和冷冻复苏精子与C57BL/6J小鼠卵子做体外受精的结果;然后对C57BL/6J卵子做激光打孔,再与新鲜及冷冻复苏精子体外受精结果进行比较.结果 (1)新鲜C57BL/6J精子受精率为50.4％,C57BL/6N的受精率为48.6％,远高于冷冻精子复苏后的受精率(17.7％和15.4％);卵子打孔后,再与C57BL/6J及C57BL/6N的新鲜精子或冷冻复苏精子受精,受精率分别为64.6％,59.7％和60.4％,48.3％,冷冻精子复苏后的体外受精率提高显著;(2)5个基因工程小鼠新鲜精子和冷冻精子复苏后与C57BL/6J卵子的受精率分别为:91.5％ vs 28.6％,77.4％vs 52.3％,40.7％ vs 12.7％,56.5％ vs 14.6％,65％vs 6.5％;这5个品系的小鼠新鲜精子和冷冻精子复苏后与C57BL/6J打孔卵子的受精率分别为75％ vs 50.8％,74.3％ vs 35.6％,75.7％ vs32.7％,79.5％ vs 48.9％,59.5％ vs 46.3％,冷冻精子复苏后的受精率较之不打孔卵子,提高显著.结论 激光打孔技术用于冷冻复苏精子的辅助体外受精,可以显著提高冷冻精子复苏后的受精率,使得精子保种更加经济有效.     

利用超数排卵技术进行优化C57BL/6J小鼠生物净化体系的研究

目的以近交系C57BL/6J小鼠为实验对象,通过注射不同剂量的孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促进腺激素(hCG)对小鼠进行超数排卵、体外授精和胚胎移植,确定最佳超排剂量,从而完善以C57BL/6J小鼠为背景的转基因小鼠的生物净化体系。方法将5周龄的C57BL/6J雌鼠进行5 IU、10 IU、7.5 IU、15 IU四个剂量组的超数排卵,通过超数排卵与剖宫取胎、胚胎移植两种净化方法相结合,确定C57BL/6J小鼠的净化方法所需的最佳剂量。结果剖宫取胎方法中,注射5 IU剂量组的C57BL/6J小鼠超排后合笼见栓率最高,为(89.00±19.05)%,产仔数和见栓率与其它三组均差异不显著;胚胎移植方法中,10 IU剂量组平均卵母细胞数为30.33±0.89枚,平均体内2-细胞胚胎数为23.78±0.19枚,均显著高于其它三组。结论剖宫取胎法生物净化时,5 IU剂量组可以提高C57BL/6J小鼠的交配成功率;胚胎移植法生物净化时,10 IU剂量组可以获得最多的体内和体外2-细胞胚胎,为C57BL/6J小鼠最佳超排剂量。     

基于体外鼠胚实验评估辅助生殖实验室质量

目的 通过监测体外鼠胚胎培养实验中卵裂率和囊胚率,评估本院新建的生殖胚胎实验室是否符合人类胚胎体外培养要求。方法 采用SPF级昆明系小鼠行体内和体外受精实验,雌鼠通过腹腔注射PMSG 10 U/只,48 h后腹腔注射hCG 10 U/只进行促排卵,促排卵后,体外受精组经手术获得精子和卵子行体外受精培养;体内受精组在雌鼠促排卵后,将雌鼠和雄鼠合笼饲养过夜,第二天清晨处死可见阴栓的雌鼠,手术获取受精原核胚进行培养,观察两组胚胎培养过程中的发育情况。结果 体外受精实验进行20个周期,共获卵946枚,受精率、囊胚率分别为（79.02±4.05）%、（80.12±5.27）%。体内受精实验进行14个周期,共获卵618枚,其受精率、囊胚率分别为（80.65±4.22）%、（81.35±3.06）%,两组间受精率和囊胚率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 通过监测体外鼠胚培养实验中卵裂率和囊胚率评估我院生殖胚胎实验室环境,结果表明符合各项指标质控标准。     

