肝癌中高表达的新基因LAPTM4B对细胞增殖及成瘤性的影响

目的：研究在肝细胞癌中高表达的新基因LAPTM4B对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响，探讨LAPTM4B基因的生物学功能。方法：构建真核表达质粒pcDNA3-TM4B，利用脂质体稳定转染LAPTM4B cDNA至NIH3T3细胞中，用RT～PCR、Northem和Western杂交法筛选和鉴定转染后LAPTM4B基因高表达的单克隆细胞株，研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果：与转染空载体的对照组相比，转染了LAPTM4B cDNA的NIH3T3细胞表面发生明显变化，微绒毛的数量和长度增加，多分枝且缠绕成团。转染细胞在纤黏连蛋白、人工基膜和层黏连蛋白基质上的黏附／铺展能力增强。生长曲线显示转染细胞的生长速率增高。流式细胞仪检测显示转染细胞的S期细胞数比未转染细胞显著增多，而G0-G1期细胞数减少。Western杂交显示Cyclin E蛋白在转染细胞中的表达显著增加。转染细胞对血清的依赖性下降并具有成瘤性。结论：LAPTM4B基因能影响细胞增殖的调节，促进NIH3T3细胞的增殖，并使NIH3T3细胞具有成瘤性，在肿瘤发生过程中具有重要的作用。     

再生基因4及其编码产物在消化道肿瘤中的作用

再生基因4（ regenerating islet - derived family, member 4, REG4 ）是一个新发现的基因，可能参与肿瘤尤其是消化道肿瘤的发生和发展。本文就Reg4基因及其编码产物RegⅣ蛋白所在家族、结构、功能及其与消化道肿瘤的关系、所参与的信号转导通路等问题作一综述。     

抗衣原体单克隆抗体的制备及其生物学特性鉴定

目的：制备抗衣原体的单克隆抗体,为研制表原体快速检测卡作准备。方法：用沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体分别免疫BALB／c小鼠．按常规淋巴细胞杂交瘤技术制各单克隆抗体。结果：获得抗沙眼衣原体及抗鹦鹉热衣原体单克隆抗体各3株,经检测6株单抗均具有较高的属特异性,不与其他微生物发生交叉反应。结论：本研究为进一步研制衣原体快速检测卡奠定了基础。     

反义Smad4基因对贮脂细胞系CFSC生物学特性的影响

目的 探讨通过反义Smad4基因转移阻断转化生长因子β1(TGF-β1)的信号传导后对贮脂细胞部分生物学特性的影响。方法 分别构建、重组了含有反义Smad4基因序列的复制缺陷型腺病毒表达载体AdvATSmad4和空病毒表达载体Adv0。将两种复制缺陷型腺病毒扩增纯化,再分别转入贮脂细胞系CFSC内,测定它们生长曲线、^3H掺入率(^3H—TdR)、脯氨酸掺入等部分生物学特性的变化,并用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹和免疫组织化学等方法检测转基因细胞Smad4和细胞外基质的表达。结果 与正常对照组CFSC和转染Adv0的CFSC细胞相比较,转染AdvATSmad4的CFSC细胞内有反义Smad4表达,其生长曲线、^3H—TdR、脯氨酸掺入等均有不同程度的降低,且其合成分泌Smad4和细胞外基质减少。结论 反义Smad4基因可以抑制贮脂细胞内源性Smad4的表达,抑制贮脂细胞的生长、繁殖和细胞外基质的产生,可作为抗肝纤维化基因治疗的选择之一。     

人EIF2B4基因一个新的可变剪接产物及其鉴定

目的对人EIF2B4基因新的可变剪接产物进行鉴定。方法应用长链RT-PCR技术扩增人外周血EIF2B4基因编码区全长序列并进行T克隆及序列测定,用常规RT-PCR对新型可变剪接产物进行验证。结果在EIF2B4基因转录产物中检测出正常变异体2和3(两者只相差3个碱基),同时发现一个外显子7缺失26bp的转录产物。结论利用长链RT-PCR结合T克隆-测序的方法,发现人EIF2B4基因的一个新型可变剪接产物。     

