SIVmac239病毒感染CEMx174细胞过程分析

目的运用不同的技术方法,观察SIVmac239感染CEMx174细胞的全过程。方法 SIVmac239病毒感染CEMx174细胞后,分别在不同的时间点收集培养上清和细胞,应用实时荧光定量PCR方法检测培养上清中的病毒载量;IFA检测并用激光扫描共聚焦显微镜观察病毒定位及复制情况;胞内流式、Western blot检测细胞内病毒蛋白p27的表达量。结果 SIVmac239吸附并感染CEMx174后,第0.5 h时,细胞胞膜上检测到病毒颗粒;第12h时,培养上清中的病毒RNA水平出现下降;此后至第96 h,病毒持续复制,细胞胞浆内病毒蛋白p27表达量逐渐增加,培养上清中病毒RNA水平持续升高。结论病毒感染细胞时,首先吸附在细胞膜上,然后进入细胞持续复制和表达。     

游离SIVmac239病毒与T细胞介导两种方式感染内皮细胞的效果比较

目的比较游离病毒感染与T细胞介导的感染方式对SIV感染内皮细胞的影响,探索SIVmac239感染内皮细胞的主要途径,从而为SIV入侵血脑屏障的机制提供理论基础。方法采用游离SIV病毒直接感染内皮细胞和SIV感染的CEMx174细胞与内皮细胞共培养的两种方式,通过巢式PCR、间接免疫荧光法、Western blotting以及ELISA检测内皮细胞的感染程度。结果两种感染方式都能在内皮细胞内检测到前病毒DNA,感染细胞与内皮细胞共培养时,内皮细胞内前病毒DNA含量,SIV P27蛋白表达量和细胞培养上清液中P27含量远高于游离病毒直接感染的方式。结论细胞介导的感染方式相较于游离病毒直接感染方式对内皮细胞的感染能力更强,可能是SIV病毒入侵血脑屏障的主要途径。     

SIV感染猴外周血CD14~+单核细胞CD169分子表达的变化

目的研究正常恒河猴感染SIVmac239前后外周血单核细胞以及各亚群单核细胞表面CD169分子表达量的变化及可能的原因。方法正常恒河猴在静脉攻毒后,流式细胞术检测感染前后外周血单核细胞比例及其表面分子CD169表达量的变化;SIVmac239直接感染和不同细胞因子刺激流式分选出的正常恒河猴外周血CD14+单核细胞,流式细胞术检测细胞表面CD169和细胞因子IFN-α表达量的变化。结果 SIVmac239感染正常恒河猴后,CD14+单核细胞的比例下降,CD14+单核细胞表面分子CD169表达量升高;外周血中不同单核细胞亚群CD169的表达量均显著增加,CD14+CD16++单核细胞中CD169表达量的升高更为明显。正常恒河猴外周血CD14+单核细胞经细胞因子M-CSF、IL-4和IL-13刺激后,细胞表面不表达CD169;经细胞因子IFN-α刺激后,高表达CD169;SIVmac239病毒直接感染CD14+单核细胞,细胞表面CD169与胞内细胞因子IFN-α的表达均无变化。结论 SIVmac239病毒感染恒河猴后,可引起外周血单核细胞CD169分子表达量的升高,其表达与病毒直接感染单核细胞无关,与体内其它细胞分泌的细胞因子IFN-α相关。     

SIVmac239病毒经不同途径感染恒河猴急性期CD4+T细胞数量与其细胞表面CD95表达量的变化关系

目的研究SIVmac239病毒分别通过直肠(rectal infection:IR)及静脉(intravenous infection:IV)感染恒河猴,在感染急性期外周血CD4+T细胞数量与其细胞表面的死亡受体(CD95)表达量之间的变化关系。方法将SIVmac239经直肠及静脉途径各感染14只恒河猴。监测病毒载量、CD4+T淋巴细胞数量及CD4+/CD8+比值的变化,从而明确感染。同时,在感染急性期内9个时间点采集静脉血,并利用流式细胞术分析CD4+T细胞表面CD95的表达量。结果静脉组恒河猴CD95表达量于第2天开始升高,第7天达到最高,同时CD4+T淋巴细胞数降到最低。直肠组恒河猴也于感染后第2天开始升高,但第10天才达到最高值,CD4+T淋巴细胞数于第17天降到最低。同静脉组相比,直肠组CD95表达量增高及CD4+T细胞数降低均较晚出现,且其CD4+T细胞数量降至最低晚于CD95表达量达到峰值一周后出现。结论 SIVmac239经直肠及静脉感染恒河猴后,伴随CD4+T细胞表面CD95表达的升高,CD4+T细胞数量逐渐下降。但不同感染途径对CD4+T细胞表面CD95的表达量与CD4+T淋巴细胞数的变化不尽相同,这可能由于不同感染途径造成CD95在感染急性期CD4+T细胞数量降低中发挥的作用不同。     