小鼠2细胞期胚胎移植方法的探讨

目的以近交系C57BL/6J小鼠作为供体胚小鼠，封闭群ICR小鼠及昆明鼠作为假孕体，对2细胞期的胚胎移植方法和假孕鼠品系进行对比探讨。方法经超数排卵的C57BL/6J雌鼠于正常雄鼠交配，取受精卵，培养到2细胞期，进行输卵管伞移植和输卵管壁移植，妊娠产仔。结果从KM为假孕鼠，对2细胞期胚胎进行的输卵管壁移植的妊娠数量最多18只，90%的妊娠率，产仔数最多188只，产仔率达34.8%。结论输卵管壁移植的技术简单易行具有较高的妊娠率及产仔率。     

近交系小鼠超数排卵的研究

近交系小鼠超数排卵(简称超排)的研究可为小鼠胚胎库的建立提供大量胚胎。以孕马血清促性腺激素(PMSG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)为主,按不同品系小鼠的特点,加前列腺素(PGF_(2α))1μg/只以上。超排BALB/c系小鼠,平均每只雌鼠取可用胚胎22枚,C 57 BL/6 A系小鼠为23枚,对照组分别取得7枚和8枚,实验组与对照组差异显著(P<0.05)。超排处理后的雌鼠交配受孕率较高。实验结果提示改进的超排方法可提高国产激素制品的超排效果。     

两种大鼠受孕方法及两种判断受孕方法比较

目的:探讨提高实验大鼠受孕率的方法及准确判断大鼠受孕的检测方法.方法:24只SD雌鼠随机分为性周期筛选合笼组(筛选组)和延长时间合笼组(延长时间组),筛选组雌鼠根据阴道涂片于发情前期与雄鼠合笼2d,延长时间组雌鼠直接与雄鼠合笼10 d,采用阴道精子检查法和阴道精子合并角化上皮检查法判断合笼后雌鼠是否受孕,以分娩作为受孕成功的标准,观察两组受孕率,并比较两种判断受孕的方法.结果:筛选组受孕率(91.67％)高于延长时间合笼组(50.00％),差异具有统计学意义(P＜0.05);延长时间组第1～5天受孕率(41.67％)高于第6 ～ 10天(14.28％),差异不具有统计学意义(P＞0.05);阴道精子检查法和阴道精子合并角化上皮检查法的假阴性率分别为0和11.76％,假阳性率分别为14.29％和0.结论:性周期筛选合笼法对雌鼠受孕率高于延长时间合笼法,阴道涂片法判断雌鼠受孕需结合雌鼠性周期推算.     

小鼠超数排卵的比较试验

为了确定最适于超排的小鼠品系,对KM、NIH和C57BL/6J小鼠超排的激素剂量和注射间隔时间进行比较。KM、NIH和C57BL/6J雌鼠各40只,分别随机分为4组,用5IU或10IU的PMSG和HCG,间隔48h或72h注射,比较排出卵母细胞的数量。各品系5IUPMSG 5IUHCG剂量、间隔48h注射组超排效果最好,与间隔72h注射组比较有显著差异;封闭群NIH和KM超排效果较近交系C57BL/6J好,有显著差异。结果提示:各品系小鼠超排的最佳激素剂量为5IUPMSG 5IUHCG,最合适的注射间隔时间为48h,封闭群小鼠较近交系小鼠超排效果好。     

