一种比格犬雌二醇β受体剪切异构体的克隆和序列分析

目的 分析比格犬下丘脑-垂体-性腺轴,雌二醇β受体剪切异构体的存在情况.方法 根据NCBI数据库上的比格犬雌二醇受体的基因序列,设计两对特异性引物,以比格犬的卵巢、子宫、下丘脑和垂体的总RNA为模板进行反转录,并利用两对特异性引物扩增比格犬雌二醇受体的基因,对其中的主要条带进行克隆测序.结果 获得了比格犬雌二醇受体的全长cDNA序列,对主要条带进行克隆测序的结果表明,该序列是一种比格犬雌二醇受体的剪切异构体.结论 比格犬雌二醇β受体剪切异构体与小鼠和人的组成有较大的不同,需要进一步系统研究.     

比格犬雌激素受体β的原核表达、纯化及鉴定

目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方法 Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA,RT-PCR获得cDNA,以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物,扩增ERβ保守区基因编码序列(16-496 bp),连接原核表达载体pMAL-p5x,筛选、鉴定阳性克隆并测序.将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,再转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经经麦芽糖亲和树脂(Amylom Resin)亲和层析分离纯化,并对纯化的融合蛋白进行鉴定.结果 构建了pMAL-p5x/ER(a)480重组质粒,在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为60 000,与预期结果一致;优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件:分别在0.2％葡萄糖,100 μg/ml Ampcillin,0.1mmol/L IPTG 37℃培养5h或在0.2％葡萄糖,50 μg/ml Ampcillin,0.2mmol/L IPTG 37℃培养3h,融合蛋白表达效果比较好.结论 构建了pMAL-p5x/ERβ480原核表达重组质粒,获得了比格犬MBP-ERβ融合蛋白,为犬种属特异性ERβ多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础.     

比格犬雌激素受体β四个剪接异构体的发现

目的在比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上筛查雌激素受体13的剪接异构体。方法针对ERβmRNACDS序列的八个外显子,两两外显子依次组合设计引物,运用PCR法,以比格犬下丘脑、垂体、卵巢、子宫组织cDNA为模板扩增相应序列,测序后在NCBI网站比对,确定是目的基因后,用DNAMAN软件比对分析及手工校对,获得ERβ的剪接异构体。结果获得到了比格犬ERβ的四个剪接异构体,分别是第4外显子完整缺失的ERβ剪接异构体（缺失300bp）,部分第4与部分第5外显子组合缺失的两个组合型缺失的ERβ剪接异构体（各缺失334bp,265bp）,以及第七外显子完整缺失的ERβ剪接异构体（缺失181bp）。第4外显子完整缺失的剪接异构体和第7外显子完整缺失的剪接异构体获得了全长编码序列,另两个剪接异构体为部分编码序列。结论研究获得了比格犬ERβ的四个剪接异构体,为后续研究其在比格犬生殖调控中的作用机制打下了基础。     

比格犬卵巢子宫内雌激素受体ERα、ERβ的免疫组织化学定位研究

目的 研究雌激素受体α, β在比格犬卵巢及子宫内的定位。 方法 采用免疫组化SP法DAB显色结合BCIP/NBT及AEC显色检测ERα、ERβ在比格犬子宫及卵巢内的表达。 结果 比格犬ERα主要表达于卵泡颗粒细胞、卵巢间质腺腺上皮细胞及子宫内膜腺体腺上皮细胞胞核内,胞质内仅有少量表达，而在卵泡膜内膜的间质细胞，腺体周围的基质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞的胞核内有少量表达。而ERβ则以相同的组织特异性主要表达于上述组织细胞的胞质内,在胞核内有微弱表达。ERα 表达于膜黄体细胞的胞核内，而在黄体颗粒细胞胞核与胞质内均有表达。而ERβ则仍特异表达于不同生理阶段黄体细胞的胞质内。BCIP/NBT与AEC双染未见ERα、ERβ在子宫内有明显的共表达现象。结论 比格犬ERα、ERβ 在子宫与卵巢组织内定位不同，ERα主要定位于胞核，在胞质内有微弱表达，而ERβ主要定位于胞质，在胞核内有零星表达。     

比格犬雌激素β受体RNA干扰实验细胞及PCR检测引物的筛选

目的筛选用于比格犬ERβ基因RNA干扰实验的细胞和检测所用引物。方法根据比格犬ERβ氨基末端区域和DNA结合区设计三对引物,用阳性质粒筛选最佳引物应用于RNA干扰效果检测,并利用293T、Hela和vero细胞的cDNA验证该引物的特异性。对这三种细胞内人ERβ基因的存在情况也进行了检测。结果经过三次重复性实验之后,结果显示引物C36684扩增效率高,且没有非特异条带,该引物对293T、Hela和vero细胞cDNA扩增时同样没有非特异性条带,但293T细胞中存在人的ERβ基因。结论引物C36684用于检测RNA干扰效率,而Hela细胞则作为RNA干扰实验的细胞工具。     

