HSF1抑制热应激所致RAW264.7巨噬细胞凋亡

目的:探讨热休克因子1(heat shock factor 1,HSF1)对热应激所致Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡的影响。方法:采用热应激(4 2.5℃±0.5℃)处理稳定表达小鼠HSF1基因的Raw2 6 4.7巨噬细胞1h,3 7℃分别恢复6,9,1 2,2 4 h,采用流式细胞术,hoechst3 3 2 5 8染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果:流式细胞术结果显示,热应激后对照组(转空载体)细胞凋亡核百分率较热应激前明显升高,9 h达峰值(约为6 0%),此时荧光染色可见3 0%的细胞出现核固缩,凋亡小体等典型的凋亡形态学改变;并于热应激后6,9,1 2 h均能检测到清晰的DNA梯状条带。与转空载体对照组相比,HSF1过表达能显著降低热应激所致凋亡及明显抑制DNA的断裂。结论:HSF1可以抑制热应激所致的Raw2 6 4.7巨噬细胞凋亡。     

过表达KLF4对RAW264.7巨噬细胞ABCA1表达和胆固醇蓄积的影响

目的观察KLF4过表达对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)胆固醇蓄积的影响及对ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)表达的影响。方法构建KLF4过表达的RAW264.7细胞株。将细胞分为三组:对照组、ox-LDL组、KLF4过表达+ox-LDL组,后两组加入终浓度为30 μg/mL的ox-LDL处理24 h。分别运用油红O染色观察细胞质脂滴变化,高效液相色谱法（HPLC）检测细胞内总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)含量,Western blot法检测各组细胞ABCA1及KLF4蛋白表达。结果泡沫细胞模型组的细胞内存在大量的红色脂滴,KLF4及ABCA1蛋白表达及胆固醇含量较对照组升高;KLF4过表达细胞经ox-LDL处理后,细胞内脂滴较模型组明显减少,胆固醇含量下降,ABCA1蛋白表达进一步升高。结论KLF4可上调巨噬细胞ABCA1的表达,抑制ox-LDL诱导的RAW264.7巨噬细胞胆固醇蓄积。     

体外瞬时转染野生型PTEN过表达对乳腺癌MCF-7细胞的影响

目的：研究野生型FTEN基因过表达对乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用。方法：应用携带野生型FTEN的真核表达载体pEGFP-C1-FTEN，以脂质体介导的方法体外瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞，利用流式细胞术检测抗凋亡蛋白bcl-2的表达，通过相差显微镜、细胞生长曲线、MTT、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法，观察FTEN基因过表达对MCF-7细胞生物学特性的影响。结果：荧光显微镜观察、免疫细胞化学和RT-PCR检测证实，转柒后MCF-7细胞中PTEN呈高水平表达；相差显微镜观察到MCF-7／FTEN细胞出现典型的凋亡形态学改变；细胞生长曲线低平；流式细胞检测显示，G-期细胞比例比空载体组增加14.79％，并出现凋亡峰；DNA琼脂糖凝胶电泳可见梯状条带；同时还检测到转染PTEN后细胞bcl-2表达下降。结论：外源性FTEN基因过表达可显著抑制MCF-7细胞的周期进程并诱导细胞凋亡。     

紫花牡荆素通过线粒体凋亡途径诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡

目的:研究紫花牡荆素诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡作用,并探讨其诱导凋亡机制.方法:体外培养人宫颈癌HeLa细胞.细胞凋亡ELISA试剂盒检测HeLa细胞组蛋白/DNA碎片;碘化丙啶染色流式细胞术定量分析Sub-G1细胞百分率;DNA琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形条带.caspase比色试剂盒检测caspase-3/-9活性;Rh123探针染色FCM检测线粒体膜电位;Western blot检测细胞色素c、Bax、Bcl-2、Bcl-xL和XIAP蛋白的表达.结果:不同浓度的CAS处理48h后,HeLa细胞组蛋白/DNA碎片增加、Sub-G1细胞百分率显著增高、DNA琼脂糖凝胶电泳法观察到典型的DNA梯形条带;CAS处理组caspase-3/-9活性明显升高、线粒体膜电位降低、细胞色素c、Bax显著升高,而Bcl-xL和XIAP蛋白表达水平降低.结论:CAS通过线粒体凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡.     