FSCB基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响

目的 利用fscb基因敲除小鼠,探讨FSCB蛋白在小鼠精子运动和授精功能中的作用.方法 应用免疫荧光观察fscb基因敲除雄鼠睾丸组织及精子中FSCB蛋白表达情况;应用计算机辅助精液分析(computer assisted sperm analysis,CASA)系统分析fscb基因敲除小鼠精子在体外的运动特征、活率和运动参数改变情况;在体外获能培养条件下检测精子的体外受精能力;将fscb基因敲除纯合子(KO)、杂合子(HET)、野生型(WT)雄鼠分别与野生型C57BL/6J成年雌鼠交配,观察雌鼠怀孕率、怀孕胚胎数量、自然产仔数及子代成年雄鼠生殖腺形态学是否存在差异.结果 免疫荧光显示纯合子雄鼠睾丸组织及精子中均无FSCB蛋白表达,杂合子雄鼠睾丸组织及精子中FSCB蛋白表达与野生型相比明显减低.CASA显示各组雄鼠精子数、活率、各项运动参数差异均无统计学意义(P＞0.05);野生型、杂合子和纯合子雄鼠精子与透明带完整卵细胞及与无透明带卵细胞结合的精子平均数、卵细胞的受精率差异均无统计学意义(P＞0.05);各组雄鼠对应雌鼠的受孕率差异无统计学意义(P＞0.05);野生型、杂合子和纯合子对应雌鼠受孕后每只雌鼠胚胎数分别为(7.00±1.41)、(7.33 ±1.53)、(7.20±1.48)只,每窝自然产仔数分别为(6.00±2.00)、(6.75±1.71)、(7.80±1.30)只,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);各组子代成年雄鼠生殖腺发育差异无统计学意义(P＞0.05).结论 敲除fscb基因对雄性小鼠精子的运动功能及体内外受精能力均无明显影响,提示该基因所编码的FSCB蛋白的功能对于精子的运动和授精能力的维持可能是非必需的或可被替代的.     

小鼠生物净化中的动情周期判定及超数排卵

目的 准确判定小鼠动情周期的变化,并在动情周期的不同阶段诱导超数排卵,探索最佳的超排时间,以提高生物净化的成功率.方法 C57BL/6J小鼠每日08：00至13：00,取阴道脱落细胞进行涂片,观察脱落细胞中白细胞、有核细胞和角质化细胞的比例及变化的规律,确定小鼠的动情周期.据判定的动情周期的各阶段,腹腔注射外源激素分别诱导超数排卵后,于输卵管中取卵母细胞计数,并统计分析.结果 根据阴道涂片确定小鼠动情前期（包括过渡期）、动情期（Ⅰ、Ⅱ期）、动情后期和间情期.4～6周龄C57BL/6J小鼠诱导超数排卵的最佳时期是动情前期,平均可获得23.20枚卵母细胞,显著高于其他实验组（P＜0.001）.结论 据阴道涂片观察,C57BL/6J小鼠单个动情周期持续4～10d,动情周期内不同时间段超排效果也不同.     

异基因骨髓间充质干细胞逆向嵌合体诱导小鼠皮肤移植耐受研究

目的 探讨骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导移植免疫耐受的可行性,建立小鼠异种逆向嵌合皮肤移植模型.方法 以GFP-C57BL/10雄鼠为BMSCs供者,选择免疫缺陷型BALB/C-nu/nu雌鼠为BMSCs受者,移植BMSCs,建立骨髓嵌合模型;通过RT-PCR检测Y染色体性别决定区基因(SRY)、免疫组化检测GFP蛋白表达量,确定嵌合产生的最佳时间.实验共分3组:将接受BMSCs移植一定时间后的BALB/C-nu/nu雌鼠的皮肤移植给C57BL/10雄鼠(实验组),将未接受BMSCs移植的BALB/C-nu/nu雌鼠的皮肤移植给C57BL/10雄鼠(排斥组),C57BL/10小鼠间进行同种异体皮肤移植(对照组).观察移植皮肤存活情况,检测存活皮肤的血管形成情况,以此探讨逆向嵌合皮肤移植的可行性.结果 成功建立骨髓嵌合模型,用1×106 BMSCs移植后4周,SRY基因和GFP蛋白的表达量最高,分别为1.22±0.10、458.0±3.4,与移植后1周、2周和6周比较差异均有统计学意义(P＜0.05),说明嵌合产生的最佳时间为移植后4周.实验组小鼠供者来源皮肤移植物存活＞14 d,排斥组平均为5d.结论 BMSCs移植后可形成嵌合体,并可逆向嵌合移植诱导异种小鼠皮肤移植耐受.     