比格犬ERβ剪切异构体ERβ419沉默表达载体的构建及筛选

目的构建最有效的慢病毒介导RNAi干扰序列,未来将应用于比格犬ERβ419的未知生物学功能的探索。方法模拟比格犬ERβ419靶细胞筛选针对目的基因mRNA设计的最佳干扰序列实验,通过qRT-PCR和Western Blot技术筛选最佳沉默表达载体序列。结果qRT-PCR结果显示,ERβ419-shRNA1(P0.01)和ERβ419-shRNA3(P0.01)的差异表达极显著,Western Blot结果与qRT-PCR结果一致,ERβ419-shRNA3的干扰效果最佳。结论 ERβ419-shRNA3最有效地抑制了目的基因的表达,未来将应用于探索比格犬ERβ419未知生物学功能对比格犬生殖系统影响的研究,并进而预防和治疗比格犬繁殖机能障碍性疾病。     

比格犬雌激素β受体RNA干扰实验细胞及PCR检测引物的筛选

目的 筛选用于比格犬ERβ基因RNA干扰实验的细胞和检测所用引物。方法 根据比格犬ERβ氨基末端区域和DNA结合区设计三对引物,用阳性质粒筛选最佳引物应用于RNA干扰效果检测,并利用293T、Hela和vero细胞的cDNA验证该引物的特异性。对这三种细胞内人ERβ基因的存在情况也进行了检测。结果 经过三次重复性实验之后,结果显示引物C36684扩增效率高,且没有非特异条带,该引物对293T、Hela和vero细胞cDNA扩增时同样没有非特异性条带,但293T细胞中存在人的ERβ基因。结论 引物C36684用于检测RNA干扰效率,而Hela细胞则作为RNA干扰实验的细胞工具。     

荧光定量RCR检测比格犬雌激素β受体mRNA在间情期与发情期表达量的差异

目的对比格犬发情期与间情期ERβ基因在性腺组织器官的变化状况进行荧光定量,明确ERβ基因在发情期与间情期下丘脑-垂体-性腺轴上的表达量差异情况,为深入研究比格犬发情机制提供基础。方法作为调控生殖的关键基因,ERβ基因位于比格犬下丘脑-垂体-性腺轴上,因此分别取处于发情期和间情期的比格犬,提取下丘脑、垂体、卵巢和子宫的RNA,反转录后对ERβ基因mRNA的表达量进行荧光定量PCR检测。结果间情期比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内ERβ基因mRNA的表达量分别是发情期比格犬卵巢、子宫、垂体、下丘脑内ERβ基因mRNA表达量的0.35倍、0.17倍、0.44倍、0.43倍。结论 ERβ基因在处于发情期的比格犬下丘脑-垂体-性腺轴内表达量均上调。     

一种新型的比格犬固定器

目的研制一种新型的比格犬固定器。方法根据比格犬的体型大小设计出一种不锈钢固定架,将犬俯卧于固定架上,四肢穿过支撑体重的布垫糸在下方的横框上。结果此方法可长时间同时固定多条非麻醉状态的比格犬,适合于静脉推注或滴注给药以及多时间点静脉采血等操作。结论为比格犬研制出一种结构简单、操作方便的固定器。     

比格犬埃立克体人工感染的病理学观察

目的观察比格犬人工感染埃立克体后的病理学变化。方法用常规病理学方法,对6只人工感染埃立克体的比格犬进行病理解剖学和病理组织学观察。结果剖检见主要器官和皮下出血、淤血,脾、肝肿胀;病理组织学变化的主要特征是淋巴结的严重水肿,脾、肝、肺和肾的血管内及肝血管周围存在浆细胞和淋巴细胞灶性增生,皮肤表皮层变薄、皮肤皮脂腺腺泡上皮和毛囊变性坏死。结论比格犬人工感染埃立克体后剖检和病理组织学变化与文献基本吻合,但剖检病变更为明显,这可能与中国病原株的致病性不同有关。     

乳腺癌雌激素受体mRNA的变异剪切与Tamoxifen耐受

目的 通过检测不同来源乳腺癌雌激素受体mRNA水平的正常剪切和变异剪切,初步探讨人类乳腺癌tamoxifen耐受和雌激素受体mRNA变异剪切的关系。方法 利用RT-PCR技术检测临床正常乳腺、乳腺癌和乳腺癌tamoxifen耐受组织中雌激素受体mRNA的剪切条带,并予以比较,结果 正常乳腺、乳腺癌和乳腺癌tamoxifen耐受组织中均有雌激素受体mRNA的正常剪切和变异剪切,其中1250bp的变异剪切条带最多见,但乳腺癌tamoxifen耐受组织中的变异剪切条带较多,而乳腺癌MCF-7细胞系不存在变异剪切。结论 tamoxifen长期作用于乳腺癌组织可导致雌激素受体mRNA的多种变异剪切并影响雌激素受体的功能。     