半边莲通过钙信号诱导肝癌细胞凋亡的实验研究

观察半边莲通过影响胞内游离钙离子浓度进而诱导人肝癌细胞HepG2发生凋亡。通过荧光分光光度法检测胞内游离钙离子浓度,并采用AO-EB荧光染色、流式细胞术和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果显示半边莲可提高HepG2细胞胞内游离钙离子浓度,与对照组相比,差异显著(P<0.01),且荧光染色、流式细胞术和DNA琼脂糖凝胶电泳的结果表明经半边莲处理过的肝癌细胞出现典型的凋亡特征。结论:半边莲可通过提高肝癌细胞胞内游离钙离子浓度诱导癌细胞凋亡     

量子点CdTe对RAW264.7细胞凋亡和脂质过氧化水平的影响

目的 探讨量子点CdTe对小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7凋亡和脂质过氧化水平的影响.方法 用MTT法检测细胞增殖状况;MDA、NO含量及SOD活性表示脂质过氧化水平;Hoechst染色进行细胞形态学观察;流式细胞术及琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡.结果 量子点处理组细胞的增殖能力明显受到抑制,NO、MDA含量及SOD活性显著上升,细胞凋亡百分率明显增高,并能检测到清晰的"梯状条带",与阴性对照组比较差异有显著性(P＜0.05).结论 量子点CdTe能引起RAW264.7细胞凋亡和脂质过氧化反应发生.     

腺病毒介导AMP激活的蛋白激酶的过表达诱导肝星状细胞株LX2凋亡

目的 探讨在肝星状细胞株LX2中,用腺病毒介导AMP激活的蛋白激酶(AMPK)过表达对细胞凋亡的影响.方法 病毒感染细胞后,用免疫印记的方法检测外源基因的表达;流式细胞仪分析细胞的凋亡;琼脂糖凝胶电泳检测DNA梯状条带,免疫印迹检测caspase-3以及Bcl-2、Bax表达的变化.结果 免疫印迹结果显示表达组成性激活的AMPK的腺病毒感染LX2细胞72 h,AMPK过表达.过表达AMPK的LX2细胞用流式细胞仪检测到有凋亡的亚二倍体峰出现;DNA断裂出现梯状条带,casepase-3被激活,Bcl-2在LX2中是低表达的,而Bax表达水平升高.结论 腺病毒介导AMPK的过表达可以诱导LX2细胞发生凋亡,其可能的机制之一是上调促凋亡基因bax的表达.     

Daxx在介导ox-LDL诱导巨噬细胞凋亡中的作用

目的 初步探讨Daxx在氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导巨噬细胞凋亡中的作用.方法 通过MTT比色法检测ox-LDL对小鼠源性巨噬细胞(RAW264.7)细胞生长的影响:用AO/EB染色、流式细胞仪和DNA断裂片段分析研究ox-LDL诱导的细胞凋亡.eal time PCR检测细胞内Daxx mRNA的表达情况.结果 ox-LDL能抑制RAW264.7细胞的生长,抑制作用呈剂量-效应关系;50 mg/L ox-LDL处理RAW 264.7细胞48 h后,AO/EB染色细胞呈凋亡特征性改变,并且DNA断裂片段分析显示电泳图出现梯形条带;流式细胞检测显示相同时间不同浓度ox-LDL(0、12.5、25、50、75 mg/L)处理RAW264.7细胞48 h和相同浓度不同时间(50 mg/L,48、72 h)处理细胞,细胞凋亡率逐渐升高;Real time PCR结果表明不同时间和不同浓度的ox-LDL处理RAW264.7细胞后,Daxx mRNA表达水平呈时间和浓度依赖性增加,其中50 mg/L ox-LDL处理细胞48 h组Daxx mRNA表达最高.结论 ox-LDL有诱导RAW264.7巨噬细胞凋亡的作用,其机制可能与Daxx表达增高从而启动细胞凋亡有关.     