人肝癌细胞系HCC-9724的建立及其生物学特性

目的 建立一株肝癌细胞系ＨＣＣ－９７２４,为肝癌研究提供实验模型。方法 无菌切除肝癌手术标本,６只裸鼠右后肢皮下包埋,体内连续传３代后,取移植瘤体外培养,绘制细胞生长曲线,光镜、电镜观察细胞形态,并进行细胞周期和染铎体核形分析,用免疫荧光法测定荷瘤鼠中ＡＦＰ的表达,结果 移植模型原代获得率为３３．３％,潜伏期为５２ｄ,自第３代后肿瘤获得率为１００．０％,潜伏期为１６ｄ,该模型移植瘤具有生长,稳定,     

人巨细胞病毒B基因抗原编码区表达产物的初步应用

目的 人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）５２kd糖蛋白重组表达质粒（pＨＣＭＶ５２）经诱导、 增殖、提取并纯化表达产物。方法 采用同位素法（＾１２５Ｉprotein Ａ）和非同位素 法（碱性磷酸酶标记抗人ＩgＧ）检测了已知ＥＬＥＳＡＨＣＭＶ－ＩgＭ阳性和阴性血清各７７例和４例。结果 同位素汪与ＥＬＩＳＡ一致,非同位素汪阳性例为７５/７７例。表 达产物免疫家兔制备的抗血清,用ＡＢＣ法检测肝组织中ＨＣＭＶ抗原,发现ＨＣＭＶ５２     

端粒酶调节相关基因TRAP与肿瘤生物学特性的关系

目的：研究TRAP基因在人肿瘤组织中的表达及其与人端粒酶逆转录酶(hTERT)的作用相关性，探讨其在人肿瘤发生中的作用。方法：通过原核表达TRAP蛋白免疫新西兰白兔，制备特异性多克隆抗体；免疫组化检测TRAP及hTERT在人肿瘤组织中的表达；通过构建TRAP真核表达载体、基因转染，观察TRAP对细胞hTERT转录、端粒酶活性和癌细胞生长及成瘤性的影响。结果：通过大肠杆菌表达的TRAP蛋白免疫、制备多克隆抗体，经Westem blot鉴定与TRAP具有特异结合性；免疫组化显示247例恶性肿瘤中有213例TRAP阳性，表达率为86．2％，而在所有癌旁组织中TRAP为阴性。另外，交界性及癌前病变与良性病变组织中TRAP表达差异也有显著性：进一步检测卵巢生发上皮肿瘤、乳腺癌、肝癌及中枢神经系统肿瘤组织hTERT表达，显示hTERT与TRAP表达的结果相一致。TRAP正义转染使hTERT及端粒酶活性升高，细胞增殖加快；而反义转染时，两者均下降，细胞增殖受抑。裸鼠成瘤性实验表明：正义TRAP使癌细胞成瘤性增强，而反义则抑制移植瘤的生长。结论：TRAP表达存在于人癌组织及部分癌前病变，与癌细胞恶性表型相关，并与hTERT表达一致。TRAP基因参与对端粒酶的调节作用，可能与人肿瘤发生有关。     

人幽门螺杆菌尿素酶B编码基因的克隆及序列分析

目的 获取含人幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B编码基因并构建其原核表达的重组栽体，进行核甘酸序列分析，为在E．coli BL21中表达，疫苗的开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术从Hp DNA染色体中，扩增尿素酶B编码基因片段。将目的基因与pET32a( )同时经SacI、Xhol双酶切、纯化、连接后，转化含有目的基因的重组载体，进行序列分析。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为Hp尿素酶B编码基因，与GenBank公布的序列相比较，有l.8％的bp发生变异，0．35％的氨基酸残基改变，但同源性高达98％。结论 成功地克隆了Hp尿素酶B编码基因，为Hp蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒的开发奠定了良好的基础。     

LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的:LAPTM4B基因是肝癌中高度表达的新基因.为下一步LAPTM4B启动子的活性分性,本文构建了LAPTM4B基因启动子调控的报告基因重组表达质粒.方法:以LAPTM4B基因组cDNA为模板扩增翻译起始位点上游DNA序列.PCR产物定向克隆到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,并经限制性内切酶消化鉴定.结果:通过酶切鉴定和基因测序,证明成功地构建了三种不同长度的pGL3-LAPTM4B-Luc荧光素酶表达质粒,形成了系列的LAPTM4B启动子重组体.结论:充分利用生物信息学资源,利用已知基因的启动子序列,可快速,准确地克隆已知基因启动子序列并构建启动子载体.LAPTM4B启动子荧光素酶报告基因重组体的构建为LAPTM4B启动子的活性分析奠定了基础.     

