shRNA抑制小鼠肝癌细胞株JNK的表达及细胞迁移和侵袭

目的：研究shRNA对小鼠肝癌细胞株Hca-F JNK基因表达的抑制作用及对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,阐明JNK表达水平与小鼠肝癌细胞淋巴转移潜能的关系。方法：构建3条shRNA表达载体,以脂质体法稳定转染Hca-F细胞;RT-PCR 和 Western blotting检测shRNA对JNK基因和蛋白表达的抑制作用,筛选出RNA干扰效果最好的shRNA;Transwell 实验检测Hca-F细胞穿膜细胞数观察shRNA对Hca-F细胞迁移和侵袭能力的抑制作用。结果：成功构建pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞,筛选出对JNK表达抑制效果最好的shRNA;其转染后JNK mRNA表达水平与其他组比较明显下调 ( P<0.01 );JNK蛋白质表达水平与其他组比较明显减少 ( P<0.01 );转染shRNA后Hca-F细胞穿膜细胞数均显著下降（P<0.05）。结论：通过建立pSilencer-shRNA表达载体并稳定转染Hca-F细胞株,获得JNK表达稳定下调的Hca-F细胞株,抑制JNK表达水平可降低小鼠肝癌细胞的迁移和侵袭能力,JNK可能是决定肝癌淋巴转移潜能的重要基因之一。     

超声靶向微泡破坏技术介导基因转染的研究进展

随着肿瘤分子机制研究的不断深入,利用肿瘤与正常组织基因及调控区域的结构差异,从分子水平特异性杀伤肿瘤细胞的基因治疗成为肿瘤治疗中极具应用潜力的新策略。超声靶向微泡破坏技术介导的靶向基因治疗方法既可增强裸质粒DNA在癌细胞内的转染和表达,又能提高基因治疗的靶向性,减少全身不良反应,是一种很有前途的临床肿瘤治疗技术。作者就有关超声结合纳/微泡介导的输送系统的作用机制及其在基因转染的应用进展和影响因素作一综述。     

超声靶向微泡破碎介导EGFP质粒转染肝癌细胞的研究

目的 探讨超声靶向微泡破碎(ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD)介导EGFP质粒转染肝癌细胞株HepG2的有效性、安全性并优化超声辐照参数.方法 体外培养HepG2细胞,在治疗超声的不同声强、占空比和辐照时间作用下,观察pEGFP-N3质粒在HepG2细胞中...     

应用载体介导的RNA干扰技术抑制肝癌细胞H-rasVal12的表达

目的观察载体介导的RNA干扰(RNAi)技术对肝癌细胞突变的H-rasVal12表达的抑制作用。方法将针对突变H-ras的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体转染肝癌细胞株BEL7402和SMMC7721,用免疫印迹(Western blot)法检测H-ras蛋白的表达,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。计量资料比较采用t检验;计数资料比较采用χ2检验。结果 (1)转染前、后SMMC7721的H-ras蛋白表达量〔光密度值分别(1 752±21)和(1 736±28)〕比较,差异无统计学意义(t=0.474,P=0.646);而转染了H1-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表达量(920±11)与转染前(1 221±11)比较,差异有统计学意义(t=20.126,P<0.01);转染了H2-shRNA的BEL7402的H-ras蛋白表达量(872±10)与转染前(1 201±10)比较,差异有统计学意义(t=23.477,P<0.01)。H1-shRNA组和H2-shRNA组H-ras蛋白表达下调了62.8%和63.4%。(2)流式细胞仪检测表明,BEL7402转染H1-shRNA质粒后细胞凋亡率(47.7%)与转染H2-RNA质粒后细胞凋亡率(49.3%)比较,差异无统计学意义(χ2=0.005,P=0.94);但均高于BEL7402转染对照质粒后细胞凋亡率(30.2%),差异有统计学意义(χ2H1=6.810,P<0.01;χ2H2=6.103,P<0.01)。结论载体介导的RNAi技术可有效特异抑制肝癌细胞突变的H-rasVal12表达,对野生型的H-ras表达无影响。     