KLF4对人胃癌细胞株SGC-7901体外增殖及迁移侵袭能力的影响

目的探讨Krüppel样因子4(KLF4)对人胃癌SGC-7901细胞株增殖和迁移侵袭能力的影响。方法以人胃癌SGC-7901细胞株为研究对象,脂质体法转染pcDNA3.1IE-KLF4重组质粒并建立KLF4稳定过表达细胞株,以未转染KLF4基因和转染空质粒载体的胃癌细胞株为对照。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测KLF4mRNA的表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测转染后SGC-7901细胞的增殖情况,划痕试验和Transwell小室检测胃癌细胞迁移侵袭能力。结果与未转染组和空载体组比较,转染组细胞KLF4mRNA表达明显,MTT法检测显示48h和72h细胞增殖抑制明显(P<0.05),24、48、72h的增殖抑制率分别为12.90%、23.85%、25.56%。未转染组、空载体组和转染组细胞迁移率分别为(78.15±4.86)%、(73.75±4.03)%、(60.84±5.56)%,侵袭穿膜细胞数分别为(163.53±13.95)个、(158.07±12.54)个、(73.87±8.70)个,转染组细胞迁移率和侵袭穿膜细胞数较对照组均降低(P<0.05)。结论 KLF4对胃癌SGC-7901细胞的体外增殖及迁移侵袭具有抑制作用。     

自噬基因Beclin1对上皮性卵巢癌细胞SKOV3生长的抑制作用

目的 观察自噬基因Beclin 1在人卵巢癌细胞株SKOV3中过表达对肿瘤细胞在体内、体外生长活性的影响.方法 脂质体法将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染人卵巢癌细胞株SKOV3,MTT法分析外源性Beclin1过表达对SKOV3增殖的影响,流式细胞仪检测转染后肿瘤细胞的凋亡及自噬情况.将重组质粒pcDNA3.1/Beclin1转染SKOV3细胞后,接种到裸鼠皮下,观察体内致瘤活性及生长情况;免疫组化检测瘤组织Beclin1蛋白的表达.结果 Beclin 1在SKOV3中的过表达后抑制肿瘤细胞在体外的生长,抑制率为58.68%;pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3的凋亡率为(21.26±3.89)%,高于空质粒pcDNA3.1转染组和未转染组,差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测pcDNA3.1/Beclin1转染后SKOV3细胞MDC平均荧光强度高于pcDNA3.1转染组和未转染组.重组质粒pcDNA3.1/Beclin1使SKOV3细胞在裸鼠体内成瘤时间延长,瘤体体积及质量明显小于空质粒组和空白对照组,抑瘤率为50.27%.结论 自噬基因Beclin1在人卵巢癌细胞SKOV3中过表达可抑制SKOV3在体内、体外的增殖,针对自噬基因Beclin1的卵巢癌基因治疗可能具有可行性.     