LAPTM4B-35蛋白作为肝癌血清学诊断新标志物的探讨

目的: LAPTM4B-35是北京大学基础医学院发现和鉴定的一个肿瘤驱动基因LAPTM4B所编码的蛋白质同型分子(isoform)之一,其在多种恶性肿瘤中[如肝癌、肺癌(包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌)、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、胆囊癌、胆管癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌等]均超高表达。实验室和临床资料均证明,LAPTM4B-35蛋白的过表达促进肿瘤生长、转移和多药耐药,LAPTM4B-35的蛋白表达水平与肝癌的复发相关。本文的目的在于鉴定患者体内的肝癌细胞和体外培养的肝癌细胞系是否释放出LAPTM4B-35蛋白到血液和细胞培养液中,以及其可能的存在形式,为建立肝细胞癌等肿瘤的血清学诊断新方法奠定基础。方法: 采用免疫印迹分析(Western blot)、酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)鉴定LAPTM4B-35蛋白,应用超滤和超离心方法从肝癌细胞培养上清液中分离、纯化外排体(exosome)。结果: 特异性抗体的ELISA结果表明,肝细胞癌患者的血液中存在LAPTM4B-35蛋白,体外培养的肝癌细胞以外排体形式释放LAPTM4B-35蛋白到培养基的上清液中。ELISA夹心法检测表明,肝细胞癌患者(n=43)血淸中LAPTM4B-35蛋白的平均水平和中位值均显著高于正常人(n=33)。结论: 肝癌细胞以外排体形式释放到其外环境中的LAPTM4B-35蛋白有望成为肝细胞癌血清学诊断的新标志物。     

肝癌中乙型肝炎病毒整合位点的研究

目的探讨乙型肝炎病毒（HBV）在肝细胞染色体上的整合规律及其在肝癌形成中的作用.方法以蛋白酶消化/酚抽提法,自40例乙肝相关性肝癌标本中抽提组织DNA.以肝癌组织DNA为模板,HBV X基因上游序列和人类基因组Alu重复序列为引物,多聚酶链反应法（PCR）扩增出HBV X基因及其侧翼的人基因组DNA片段.PCR产物割胶回收后以ABI公司3700测序仪进行全自动测序,所获结果经NCBI（national center for biotechnology information）BLAST及MapViewer检索确定HBV整合在染色体上的精确位置.结果在40例乙肝表面抗原阳性的肝癌组织中,有34例（85%）存在HBV整合现象.每份标本中的病毒整合拷贝数为1～5个不等,因此共获得了68个病毒整合位点.从病毒基因分析,整合可发生于X基因的任何长度,并不集中于通常认为的HBV DR1和DR2区,但在96%（65/68）的整合中,X基因均以截短形式插入宿主细胞DNA;从宿主基因分析,HBV偏好插入于基因的内含子和上游调控区,未见外显子中的插入.这些基因80%已被报道与肿瘤有关,它们的产物大多与细胞基本生存和死亡密切相关,可在各个细胞调控环节上促进肿瘤生成.十分有意义的是,在总共26个基因中即有3个基因（myeloid/lymphoid or mixed-lineage leukemia 4,Gprotein alpha transducing activity polypeptide 1和fibronectin 1）发现被HBV重复整合.结论HBV在肝癌细胞染色体上的整合并不呈均衡分布,病毒对宿主细胞的＂插入诱变＂及整合子中持续表达的＂截短型X蛋白＂可能在病毒的致癌过程中起重要作用.     