膜联蛋白A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株的建立

目的:建立针对膜联蛋白A7(annexin A7)的shRNA(small hairpin RNA)稳定转染的小鼠肝癌细胞株Hca-F,为后续研究奠定基础.方法:构建3条针对annexin A7的shRNA(shRNA1、2、3),分别与pSilencer连接,构建表达载体并分别转染Hca-F细胞,在mRNA和蛋白质水平比较3条shRNA对annexin A7表达的抑制作用,筛选抑制效果最好的shRNA转染Hca-F.稳转后用含400 μg/ml G418的完全培养基筛选,获得annexin A7表达稳定下调的Hca-F细胞株后传代扩增,应用Western印迹法检测Hca-F细胞annexin A7蛋白的表达,并与空载体转染组及正常对照组进行比较.结果:经DNA测序鉴定,所得到干扰序列与GenBank中序列一致;筛选出其中shRNA1对annexin A7的表达抑制效果最好.pSilencer-shRNA1转染Hca-F细胞株后,annexin A7蛋白的表达远低于空载体转染组和正常对照组(0.318 6 vs 0.798 7,0.824 3,P<0.05),而后二者间无统计学差异.结论:成功建立了annexin A7表达稳定下调的小鼠肝癌Hca-F细胞株,为后续研究奠定了基础.     

超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染树突状细胞的实验研究

目的 探讨超声微泡造影剂介导LMP-1基因转染外周血来源的树突状细胞的有效性及最佳的超声辐照参数.方法 体外培养树突状细胞,在不同的超声波强度、机械指数、照射时间及不同的超声微泡造影剂浓度作用下,观察LMP-1基因与绿色荧光蛋白共表达的融合重组质粒pEGFP-C3-LMP1在树突状细胞的定向转染.在荧光显微镜下观察荧光蛋白质粒在树突状细胞中的表达,流式细胞仪评价重组质粒的转染效率,台盼蓝染色检测细胞活性.结果 超声辐照机械指数1.0、照射时间60 s、微泡造影剂浓度为20%,达到最佳的基因转染效率(14.37±2.12)%,且细胞生存率>90%.结论 微泡造影剂在超声辐射下可以有效地介导基因转染树突状细胞.     

携目的基因的靶向超声微泡对肝癌HepG2细胞增殖活性的影响

目的 制备一种靶向肝癌HepG2细胞的载单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(HSV-TK)基因超声微泡,并考察其体外寻靶能力及对HepG2细胞的增殖抑制作用.方法 用机械振荡法制备超声微泡,生物素-亲和素桥连方式构建靶向载HSV-TK超声微泡.检测其一般特性,并进行体外实验检测其对HepG2细胞增殖的影响.结果 靶向载HSV-TK超声微泡可较多地聚集在HepG2细胞表面,通过检测增殖细胞核抗原(PCNA)及噻唑蓝(MTT)法,发现载基因靶向微泡组的增殖能力明显下降,细胞凋亡明显增加,细胞侵袭实验表明载基因靶向微泡组(22.18±2.01)较对照组及载基因非靶向微泡组明显减少,对HepG2细胞增殖及侵袭能力有较好的抑制作用.结论 携目的基因靶向超声微泡对肝癌HepG2细胞在体外有较好抑制效果.     

自制辅助装置完成超声微泡介导pEGFPC1-Akt1基因转染

目的初步探讨超声微泡介导基因转染的可行性.方法 自制辅助装置,联合应用超声辐射和SonoVue超声微泡介导pEGFPC1-Akt1基因转染293FT细胞,用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为报告基因,转染后荧光显微镜下计数细胞转染率.实验分4组:A组,单纯质粒组;B组,质粒+微泡组;C组,质粒+超声组;D组,质粒+超声+微泡组.结果自制辅助装置制作成功,符合实验要求的条件.转染结果为 A组和B组未见荧光表达,C组转染率约为4.26%,D组转染率为34.56%,D组转染率高于C组(P<0.05).结论 使用自制辅助装置,联合应用超声辐射和微泡法能够有效介导pEGFPC1-Akt1基因转染.     