SIV感染CEM×174细胞后CD28家族免疫调控分子mRNA的动态变化

目的 观察猴免疫缺陷病毒(SIV)感染CEM×174细胞后CD28家族免疫调控分子CD28、BTLA、ICOS、PD-1 mRNA表达水平的动态变化. 方法 以SIVmac251感染接种CEM×174细胞,收集感染后12,24,48,72,96,120,144,168,216 h共8个时间点及正常未感染细胞,提取细胞RNA,以染料法逆转录荧光定量PCR法检测SIV 、CD28 、ICOS 、PD-1 、BTLA mRNA的表达. 结果 SIV mRNA在48 h时表达即显著升高(P<0.05),随着SIV mRNA量的逐渐上升,ICOS 在48 h时开始显著升高(P<0.05),而CD28 、PD-1 mRNA在120 h时才出现表达显著增加(P<0.05);BTLA mRNA则呈现下降趋势,并在168 h开始出现显著下调(P<0.05). 结论 除BTLA以外,所检测SIV感染后细胞中促进免疫激活和抑制免疫的免疫调节因子(ICOS、PD-1、CD28)表达均显著升高,提示AIDS中存在免疫紊乱.     

HBx介导SAMHD1降解并通过Akt/p27通路促进肝癌细胞增殖的机制研究

目的 研究HBx蛋白调控SAMHD1降解,促进肝癌细胞增殖的机制.方法 收集肝癌患者的肿瘤组织及癌旁组织,通过Western blot检测肝癌组织与相应癌旁组织中SAMHD1的表达;通过CRISP/Cas9基因技术构建敲除SAMHD1的稳定细胞系,检测SAMHD1敲除后,HBV稳定肝癌细胞系HepAD38细胞增殖和细胞周期的变化,通过Western blot检测相关周期蛋白表达的变化和Akt/p27通路的影响.检测HBx蛋白过表达对SAMHD1转录和蛋白水平的影响,通过放线菌酮和MG132处理,以及免疫共沉淀手段,进一步探索HBx调控SAMHD1蛋白降解的分子机制.结果 ①研究发现SAMHD1在肝癌组织的表达量低于癌旁组织(P＜0.01).②成功构建稳定敲除SAMHD1的肝癌细胞HepAD38,MTT实验表明稳定敲除SAMHD1的细胞组较对照组增殖加快(P＜0.01).流式细胞术结果表明敲除SAMHD1的稳定细胞组与对照组相比细胞周期发生改变,敲除组G2/M期细胞数(28.16±0.36)较对照组(22.52±0.56)升高(P＜0.01).③Westem blot检测表明敲除SAMHD1的稳定细胞系与对照组细胞相比细胞周期蛋白表达量发生了改变,实验组细胞p27蛋白表达水平减弱,p-Akt蛋白表达水平提高.④Huh7.0细胞中过表达HBx后,SAMHD1蛋白表达减弱.⑤免疫共沉淀结果表明HBx与SAMHD1相互结合;放线菌酮及泛素化IP实验表明HBx引起SAMHD1蛋白衰减时间提前,并使SAMHD1的泛素化程度加强.结论 HBx与SAMHD1相互作用,通过调控SAMHD1泛素化修饰降解SAMHD1,从而影响Akt/p27通路调控细胞周期,促进肝癌细胞增殖.     

SIV感染CEM&#215;174细胞后CD28家族免疫调控分子mRNA的动态变化

目的观察猴免疫缺陷病毒（SIV）感染CEM&#215;174细胞后CD28家族免疫调控分子CD28、BTLA、ICOS、PD-1 mRNA表达水平的动态变化。方法以SIVmac251感染接种CEM&#215;174细胞,收集感染后12,24,48,72,96,120,144,168,216h共8个时间点及正常未感染细胞,提取细胞RNA,以染料法逆转录荧光定量PCR法检测SIV、CD28、ICOS、PD-1、BTLA mRNA的表达。结果SIV mRNA在48h时表达即显著升高（P〈0．05）,随着SIV mRNA量的逐渐上升,ICOS在48h时开始显著升高（P〈0．05）,而CD28、PD-1 mRNA在120h时才出现表达显著增加（P〈0．05）;BTLA mRNA则呈现下降趋势,并在168h开始出现显著下调（P〈0．05）。结论除BTLA以外,所检测SIV感染后细胞中促进免疫激活和抑制免疫的免疫调节因子（ICOS、PD-1、CD28）表达均显著升高,提示AIDS中存在免疫紊乱。     