Proteomic analysis of differently expressed proteins in human hepatocellular carcinoma cell lines HepG2 with transfecting hepatitis B virus X gene

Background Hepatitis B virus encoded X protein （HBx） is a trans-activating protein that may be involved in hepatocarcinogenesis, although few natural effectors of HBx that participate in this process have been identified. We screened, by comparative proteomics method, effectors of HBx associated with hepatocarcinogenesis.
Methods HBx positive and negative HepG2 cells were constructed and expression patterns of cellular proteins were obtained by high resolution, two dimensional electrophoresis. Comprehensive analyses of proteins associated with hepatocellular carcinoma （HCC） were focused on the differently expressed proteins （more than two-fold increase or decrease, P 〈0.05） from HBx positive and negative HepG2 cells. For peptide mass fingerprinting, protein spots with different intensity between HBx positive and negative HepG2 cells were directly cut out of gels and processed for matrix assisted, laser desorption/ionization, time of flight mass spectrometry and liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-ESI-MS/MS） analysis.
Results The mean number of protein spots for HBx negative and HBx positive HepG2 cells were 2095±137 and 2188±105, respectively. The analysis of paired cells showed 75 spots with significant differences in expression between HBx negative and HBx positive cells： 37 spots corresponding to 32 different proteins; 25 proteins were upregulated, 7 downregulated. We found 7 proteins not previously reported differentially expressed in HBx positive HepG2 cells. Variations in protein accumulation were confirmed for four （HSP90AB1, BCL2 associated athanogene 2. nucleophosmin and chloride intracellular channel 1） by Western blotting in HBx positive HepG2 cells.
Conclusions Numerous effectors of HBx that may promote the development of HCC are identified, of which 7 are newly noted in HepG2 cells. Several of these effectors of HBx may help in elucidating the roles of HBx in hepatocarcinogenesis and diagnostics or targets for therapeutic intervention.     

慢性乙型病毒性肝炎、肝癌组织HLA Ⅰ类抗原的表达及意义

目的：探讨慢性乙型肝炎、肝癌组织中人类白细胞抗原I（HLA I）的表达和临床意义。方法:应用流式细胞仪对51例慢性乙型肝炎患者肝组织和43例原发性肝癌癌组织中的HLA I抗原进行检测。结果:肝癌组织中HLA I抗原表达为36.47±19.38，明显低于慢性乙肝的79.54±41.55和正常肝组织的81.86±46.53（P均＜0.01），而慢性乙型肝炎肝组织和正常肝组织HLA I类抗原表达无明显差异（P＞0.05），伴有肝内和(或)淋巴结转移的肝癌组织中HLA I抗原表达较无转移组明显降低（22.83±11.59 vs 46.28±23.16，P＜0.05);HLA I类抗原表达与血清AFP水平呈明显负相关（r=-0.741?1, P＜0.01）,但与肝癌组织分化程度呈明显正相关(r=0.805?1, P ?.05)。结论:HLA I抗原表达异常与肝癌的发生和转移密切相关。 ［关键词］HLA I类抗原;肝炎，乙型;癌，肝细胞     

Biological function of a novel gene overexpressed in human hepatocellular carcinoma

Objective To clone the full-length of a differentially expressed cDNA fragment, LC27, and study its biological function tentatively. Methods Northern blot was used to analyze the expression pattern of LC27 in hepatocellular carcinoma, matched nontumor liver tissues, fetal liver and normal adult liver tissues, as well as BEL-7402 hepatocellular carcinoma cell line ESTs splicing and 5’ rapid amplification of cDNA ends (5’ RACE) were used to clone the full-length of LC27 cDNA.An antisense oligodeoxynucleotide approach was used to investigate the biological role of the gene in the proliferation of BEL-7402 cells. Results A 2186 bp novel cDNA with an open reading frame encoding a 283 amino acid protein was cloned.Analysis of the deduced amino acid sequence indicated that it is 38% (88/229) identical to human Golgi 4-transmembrane spanning transporter MTP.The gene and the encoded protein was termed hepatocellular carcinoma overexpressed transmembrane protein (hotp) and HOTP, respectively.Hotp mRNA was almost undetectable in normal adult liver and fetal liver tissues.However, it was significantly up-regulated in hepatocellular carcinoma and some matched nontumor liver tissues, as well as BEL-7402 cells.The proliferation of BEL-7402 cells was suppressed by an antisense oligodeoxynucleotide against hotp mRNA at a concentration of 50 μg/ml. Conclusion HOTP may be an integral membrane transporter protein.The overexpression of the gene in hepatocellular carcinoma may play an important role in hepatocarcinogenesis and disease progression.     

