VEGF干扰慢病毒载体的构建及其在MHCC97L细胞中的表达

目的构建VEGF基因RNA干扰（RNAi）慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人VEGF基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组（MHCC97-200）、阴性对照组（MHCC97-NEGA）和空白对照组（MHCC97-空白）中VEGF的表达情况,确定其干扰VEGF表达的有效性。结果测序证实慢VEGF基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,VEGF基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 VEGF基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。     

慢病毒载体介导的shRNA对小鼠T细胞CD28基因表达的影响

目的探讨编码针对小鼠CD28的短发卡状RNA（short hairpin RNA,shRNA）的慢病毒载体对小鼠T细胞CD28基因表达的影响。方法设计并合成3对靶向小鼠CD28的特异性干扰序列和1对非特异性干扰序列,亚克隆入慢病毒载体pLB中,构建出重组慢病毒干扰质粒,行PCR鉴定并进一步测序证实。分别将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293FT细胞,生产慢病毒颗粒,并依据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平检测病毒滴度。慢病毒感染小鼠脾淋巴细胞,实时荧光定量RT-PCR和Western blot技术分别从mRNA水平和蛋白水平检测CD28的表达。结果PCR鉴定及测序结果证实4种重组慢病毒质粒均构建成功,重组慢病毒滴度均达1×1011U/L。感染T细胞后,CD28基因mRNA和蛋白表达量均有明显下降。结论成功构建了CD28 shRNA慢病毒载体,可有效下调小鼠T细胞CD28基因的表达,其为进一步研究体内沉默CD28基因控制移植物抗宿主病奠定了基础。     

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的 构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系.为PRb-3基因功能研究奠定基础.方法 设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体.通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体.利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系.结果 成功构建PRL-3 pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L.RT-PCR、Western blotting结果 表明,克隆1 PRL-3mRNA及蛋白显著降低.结论 成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系.     

MMP-9基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒载体。方法针对小鼠MMP-9基因序列,利用公用网站按照RNAi序列设计原则,设计RNAi靶点序列,并合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体连接产生短发卡RNA慢病毒载体,用插入鉴定引物进行PCR鉴定阳性克隆并测序,应用Western blot在293T细胞中鉴定MMP-9表达的下调作用。结果PCR鉴定和DNA测序结果显示合成的含MMP-9 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确;构建的MMP-9RNAi慢病毒载体能够抑制MMP-9的表达。结论应用基因工程技术,成功构建了小鼠MMP-9基因RNAi慢病毒载体,为应用于在体基因治疗创造了条件。     

人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的 构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础.方法 利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序.得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体.在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系.结果 成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml.荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低.结论 成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础.     

shRNA-PAX6慢病毒载体构建及其对胶质瘤U251细胞增殖的影响

目的 构建shRNA-PAX6慢病毒载体并观察其对胶质瘤U251细胞增殖的影响.方法 根据文献报道的PAX6靶点序列,设计两条PAX6基因的siRNA靶点干扰序列,引物退火形成带粘性末端的双链,与经BamH I、EcoR I双酶切后线性化的慢病毒载体进行连接、转化,构建shRNA-PAX6慢病毒重组载体,再经菌落PCR及测序鉴定重组载体;在293T细胞中包装病毒,将包装后的shRNA-PAX6慢病毒重组载体感染U251细胞.Real-time PCR检测PAX6 mRNA的表达水平,Western blot检测PAX6蛋白的表达,MTT法检测U251细胞增殖.结果 慢病毒载体pLKD-CMV-G&NR-U6-shRNA经双酶切后可见线性化的8208 bp大片段,菌落PCR及测序鉴定证实shRNA-PAX6慢病毒重组载体构建成功,构建的shRNA-PAX6慢病毒载体在293T细胞完成包装,测得慢病毒滴度为6.73×108TU/mL;Real-time PCR结果显示,沉默PAX6的表达可见U251细胞PAX6 mRNA表达水平明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);Western blot结果显示,PAX6蛋白表达亦明显低于正常对照组及慢病毒空载体组(P<0.05);MTT结果显示,与正常对照组及慢病毒空载体组细胞比较,感染shRNA-PAX6慢病毒重组载体组的细胞,细胞增殖能力明显增强(P<0.05).结论 成功构建人PAX6基因的shRNA-PAX6慢病毒重组载体,沉默PAX6基因的表达,U251细胞的增殖能力增强.     