超声联合微泡介导缺氧诱导因子-1α基因转染293T细胞的实验研究

目的:探讨超声联合微泡造影剂介导缺氧诱导因子(HIF)-1α基因转染人胚肾293T细胞的转染效率。方法:将6孔板中的293T细胞悬液分为3组,A组:质粒+超声辐照组,加入质粒,终浓度为15μg/孔;B组:载基因微泡+超声辐照组,加入载基因质粒微泡混合液,质粒的终浓度为15μg/孔,微泡的终浓度为200μl/孔;C组:对照组,每孔中仅加入单纯质粒DNA,终浓度15μg/孔。A组和B组均接受超声辐照,超声照射条件为连续波,声强1.5 W/cm2,辐照时间30s。超声辐照转染48h后,用荧光显微镜和流式细胞仪分别定性定量观察各组细胞基因的转染效率。结果:转染48h后,荧光显微镜观察到转染成功的细胞内发出绿色荧光,流式细胞仪检测A组、B组、C组的基因转染效率分别为(5.6±0.5)%、(30.5±1.0)%、(0.1±0.1)%。结论:超声辐照联合微泡能够介导治疗性基因的体外细胞转染,为冠心病心肌缺血的HIF-1α基因治疗奠定基础。     

靶向超声微泡介导VEGF基因转染对薄型子宫ER的影响研究

目的：研究靶向超声微泡介导血管内皮生长因子（VEGF）基因转染对薄型子宫内膜容受性（ER）的影响。方法：选择40只性成熟但未交配的具有动情周期的雌性SD大鼠进行研究。将其随机分为四组,包括正常组10只,模型组10只,阴性对照组10只,治疗组10只。其中模型组、阴性对照组及治疗组大鼠均自宫角处注入95%无水乙醇贮留5 min制备薄型子宫模型,正常组自宫角处注入生理盐水,贮留5 min。模型组予以生理盐水注射治疗,阴性对照组予以超声微泡+抗体（不含基因）治疗,治疗组则以靶向超声微泡介导VEGF基因转染治疗。比较四组大鼠子宫内膜厚度及腺体数量,子宫内膜血流灌注,子宫内膜VEGF及白血病抑制因子（LIF）水平。结果：正常组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组子宫内膜厚度及腺体数量均高于模型组、阴性对照组（P<0.05）。正常组阻力指数（RI）、搏动指数（PI）、脐动脉收缩压与舒张压比值（S/D）均低于模型组、阴性对照组及治疗组,治疗组RI、PI、S/D均低于模型组、阴性对照组（P<0.05）。正常组子宫内膜VEGF、LIF水平均高于模型组、阴性对照组及治疗...     

shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达

目的：构建绿色荧光蛋白(GFP)的短发夹状RNA(shRNA)，观察其在哺乳动物细胞中抑制外源GFP的表达。方法：设计、合成含GFP编码基因片段，中间被4个bp间隔的反向重复序列，与转录载体pTZU6 1连接，构建pshRNA-GFP重组质粒，与pEGFP-C1共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC-7721，检测其对GFP表达的影响。结果：pshRNA-GFP对共转染的pEGFP-C1中的绿色荧光蛋白有明显的抑制作用，抑制率达70％～85％。结论：构建的pshRNA-GFP重组质粒能有效地抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。     

shRNA介导的RNAi载体构建及对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制

目的:重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用.方法:根据MDR1基因序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列(sh-MDR1-1,sh-MDR1-2),重组构建psh-MDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC-7721/R,用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的潴留.结果:PCR和DNA测序证实了psh-MDR1-1和psh-MDR1-2重组质粒的成功构建,均能有效地抑制细胞P-gp表达;转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性,P-gp表达水平明显降低,细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高;第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论:体外完成shRNA RNAi载体的构建,能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达,抑制P-gp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi,能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.     