小鼠卵母细胞玻璃化冷冻的研究

目的　对小鼠卵母细胞玻璃化的方法和冷冻液进行研究。方法　用两种玻璃化冷冻液EFS4 0 (高钠 )、DEFS4 0 (低钠 )对ICR、C57BL 6J小鼠卵母细胞进行冷冻 ,0 5mol L蔗糖液解冻 ,体外授精前对部分解冻后的C57BL 6J小鼠卵母细胞进行透明带切割。结果　DEFS4 0冷冻液冷冻效果明显高于EFS4 0冷冻液 ,ICR小鼠卵母细胞解冻后成活率达 75 2 %、体外授精率 (2 4 6 % )与对照组相比差异无显著性 ,C57BL 6J小鼠卵母细胞解冻后成活率为 87 1%、卵母细胞切割后体外受精率 (36 0 % )与对照组相比差异也无显著性。结论　冷冻液中钠离子浓度影响小鼠卵母细胞冷冻效果 ,用DEFS4 0 (低钠 )冷冻液进行玻璃化冷冻可以取得理想的冷冻效果。     

克拉霉素对C57BL/6J小鼠动脉粥样硬化及炎症反应的影响

目的观察肺炎衣原体（Chlamydia pneumoniae,Cpn）与动脉粥样硬化的关系以及克拉霉素的抗炎作用。方法 60只健康雄性C57BL/6J小鼠根据喂养的饲料及是否感染Cpn分为4组：对照组（n=6）、高脂组（n=6）、感染组（n=24）和感染＋高脂组（n=24）。Cpn感染组于试验开始每隔2周1次,共6次,分别经鼻内接种0.05ml Cpn（6.6×106IFU/ml）。对照组及高脂组以同样方法接种链球菌蛋白G（SPG）缓冲液。感染Cpn后（感染组、感染＋高脂组）依据有或无克拉霉素的治疗及治疗的时间进一步分为未治疗、早期及延迟治疗亚组。全自动生化分析仪检测小鼠的血脂,免疫荧光法检测Cpn IgG抗体。12周后处死小鼠,放免法测定IL-6、IL-8的水平,并取升主动脉大血管检测主动脉动脉粥样硬化的情况。结果高脂组的总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）明显高于对照组（P均〈0.01）。各组与对照组比较IL-6、IL-8的水平明显升高（P〈0.05或P〈0.01）;未治疗组高于早期及延迟治疗组（P〈0.01）,且延迟治疗组高于早期治疗组（P〈0.01）。与延迟治疗组比较,克拉霉素早期治疗组可以延缓动脉粥样硬化的发生。结论 Cpn协同高脂血症与动脉粥样硬化的形成密切相关。克拉霉素治疗能够减轻Cpn感染所致动脉粥样硬化的炎症反应。     

十溴联苯醚对小鼠受精卵发育的影响及其量效关系

 【目的】探讨十溴联苯醚对小鼠体外受精的毒性作用,并探究其剂量效应关系。【方法】将体外受精培养液按照BDE-209的终浓度不同分为四组：对照组A 0 µg/ml;B组：10 µg/ml;C组：20 µg/ml;D组：40 µg/ml。取性成熟昆明雌鼠20只及雄鼠8只,对雌鼠行促排卵及促卵成熟,收集成熟卵母细胞随机平均放入以上培养液中,对雄性小鼠附睾尾取精,加入培养液中,使其受精。放入37℃,5%CO2培养箱中培养。统计2-细胞成形率、4细胞成形率、8细胞成型率、桑葚胚成形率及囊胚成形率。【结果】在2-细胞期,B组受精率为63.3%与对照组的69.2%差异无统计学意义（P>0.05）,但C组（28.1%）和D组（24.1%）明显低于对照组（P<0.01）。2-细胞、4-细胞、8-细胞、桑葚胚及囊胚形成率,C组均明显低于B组（P <0.01）;D组除2-细胞期外,均显著低于C组（P <0.01）。【结论】BDE-209可导致小鼠体外受精率降低,影响受精卵的早期发育,并且呈现明显的剂量效应关系。     