不同变异位点的HIV-1 vpr重组真核表达载体对转染细胞凋亡作用的观察祆

目的 观察不同的人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的vpr基因变异株致宿主细胞凋亡作用的区别,及其可能的机制.方法 14个带有不同变异位点的中国感染者HIV-1 vpr基因片断,其PCR产物纯化后经Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,以pcDNA3.1(+)真核表达质粒连接转化实验,将重组质粒用脂质体瞬时转染至HeLa细胞,G418筛选后收获细胞.RT-PCR检测目的 基因mRNA水平的表达,荧光染色在显微镜下观察Hoeschst凋亡细胞并计算凋亡率,DNA琼脂糖电泳观察各转染细胞凋亡条带,膜联蛋白V-FITC流式细胞检测各株细胞凋亡率,并比较各株细胞的半胱酸蛋白水解酶3活性差别.结果 14个vpr基因片段转染HeLa细胞后,发现有第70、85、86或94位变异的vpr转染细胞Hoeschst染色凋亡率和半胱酸蛋白水解酶3活性检测(分别为0.1225,0.1675,0.1975,0.1575和11.356,8.021,14.6875,10.521)较无这些变异的保守序列vpr转染细胞(0.355和182.4875)为低,DNA琼脂糖电泳法和膜联蛋白细胞凋亡检测也提示同样的规律;第1～7号重组质粒(均为vprAE亚型)的致细胞凋亡能力也明显小于第8～14号重组质粒(vpr B,AB,C和C/BC亚型).结论 首次观察到有第70、85、86或94位变异的HIV-1 vpr序列,其致HeLa细胞凋亡的能力低于无这些位点变异的保守序列,AE亚型诱导宿主细胞凋亡能力低于其他亚型,其机制之一与半胱酸蛋白水解酶3途径激活降低有关.     

外源性FHIT基因对人胶质瘤细胞U87增殖与凋亡的影响

目的探讨外源性脆性组氨酸三联体(FHIT)基因的表达对胶质瘤细胞系U87增殖和凋亡作用的影响。方法通过脂质体介导将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B-FHIT和空载体质粒pcDNA3.1/myc-His(-)B分别转染胶质瘤细胞系U87。实验细胞分U87-FHIT组(转染FHIT基因的U87细胞)、U87-vector组(转染空载体质粒的U87细胞)和空白对照组(亲本U87细胞)。Western blot和免疫荧光染色检测外源性FHIT蛋白的表达;MTT法及流式细胞术观察转染前后细胞生长特性的变化。结果U87-FHIT组细胞的生长抑制率和凋亡率明显高于U87-vector组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论外源性FHIT基因表达能诱导U87细胞凋亡,抑制其生长,具有抗胶质瘤作用。     

过表达热休克因子1突变体对RAW264.7细胞的影响

目的建立稳定转染热休克因子1(HSF1)显性正性和显性负性突变体的细胞株,并探讨HSF1突变体过表达对细胞生长的影响。方法用脂质体将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HSF1+和pcDNA3.1(+)-HSF1-分别转染RAW264.7细胞株,G418筛选阳性单克隆,Western blot鉴定高表达的克隆,流式细胞术检测稳定转染HSF1突变体的细胞与转空载体细胞的生长及凋亡情况。结果建立了稳定表达HSF1显性正性或显性负性突变体的细胞株,并发现转染HSF1突变体细胞能影响正常细胞增殖,但不引起细胞凋亡。结论HSF1突变体能影响RAW264.7细胞正常生长周期。     

腺病毒介导的ING4基因抑制胃癌细胞生长及其分子机制

目的:研究肿瘤生长抑制基因4(inhibitor of growth family4,ING4)体外对胃癌细胞SGC-7901的生长抑制及其分子机制。方法:将携带有人ING4基因的重组复制缺陷型腺病毒(Ad-hING4)感染胃癌细胞SGC-7901,RT-PCR法检测腺病毒介导的外源性hING4基因的转录,MTT法检测hING4基因对SGC-7901细胞的生长抑制作用,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察hING4基因诱导SGC-7901细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪(FACS)检测hING-4基因诱导胃癌细胞SGC-7901的凋亡率及细胞周期改变,免疫细胞化学分析凋亡相关因子bcl-2和bax的改变。结果:Ad-hING4感染SGC-7901细胞后,RT-PCR结果提示有hING4目的基因的转录,该基因表达可以显著抑制SGC-7901细胞的生长,诱导S期减少、G2/M期阻滞和凋亡,hING4基因能使SGC-7901细胞中bcl-2的表达下调和bax的表达上调。结论:重组腺病毒Ad-hING4对胃癌细胞SGC-7901具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用,其作用机制可能与下调bcl-2基因和上调bax基因的表达有关。     