JNK酶活性下调对人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞生长的抑制作用

目的：通过c-Jun氨基末端激酶（JNK）抑制剂SP600125和脂质纳米粒子包裹的JNK-siRNA 2种方法在体内和体外分别对JNK基因的表达进行干扰,探讨下调JNK酶活性在肿瘤治疗中的作用。方法：体外实验,将实验分为siRNA组和抑制剂SP600125组。在siRNA组中,使用JNK-siRNA及其对照NC-siRNA分别转染人前列腺癌细胞（PC细胞）、人肝细胞癌细胞（SMMC-7721细胞）和人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）;在抑制剂SP600125组中将SP600125导入肝细胞癌细胞中,采用Western blotting法检测转染JNK-siRNA和SP600125后人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞中JNK或磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表达水平;采用WST-1增殖实验检测各组肿瘤细胞的细胞活力。体内实验,通过皮下注射SMMC-7721细胞建立小鼠皮下肝细胞癌移植瘤动物模型,将8只小鼠饲养至肿瘤生长至3 mm×3 mm,再将模型小鼠随机分为抑制剂SP600125组和阴性对照组,JNK-siRNA组和NC-siRNA对照组,共4组,各组小鼠分别瘤内注射5 nmol SP600125、阴性对照溶液、脂质纳米粒子包裹的JNK-siRNA和NC-siRNA阴性对照,观察各组小鼠肿瘤体积;采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中JNK或p-JNK蛋白表达。结果：体外实验,与NC-siRNA对照组比较,JNK-siRNA组人前列腺癌、肝细胞癌和乳腺癌细胞中JNK蛋白表达水平降低（P<0.01）,抑制剂SP600125组肝细胞癌细胞中p-JNK蛋白表达水平较其阴性对照组明显降低（P<0.01）。体内实验,以肝细胞癌细胞为例,抑制剂SP600125组小鼠肿瘤体积较阴性对照组明显减小,而JNK-siRNA组与其阴性对照组比较肿瘤体积变化不明显。免疫组织化学染色,抑制剂SP600125组小鼠移植瘤组织中p-JNK蛋白表达量和JNK-siRNA组小鼠移植瘤组织中JNK蛋白表达量较各自阴性对照组降低（P<0.01）。结论：在体外和体内实验中下调JNK酶活性在体内和体外均能降低JNK基因的表达水平,进而抑制肿瘤细胞的生长。     

沉默CRAF基因表达对肝癌细胞侵袭和迁移的影响

目的：探讨肝癌细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（CRAF）高表达对肝细胞癌（HCC）侵袭和转移的影响,并阐明其机制。方法：以CRAF高表达的SMMC-7721细胞作为研究对象,采用shRNA技术下调CRAF表达。将SMMC7721细胞分为对照组和沉默组（shCRAF#1转染组和shCRAF#2转染组）。细胞划痕法观察各组SMMC7721细胞创口愈合指数,Transwell实验检测各组SMMC-7721细胞的穿膜细胞数,Western blotting法检测各组SMMC7721细胞中基质金属蛋白酶2（MMP-2）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）的表达水平。结果：细胞划痕实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的创口愈合指数明显降低（P<0.05）。Transwell实验,与对照组比较,沉默组SMMC7721细胞的穿膜细胞数降低（P<0.05）。Western blotting法检测,沉默组细胞中MMP-2和MMP-9表达水平明显低于对照组（P<0.05）。结论：下调CRAF可以通过抑制MMP-2和MMP-9表达抑制肝癌SMMC7721细胞的侵袭和迁移。     

靶向抑制存活素基因对大肠癌细胞SW80侵袭和转移的实验研究

目的 构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞SW480中,研究靶向抑制survivin基因对SW480细胞侵袭和转移的影响.方法 根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19 nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine 2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞SW480中;用Western blotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对SW480细胞的侵袭和转移潜能的影响.结果 Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默SW480的survivin基因可以显著抑制SW480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,SW480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少.结论 Survivin基因可能在SW480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默SW480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响SW480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关.     

靶向干扰CXCR7基因表达对肝癌(HCC)细胞增殖及凋亡的影响

 目的  探讨CXCR7基因在不同肝癌细胞系及肝癌组织中的表达情况,并研究靶向抑制CXCR7基因表达对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法  应用Western blot检测不同肝癌细胞系及10例肝癌组织中CXCR7蛋白的表达水平。采用短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰技术沉默HCCLM3与MHCC97L细胞中CXCR7基因的表达,分别采用Western Blot和qRT PCR检测shRNA的靶向沉默效果。通过CCK-8增殖实验与Annexin V-FITC/PI细胞双染色研究CXCR7抑制对HCCLM3与MHCC97L增殖及凋亡的影响。结果  CXCR7表达水平与肝癌细胞的恶性程度呈正相关,肝癌组织中CXCR7表达水平较癌旁显著升高。实验成功构建了9个慢病毒表达载体,其中CXCR7 shRNA 566序列干扰效率最高。增殖实验显示干扰表达组细胞生长速度受到明显抑制(P<0.05);流式细胞仪分析显示干扰CXCR7表达可诱导细胞凋亡的发生。结论  CXCR7表达水平与肝癌恶性程度呈正相关,靶向干扰CXCR7表达可抑制细胞的增殖能力,诱导细胞发生凋亡。     