SAMHD1限制HIV/SIV病毒复制功能研究的最新进展

SAMHD1是宿主限制性天然免疫分子,主要在髓系细胞及静息CD4⁺T细胞中表达,通过降低胞内dNTP水平限制HIV-1的复制和感染。近来研究发现SAMHD1还能够促进HIV/SIV病毒的基因重组、降解病毒基因组RNA以及抑制病毒在细胞间的传播,在病毒的感染、复制、包装、传播等整个生命过程中都发挥着一定的作用。目前这一天然抗病毒蛋白分子已经成为HIV研究领域的新热点, 本文将就SAMHD1抗HIV病毒研究的最新进展做一综述。     

RT-SHIV中国恒河猴适应株细胞水平生物学特性分析

目的 体外增值、制备动物感染来源的RT-SHIV病毒中国恒河猴适应株,比较PBMCs和CEMx174两种细胞制备出病毒的差异,同时用TZM-bl、CEMx174、PBMC三种细胞滴定测定病毒TCID50.方法 用RT-SHIV病毒静脉感染中国恒河猴,定期采血测定血浆病毒载量,当病毒载量达高峰时采血分离外周血单核淋巴细胞(PBMCs),与正常恒河猴PBMCs或CEMx174细胞共培养,定期测定培养液中的P24抗原水平,当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存;测定病毒RNA载量、P24抗原浓度,滴定病毒的TCID50.结果 本研究共制备了78 mL PBMCs来源的RT-SHIV病毒和85 mL CEMx174细胞来源的RT-SHIV病毒.RT基因序列和原始序列的相似度为99%,仅在第254和265位的氨基酸发现突变.RT-SHIV(PBMC)和RT-SHIV(CEMx174)病毒载量分别为1.641×108 copies/mL和8.375×108 copies/mL,P24抗原水平分别为20.745 ng/mL和4.28 ng/mL,TZM-bl、CEMx174、PBMC细胞测定病毒的TCID50分别为3.16×105 TCID50/mL和1×104 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×105 TCID50/mL,5×102 TCID50/mL和5×103 TCID50/mL.结论 PBMCs细胞来源制备的病毒较CEMx174制备的病毒具有更高的感染性.     

SIVmac239感染恒河猴急性期回肠派氏淋巴结中淋巴细胞亚群的变化

目的分析SIVmac239感染早期中国恒河猴回肠派氏淋巴结淋巴细胞数量及亚群的变化,探讨这些变化与疾病进展的可能关系。方法以静脉注射SIVmac239制备恒河猴AIDS模型,对回肠派氏淋巴结进行CD4和CD8免疫组化标记,分离Peyer’s集合淋巴结淋巴细胞,分别标记CD3、CD4、CD8、CD28、CD95单克隆抗体,以流式细胞仪检测T细胞及其亚群的表达情况。结果 SIVmac239感染急性期中国恒河猴Peyer淋巴结中CD4+/CD8+比值持续下降,记忆性细胞比例升高,但Peyer淋巴结形态及CD4+T细胞数量未见明显变化,CD8+T细胞从第5天开始持续升高。结论 SIVmac239感染急性期,中国恒河猴回肠派氏淋巴结形态及CD4+T细胞数量基本维持,向记忆性细胞的转化增加,但是CD4+/CD8+比值下降。     

猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）恒河猴适应株耐9-(2-磷酸甲氧丙基)腺嘌呤(PMPA)突变位点筛查

目的初步明确猴免疫缺陷病毒（SIVmac239）耐9-（2-磷酸甲氧丙基）腺嘌呤（PMPA）突变基因位点,指导SIV／恒河猴模型在药物评价中的应用。方法SlVmae239恒河猴适应株感染恒河猴,之后进行PMPA治疗,测定不同时间点血浆病毒载量和外周血CD4^＋T细胞数;使用CEMx174细胞进行药物敏感实验。单拷贝PCR测定病毒rt基因变异情况。结果PMPA治疗不能有效降低感染猴血浆病毒载量,且对血CD4^＋T细胞数没有显著影响;细胞水平药物敏感实验证实该病毒株对PMPA不敏感。序列比对发现S205L和M5021可能影响到病毒对PMPA的药物敏感性。结论本研究为SIV／恒河猴模型的合理使用及HIV-1的临床治疗提供了信息。     