人B淋巴细胞活化相关新基因的克隆

目的：分离新的与B细胞活化相关基因。方法：采用差异显示反转录PCR（DDRT－PCR）技术对人扁桃体活化和静止B细胞mRNA的差异表达进行分析。差异显示的片段经过Northern杂交验证后,作为探针进行人活化B细胞cDNA文库的筛选。结果：差异显示分析共获得明显的差异表达的标签序列(expressed sequence tag,EST)62条,其中主要在静止B细胞表达的有32条,在活化B细胞表达的有30条,经Northern 杂交验证,共获得阳性的片段25条,以在活化B细胞中高表达的EST30为探针,经3轮筛选人活化B细胞文库后获得1个新的全长为2048bp的cDNA克隆,该克隆含有1个630bp的开放读码框,其推断的氨基酸序列N端与酵母的动力蛋白KAR3部分同源,结论：克隆了1条可能与B细胞活化相关的新基因。     

膜联蛋白A4在原发性肝细胞癌中的表达及其意义

目的观察膜联蛋白A4（Annexin A4）在不同肝细胞性肝癌（HCC）组织中的表达情况,探讨其临床病理意义。方法先应用RT-PCR验证ANX A4在不同类型肝组织中mRNA的表达,再应用免疫组织化学方法检测在15例正常肝组织、15例乙肝后肝硬化组织和63例不同表型肝癌组织标本中的表达,探讨其差异表达与临床病理资料之间的联系及其意义。结果（1）ANX A4mRNA表达水平在肝硬化及肝癌组织中均比正常肝组织上调（P〈0．05）,但肝硬化组与肝癌组差异无统计学意义（P〉0．05）;（2）ANXA4蛋白阳性表达率正常肝组织为20％,乙肝后肝硬化组织为26．67％;在63例HCC中阳性率为49．21％,癌旁组织为61．90％,其中小肝癌阳性率为50．00％,大肝癌为64．29％,多发癌为28．57％,相应癌旁组织阳性率分别为50．00％、64．29％、66．67％。随着肝细胞的恶性转化并进展,ANXA4蛋白呈逐渐上调趋势,但当肿瘤出现侵袭转移时反而下调。与临床病理指标的相关性研究表明Annexin A4与HCC进展及侵袭相关。结论（1）从正常肝一肝硬化一肝癌组织,Annexin A4的mRNA表达水平逐渐上调;（2）ANxA4蛋白在HCC组织中的表达明显失调,其变化可能与HCC进展及侵袭相关。     

LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性的关系

目的:探讨溶酶体相关4次跨膜蛋白质β(lysosome-associated protein transmembrane4 beta,LAPTM4B)基因多态性与肺癌易感性的关系.方法:以病例-对照研究的方法,用基于特异性引物的PCR对134例正常人和162例肺癌患者进行LAPTM4B基因分型,将卡方检验用于检测肺癌组和对照组基因型频率和其它参数的分布.结果:LAPTM4B的*2等位基因频率在肺癌组中为40.1%,较对照组(28.0%)显著增高(P=0.002).基因型分布在肺癌组和对照组间差异有统计学意义.*1/2和*2/2基因携带者患肺癌的危险性分别是*1/1的1.91倍(95%CI:1.178～3.110)与3.26倍(95%CI:1.338～7.929).LAPTM4B基因型分布与患者年龄,肺癌的病理类型,分化程度,临床分期以及HBV感染等无明显关系.结论:LAPTM4B基因多态性与肺癌易感性相关,* 2等位基因可能是肺癌发生的危险因素.