细胞自噬对紫杉醇诱导宫颈癌CaSki细胞死亡的影响

目的：通过对自噬基因Beclin1的表达调节来观察细胞自噬对紫杉醇诱导人宫颈癌CaSki细胞株死亡的影响,并探讨在该过程中自噬与凋亡之间的相互作用及关系。方法：利用脂质体法将Beclin1的过表达质粒pcDNA3.1-Beclin1和RNA干扰质粒pSUPER-Beclin1分别体外转染CaSki细胞并筛选稳定表达株后,电镜下观察细胞内自噬囊泡的形成,Western 印迹检测转染前后Beclin1与LC3蛋白的表达变化。上述细胞株经紫杉醇作用后MTT法检测细胞增殖情况的改变,流式细胞仪检测自噬细胞与凋亡细胞的百分率。结果：在Beclin1基因过度表达的CaSki细胞株中,电镜观察到细胞内存在大量的自噬囊泡;Beclin1与LC3蛋白的表达在pcDNA3.1-Beclin1转染细胞株中被上调。MTT法检测提示Beclin1过表达细胞株存活细胞明显少于未转染对照细胞株。流式细胞仪检测提示经紫杉醇作用后与空白对照组比较,Beclin1过表达组自噬细胞与凋亡细胞百分率均有明显增加,其中凋亡增加尤其明显;而Beclin1干扰组自噬细胞与凋亡细胞百分率均有所减少。结论：在紫杉醇对宫颈癌CaSki细胞株的杀伤过程中细胞自噬与凋亡均发挥了作用,在Beclin1基因过度表达的CaSki细胞株中可通过增加紫杉醇诱导的细胞凋亡来增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用。     

Ad-hIL-24体外诱导喉癌细胞Hep-2的凋亡作用

目的研究腺病毒介导的人白细胞介素-24（hIL-24）基因选择性诱导喉癌细胞Hep-2凋亡的作用。方法将携带有hIL-24基因的重组复制缺陷型腺病毒（Ad-hIL-24）感染喉癌细胞Hep-2,并以人胚肺成纤维细胞WI-38为对照,采用RT-PCR法检测Hep-2、WI-38细胞中外源性hIL-24基因表达;采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）及流式细胞术等方法检测细胞的生长和凋亡情况。结果腺病毒介导的hIL-24基因能在Hep-2细胞和WI-38细胞中表达;MTT法显示Ad-hIL-24能明显抑制喉癌细胞Hep-2的生长,LSCM观察结果表明Ad-hIL-24能促进喉癌细胞Hep-2凋亡,流式细胞术显示Hep-2细胞经Ad-hIL-24感染48h后凋亡率为18.47%,G2/M期细胞百分比为38.9%,显著高于PBS组、Ad-GFP组和WI-38细胞,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论Ad-hIL-24能抑制喉癌细胞Hep-2生长和诱导Hep-2细胞凋亡,但对正常细胞无毒性作用。     

Apoptosis of keloid-derived fibroblasts induced by Fas gene transfection]

OBJECTIVE: To observe the effect of Fas gene transfection on the apoptosis of keloid-derived fibroblasts. METHODS: The full-length cDNA of Fas was inserted into the multicloning site of the expression vector pcDNA-3.1 by molecular cloning technique, and the recombinant plasmid was transfected into the keloid-derived fibroblasts via lipofectin. Fas monoclonal antibody (mAb) was used to induce the apoptosis of the cells, which was evaluated with HE staining, DNA agarose gel electrophoresis and flow cytometry. RESULTS: The expression plasmid pcDNA-3.1-Fas was constructed successfully. Fas mAb induced apoptosis of these fibroblasts transfected with Fas gene, with the typical features of fibroblast apoptosis observed in the treated cells (e.g. typical apoptotic cell nuclei, DNA ladder and high apoptosis rate as determined by flow cytometer), but not in the control cells. CONCLUSION: Blockage of upstream apoptosis pathway in keloid-derived fibroblasts is due to nonfunction of Fas protein, and mutation of Fas gene may be the pathogenesis of keloids.     

过表达ODC抑制氧化应激诱导大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。