SIVmac239感染T淋巴细胞后的上清液对B淋巴细胞增殖的抑制

目的探讨恒河猴免疫缺陷病毒SIVmac239感染CD4+T淋巴细胞后,能否产生某些可抑制B淋巴细胞生长的活性因子。方法用MTT实验观察不同时间收集的SIVmac239感染的CD4+T淋巴细胞上清液和未感染SIVmac239的CD4+T淋巴细胞(C8166)的上清液对猕猴B淋巴细胞(MM133)生长的抑制作用情况。结果SIVmac239感染的CD4+T淋巴细胞上清含有抑制猕猴B淋巴细胞生长的因子,并且,其抑制效果随着作用时间的延长而增加。结论SIVmac239感染CD4+T淋巴细胞可产生抑制B淋巴细胞生长的因子。     

人巨细胞病毒负荷量对细胞病变的影响

目的探讨感染后人巨细胞病毒负荷量与细胞病变的关系。方法采用不同滴定度的人巨细胞病毒感染传代培养的人胚肺成纤维细胞,建立人巨细胞病毒梯度感染细胞模型,荧光定量PCR法测定感染细胞内及其维持液病毒DNA量,光镜观察致细胞病变作用,电镜检查其超微结构的改变。结果人巨细胞病毒感染后,细胞内与其维持液病毒DNA量成正相关(r=0.83,P<0.01)。当细胞内病毒DNA量>105GE/106HEL时,病毒开始自细胞内释放;当维持液病毒DNA量>103GE/ml时,细胞出现病变。结论人巨细胞病毒感染后,受染细胞排放病毒致细胞外,且细胞内外病毒负荷量成正相关。细胞病变的发生情况与细胞内及其周围环境的病毒负荷量均密切相关。     

SHIV_(SF162P3)中国恒河猴细胞适应株的制备和鉴定

目的体外制备SHIVSF162P3中国恒河猴细胞适应株,建立病毒库,为模型制备提供生物学特性稳定的感染用病毒。方法用SHIVSF162P3体外感染中国恒河猴外周血单个核细胞(PBMCs),定期测定培养液中的P24抗原水平。当病毒复制达高峰期时收集培养上清,分装并冻存。测定病毒RNA载量、P24抗原浓度和TCID50。利用病毒RNAenv区(M33262,6846bp～8481bp,共1636bp)序列分析的方法分析毒株在制备过程中的变异情况。静脉途径感染中国恒河猴G0801V,观察血浆病毒载量、外周血CD4+/CD8的变化情况。结果本研究共制备了275mLSHIVSF162P3病毒,病毒载量为4.389×107copies/mL,P24抗原水平为5.64×102pg/mL,TZM-bl细胞滴定TCID50为8.37×104/mL。gp120序列测定分析表明病毒未发生变异,CCR5的嗜性也未发生改变。感染猴G0801V高峰期病毒载量超过1×108copies/mL,急性期CD4+/CD8+倒置。结论此次制备的SHIVSF162P3细胞适应株生物学特性稳定,适合作为毒种库构建SHIVSF162P3/中国恒河猴模型。     

腺病毒55型对人肠道细胞感染性的实验研究

  目的  明确腺病毒55型（HAdV-55）对人肠道细胞的感染性。  方法  体外培养人结直肠腺癌细胞Caco-2，以HAdV-3、7、14和55感染，免疫荧光法检测感染细胞内病毒蛋白的表达，荧光定量PCR方法检测不同时间点细胞内和上清中病毒DNA水平，采用腺病毒敏感细胞株HEp-2感染实验检测Caco-2细胞上清中感染性病毒颗粒水平。  结果  免疫荧光检测结果显示，感染48 h后，Caco-2细胞内HAdV-55病毒蛋白表达为阳性。HAdV-3、7、14、55在Caco-2细胞内均能持续复制和增殖，感染细胞内和上清中病毒DNA水平随感染时间的增加而升高，并且HAdV-55病毒DNA水平明显高于HAdV-3、7和14型。Caco-2上清中HAdV-55感染性病毒颗粒高于HAdV-3、7和14，差异有统计学意义（P<0.05）。采用低剂量病毒〔1×半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）〕感染Caco-2细胞，HAdV-55感染孔细胞病变效应（CPE）比HAdV-3、7和14感染孔细胞显著。  结论  人呼吸道病毒HAdV-55对肠道细胞易感，感染水平高于其他常见的呼吸道感染腺病毒3、7和14型。