人乳腺癌雌激素受体α、β的表达

目的:了解雌激素受体α(ERα)、β(ERβ)mRNA在人乳腺癌中的表达状况.方法:选取125例乳腺癌患者为实验组,130例性别、年龄相匹配的健康体检者为对照组,实验组中53例为绝经患者,72例为未绝经患者;对照组中51例为绝经患者,79例为未绝经患者.采用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测实验组和对照组ERα、ERβmRNA的表达并进行基因测序.结果:与对照组相比,实验组ERαmRNA表达增强,而ERβmRNA表达减弱(P＜0.05);实验组绝经前后ERαmRNA、ERβmRNA表达有差异(P＜0.05).结论:ERα、ERβ在乳腺中的不同表达状况可能与乳腺癌有关;可能与月经水平对二者的调节有一定影响.对ER受体ERα、ERβ的研究,可能有助于对乳腺癌生物学特性判断和治疗.     

比格犬埃立克体病实验模型及治疗研究

目的研究了比格犬埃立克体病实验模型及盐酸强力酶素对犬埃立克体病的疗效。方法用犬埃立克体病病犬血白细胞静脉注射比格犬,对其临床症状、病原学、血液生理生化指标变化、病理学变化进行了观察,并应用盐酸多西环素进行疗效试验。结果与结论成功建立了比格犬埃立克体病实验模型,并证实了盐酸多西环素对犬埃立克体病的疗效是确定的。     

雌激素受体β1和β2在乳腺癌组织中的表达及其意义

目的探讨乳腺癌组织中雌激素受体(ER)β1、ERβ2基因和蛋白的表达及其临床意义。方法应用Western印迹法检测乳腺癌组织、癌旁组织及正常组织中ERβ1和ERβ2蛋白的表达情况,荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测ERβ1、ERβ2mRNA的表达情况。结果乳腺癌组织和癌旁组织中的ERβ1mRNA、ERβ2mRNA检出率与蛋白检出率相同。乳腺癌组织中的ERβ1蛋白检出率显著低于癌旁组织(P=0.029)和正常组织(P=0.029);乳腺癌组织中的ERβ1蛋白表达量为47.06±8.94,显著低于癌旁组织中的55.33±9.59及正常组织中的54.47±9.65(P=0.009及0.019)。乳腺癌组织中的ERβ1mRNA检出率显著低于癌旁组织(P=0.029);乳腺癌组织中的ERβ1mRNA表达量为0.026±0.014,显著低于癌旁组织中的0.041±0.020(P=0.015)。乳腺癌组织中,ERβ1mRNA与蛋白表达量的相关系数为0.635(P=0.008),ERβ2mRNA与蛋白表达量的相关系数为0.714(P=0.004);癌旁组织中,ERβ1mRNA与蛋白表达量的相关系数为0.506(P=0.012),ERβ2mRNA与蛋白表达量的相关系数为0.926(P=0.000),ERβ1mRNA、ERβ2mRNA与蛋白水平之间存在相关性。结论全长野生型ERβ1可能是避免乳腺癌发生的保护性因子,ERβ1有助对乳腺癌预后的预测。     

雌激素β受体及其与卵巢癌的关系研究进展

雌激素(estrogen,E)是一种类固醇性激素,通过与其特异性受体相结合进而调节一系列基因的表达而发挥生物学效应.人体内雌激素靶器官[1]和一些非靶器官恶性肿瘤细胞中存在雌激素受体(estrogen receptor,ER),目前有证据显示雌激素通过其特异性受体ERα和ERβ在介导卵巢癌发生中起着重要作用.在原发卵巢上皮性肿瘤培养细胞中,ERα mRNA的表达较正常卵巢上皮培养细胞高10倍,ERα/ERβ是正常卵巢上皮细胞的2倍[2],但是90%来源于上皮的恶性卵巢肿瘤表达低水平的ERα,而卵巢癌细胞ERβ的高表达可抑制肿瘤细胞的增生和浸润,同时加速肿瘤细胞的凋亡.对ER的深入研究有助于了解其在生理功能调节和某些重大疾病发生及治疗中的作用,本文重点综述了ERβ与卵巢癌关系的研究进展.     