小干扰RNA沉默组织因子基因对肝癌侵袭转移能力的影响

目的 应用RNA干扰(RNAi)技术抑制人类肝癌细胞内组织因子(TF)基因表达,从而探讨对其侵袭转移能力的影响。方法 本实验以人类肝癌细胞系HepG2细胞株为实验对象,将携带有针对TF小干扰RNA( siRNA)序列的质粒pGPU6/GFP/Neo-TF siRNA,转染HepG2细胞株,以适当浓度的G418筛选获得阳性克隆,通过RT-PCR和蛋白质印迹法比较转染TF siRNA(+)质粒、转染TF siRNA( -)质粒以及未转染任何质粒的HepG2细胞内源性TF在基因及蛋白质表达水平的差异,进而应用Transwell体外侵袭实验检测三者的侵袭转移能力,探讨TF对肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。结果 (1) RT-PCR结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF表达水平低于转染TF siRNA（-）质粒和未转染质粒的表达水平。(2)蛋白质Western印迹法结果 显示,转染TFsiRNA(+)质粒的HepG2细胞其内源性TF蛋白表达水平低于转染TF siRNA( -)质粒和未转染质粒的表达水平。(3) Transwell体外侵袭实验结果 显示,转染TF siRNA(+)质粒的HepG2穿膜细胞数[(14±10)个]少于转染TF siRNA（-）质粒的HepG2穿膜细胞数[(128±18)个],经t检验比较,两组差异有统计学意义（P＜0.05）。这提示应用RNA干扰技术抑制肿瘤细胞TF表达可以使HepG2细胞侵袭转移能力显著下降。结论 TF与肝癌细胞的侵袭转移能力密切相关,应用RNA干扰技术抑制其表达可以明显降低细胞HepG2体外侵袭转移能力。     

miR-202通过降低肝癌细胞ROCK1表达抑制其迁移和侵袭

目的：研究微小RNA-202（miR-202）对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响,并探讨其可能的分子机制。方法：通过实时定量PCR检测Hep3B、Huh7及HCCLM3人肝癌细胞和LO2人正常肝细胞中miR-202的表达水平。以miR-202表达水平最低的HCCLM3细胞为转染对象,转染miR-202模拟物或空白对照miRNA,以miR-202表达水平最高的Hep3B细胞为转染对象,转染miR-202抑制物或阴性对照miRNA,并利用实时定量PCR验证转染效率。采用Transwell迁移和侵袭实验检测过表达和敲低miR-202对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响。生物信息学网站检索并应用荧光素酶报告基因实验验证miR-202的靶基因。实时定量PCR和Western blot检测miR-202靶基因的表达水平。结果：与正常肝细胞LO2相比,miR-202在肝癌细胞的表达水平显著降低;HCCLM3细胞转染miR-202模拟物后,细胞miR-202的表达水平显著增加;过表达miR-202后,HCCLM3细胞的迁移和侵袭能力显著降低;Hep3B细胞转染miR-202抑制物后,细胞miR-202的表达水平显著降低;敲低miR-202后,Hep3B细胞的迁移和侵袭能力显著增强;生物信息学检索及荧光素酶报告基因证明ROCK1基因为miR-202的靶基因。过表达miR-202可明显降低肝癌细胞中ROCK1基因的表达,而敲低miR-202可明显增加肝癌细胞中ROCK1基因的表达。结论：miR-202在肝癌细胞中低表达,miR-202通过抑制ROCK1的表达抑制肝癌细胞的迁移和侵袭。     

甲基莲心碱联合mdr 1shRNA对K562/A02 细胞mdr 1/P gp表达的影响

目的：探讨甲基莲心碱(Nef)联合mdr 1shRNA表达的载体对K562/A02细胞mdr 1/ P gp表达的影响。 方法：采用MTT方法比较Nef,mdr 1shRNA单独或二者联合对K562/A02细胞增殖的抑制作用;采用RT PCR和Western印迹法检测mdr 1/P gp的表达。 结果：Nef与mdr 1shRNA联合组对K562/A02细胞的抑制率显著高于mdr 1shRNA,Nef单独处理组(P＜0.01);联合组对K562/A02细胞mdr 1/P gp表达的抑制作用强于单独处理组（P＜0.01）。 结论：甲基莲心碱能增强mdr 1shRNA表达载体对K562/A02细胞的增殖抑制作用及mdr 1/P gp表达的抑制作用,逆转mdr 1基因编码蛋白P gp介导的多药耐药。