祛斑汤对小鼠皮肤黑素合成影响的研究

目的:观察祛斑汤对雌性C57BL/6J小鼠皮肤黑素合成的影响,为探索该方剂治疗黄褐斑机制提供实验依据。方法:将雌性C57BL/6J小鼠随机分成空白对照组、祛斑汤低(10 g/kg)、中(20 g/kg)、高剂量(40 g/kg)组、维生素C组。各组灌胃给药30 d后皮肤取材。采用免疫组化法观察小鼠皮肤黑素分布。结果:祛斑汤高、中剂量组黑素颗粒阳性反应的黑素细胞平均光密度低于空白对照组,差别有统计学意义(P0.01)。结论:祛斑汤能抑制雌性C57BL/6J小鼠皮肤中黑素合成、降低黑素分布。     

原花青素对C57BL／6J小鼠动脉舒张功能保护作用的研究

目的探讨原花青素（OPC）对C57BL／6J小鼠血管内皮舒张功能的影响及物质基础。方法①将内皮功能紊乱的C57BL／6J小鼠分为对照组、0．1％w／w原花青素组、抗生素组、抗生素＋0．1％w／w原花青素组,干预4周后观察小鼠胸主动脉舒张功能;②采用高效液相色谱法（HPLC）测定OPC（100mg／kg）灌胃后小鼠60min血浆中OPC以及其代谢物原儿茶酸（PCA）含量;③将内皮功能紊乱的C57BL／6J小鼠分为抗生素组、抗生素＋0．1％w／wOPC、抗生素＋0．1％w／wOPC＋0．003％w／wPCA,干预4周后观察小鼠胸主动脉舒张功能。结果①OPC干预可提高小鼠动脉舒张功能．但该效应被抗生素阻断;②OPC灌胃小鼠60min后,HPLC法测得血浆PCA浓度为（10．6±1．8）μmol／L,但OPC未检出;③抗生素阻断OPC介导的小鼠动脉舒张功能可被其代谢物PCA部分恢复。结论原花青素可以改善血管内皮舒张功能,其物质基础可能与其代谢物PCA有关。     

Bcl-2高表达小鼠模型的建立

目的 建立Bcl-2高表达的转基因小鼠品系,为在活体动物上研究bcl-2蛋白的功能提供动物模型.方法 构建含人Bcl-2基因的质粒;通过显微注射将该质粒转入C57BL/6J×CBA的杂交小鼠的受精卵,并植入假孕母鼠的子宫,PCR检测后携带人Bcl-2基因的小鼠即为“Founder”鼠;将“Founder”鼠与C57BL/6J×CBA杂交小鼠不断回交,经PCR和Western bilotting筛选后即可获得阳性小鼠.结果 共获得5只“Founder”鼠,其中#6、#14成功建系,连续回交繁殖7代后,PCR和Western筛选后获得bcl-2高表达阳性小鼠42只.结论 成功将人bcl-2基因转入小鼠基因组内,并稳定传代,建立Bcl-2高表达小鼠,为进一步研究Bcl-2蛋白提供了很好的动物模型.     

中链甘油三酯对C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织的影响

目的观察中链甘油三酯（MCT）对C57BL/6J小鼠棕色脂肪组织的影响。方法选择4-5周龄C57BL/6J雄性小鼠30只,随机分为中链甘油三酯高脂组（MCT）,大豆油高脂组（LCT）及普通饲料对照组,每组10只,喂饲15周。观察研究前后各组间小鼠体质量、饲料消耗量及食物功效比、棕色脂肪组织重量差异以及解偶联蛋白-1（UCP1）表达水平的变化。结果研究结束时,MCT高脂组小鼠的体质量、体脂肪量显著低于LCT组（P〈0.05）,饲料消耗量MCT组和LCT组之间无统计学差异（P〉0.05）,MCT组棕色脂肪组织重量及UCP1蛋白表达量显著高于LCT组。结论 MCT可促进棕色脂肪组织增殖,提高棕色脂肪组织UCP1的表达,增强棕色脂肪组织的产热功能,从而抑制高脂饲料诱发的C57BL/6J小鼠体质量增加和体脂肪积累。