雌激素受体α和β及其变异体在子宫内膜癌组织的表达

目的:比较雌激素受体两种亚型α和β及其变异体在子宫内膜癌组织的表达,验证子宫内膜癌发生的双受体学说,为寻找新的有治疗和/或预防子宫内膜癌的雌激素拮抗剂提供理论依据.方法:用RT-PCR、DNA测序和限制性内切酶酶切鉴定等方法分析子宫内膜癌和正常子宫内膜组织雌激素受体及其变异体mRNA的表达.结果:(1) 与正常子宫内膜组织比较,子宫内膜癌组织ERα及其变异体与ERβ的共表达率分别为34%和67%,差异有显著性,(P<0. 05);(2) ERαm RNA在子宫内膜癌组织的相对表达水平为0.880±0.168,ERβmRNA为0.553±0.108 ,差异显著 (P<0.05);(3) 在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织中未检测出ERβ变异体.(4)野生型( wild-type, wt)ERαmRNA表达水平较各类△ERαmRNA表达高(P<0.05或0.01);(5) ERα变异体的类型包括△2ER α单独缺失、△4ERα和△5ERα的联合缺失、△7ERα的单独缺失以及△7ERα和部分△8ERα的联合缺失 ,在正常子宫内膜和子宫内膜癌组织无区别.结论:(1) 子宫内膜癌的发生受wt ERβ和wt ERα及其变异体的共调节;(2) 子宫内膜癌组织ERα的表达水平明显高于ERβ,而且ERα有4种剪接形式,推测子宫内膜癌的发生与ERα关系更密切.     

雌激素受体β在乳腺癌中的表达价值分析

目的探讨分析ERβ在乳腺癌中的调控作用。方法选取2010年1月-2012年1月杭州市余杭区妇幼保健院收治的70例乳腺癌患者作为实验对象,从其乳腺组织中获取标本,对样本ERβ表达和相关临床参数进行检测。结果 70例样本中ERβ阳性表达率为65.7%。ERβ的表达和患者肿瘤大小、浸润范围、月经情况、临床分期、p 53等表达无明显关系(P>0.05);与病理分型、Ki 67有相关性(P<0.05)。结论 ERβ和乳腺癌细胞增殖存在一定关系。     

雌激素受体β在不同乳腺组织中的表达及意义

目的探讨不同乳腺组织类型中雌激素受体β亚型（ERβ）的表达及意义。方法用免疫组化方法检测86例乳腺浸润性癌、原位癌、乳腺腺病和正常乳腺组织中的ERβ表达。结果ERβ主要表达于导管和小叶上皮细胞核。正常乳腺组织和乳腺腺病组织与乳腺浸润性癌和原位癌的ERβ表达比较有统计学差异（2=4.57,P〈0.05）。结论ERβ在不同的乳腺组织类型表达有差异,为进一步研究ERβ在乳腺癌发生及治疗中的作用提供了基础。     

雌激素受体α和β在人正常乳腺组织中的表达及意义

目的：观察雌激素受体α（ERα）和β (ERβ)在人正常乳腺组织细胞中的定位,为探讨ERα和ERβ与乳腺组织生长发育的关系奠定基础。方法：应用免疫组织化学的方法,检测16例在加拿大拉瓦尔大学附属医院接受乳房缩小成形术患者的正常乳腺组织的ERα和ERβ阳性表达率及分布情况。结果：ERα在小叶上皮细胞和导管上皮细胞的细胞核内检测到,在小叶和小叶内导管分布于上皮细胞的内层,在小叶间导管分布于上皮细胞的外层。ERβ在小叶上皮细胞和导管上皮细胞的细胞核内检测到,但是ERβ在上皮细胞中的分布并无规律,而且在细胞浆内也可以检测到弱到中等强度的染色。同时,在一些间质细胞、血管内皮细胞和淋巴细胞亦出现染色情况。ERβ在乳腺上皮细胞中阳性百分数明显高于ERα的阳性百分数,两者比较差异有显著性（t=29.789,P<0.01）。同时ERβ的阳性表达率明显高于ERα的阳性表达率,两者比较差异有显著性（χ²=8.127,P＜0.05）。结论：雌激素受体各亚型在人正常乳腺组织中有着不同的分布特点,ERβ的广泛分布暗示着ERβ可能是乳腺组织中占优势的雌激素受体。     

雌激素受体β基因多态性与帕金森病的相关性

目的 探讨中国汉族人群雌激素受体(ER)β基因Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ酶切多态性与帕金森病(PD)和帕金森病痴呆(PDD)的相关性.方法 采用病例-对照研究和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性.方法,对115例PD患者(包括26例PDD)和116名健康对照进行ERl3基因多态性分析,经卡方检验,分析各基因型、等位基因频率与PD、PDD患病的相关性.结果 (1)ERl3基因Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ的酶切多态性在PD组和对照组问差异无统计学意义(均P>0.05).(2)PDD组与对照组相比,Erβ基因的Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ的酶切多态性差异也无统计学意义(均P>0.05).结论 Erβ基因AluⅠ、Rsa Ⅰ的酶切多态性不影响PD和PDD的患病风险.