人乳头状瘤病毒16型E6基因短发夹结构RNA慢病毒载体的构建及鉴定

目的以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）16型E6基因为靶点,构建小发夹状RNA（small hairpin RNA,shRNA）慢病毒载体.方法将HPV 16E6基因的特异性序列,应用基因重组技术插入到包含U6启动子及绿色荧光蛋白（GFP）报告基因的慢病毒载体pGCL-GFP中.重组质粒命名为pGCL-GFP-HPV16-E,测序鉴定后与慢病毒包装质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0通过lipofectamine 2000共转染293T细胞,病毒液根据绿色荧光蛋白（GFP）表达水平测定滴度.结果 PCR扩增和测序结果证实HPV16 E6 shRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液,测定滴度为2×109 TU/mL.结论应用基因重组技术等方法,可成功构建HPV16 E6 shRNA慢病毒载体.     

人GLUT3基因RNA干扰病毒载体的构建与鉴定

目的：筛选出人GLUT3基因有效的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,并构建出慢病毒RNAi载体。方法：根据GLUT3基因mRNA序列设计合成siRNA片段4个,分别定向克隆至pLV-shRNA载体上,并将构建的质粒转染HeLa细胞,运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测GLUT3mRNA的表达量验证其干扰效果。筛选出其中有效的质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞进行包装,收获并浓缩重组慢病毒颗粒,测定病毒颗粒滴度后,将病毒感染U251胶质瘤细胞以测定感染慢病毒干扰载体后胶质瘤细胞内GLUT3的表达情况。结果：重组RNAi质粒pLV-shRNA-GLUT3-1,pLV-shRNA-GLUT3-2,pLV-shRNA-GLUT3-3,pLV-shRNA- GLUT3-4经测序证实质粒载体构建成功;4个干扰质粒在HeLa细胞中均可以明显抑制GLUT3-mRNA的表达。pLV-shRNA-GLUT3可以在293T细胞中成功包装。收集293T细胞分泌的病毒上清浓缩后测定病毒颗粒LV-GLUT3滴度为1.5×109 TU/mL。与感染阴性对照慢病毒颗粒(0.3641±0.044)相比,胶质瘤U251细胞感染慢病毒颗粒LV- GLUT3后,GLUT3蛋白相对表达明显降低(0.108±0.016,t=16.267,P<0.001)。结论：成功构建了人GLUT3基因有效的慢病毒RNAi载体,为进一步研究GLUT3的生物学功能奠定了基础。     

PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定

目的构建靶向PIK3CA（P110α）基因的RNA干扰慢病毒载体。方法针对PIK3CA—mRNA（NM_006218）设计4个RNA干扰靶点序列和一个阴性对照靶点,构建慢病毒转移质粒pGCL—GFP。构建成功的RNA干扰质粒与PIK3CA表达质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观测转染效果,Western Blot检测PIK3CA蛋白表达,筛选出干扰效果最好的RNA干扰质粒。将该质粒与两种辅助包装原件载体质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒并检测其滴度。结果4个靶点和阴性对照靶点的RNA干扰质粒均构建成功;通过Westem Blot检测获得最有效干扰靶点,并成功包装成滴度为2×10^8TU／ml的慢病毒。结论成功构建可供感染的PIK3CA基因RNA干扰慢病毒载体,为进一步研究PIK3CA功能和用慢病毒进行卵巢癌基因治疗奠定了基础。     

特异性针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒载体的构建

目的 以小鼠VEGFa基因为靶基因，构建携带短发夹状干扰RNA(siRNA)的慢病毒载体。方法 设计并合成三对包含靶序列和一对针对无关序列的互补寡核苷酸链，克隆到pRNAT-U6.2/Lenti质粒；从小鼠NIH/3T3细胞扩增、纯化VEGFa cDNA，构建pCDNA-VEGF质粒；实验分6组，pCDNA-VEGF质粒或/和siRNA慢病毒质粒共转染NIH/3T3细胞，筛选最有效siRNA慢病毒表达质粒；将筛选siRNA慢病毒表达质粒和pRNAT-Negative质粒与慢病毒包装质粒混合物混合，共转染293T细胞，48h后收集上清。结果成功构建针对小鼠VEGFa基因的siRNA慢病毒质粒和质粒pCDNA-VEGF；慢病毒质粒有效抑制pCDNA-VEGF质粒增加NIH/3T3细胞VEGFa表达水平，pRNAT-siRNA3抑制作用最明显，VEGFa mRNA和蛋白表达分别下降80.0%和66.3%；纯化慢病毒滴度均为1×108ifu/mL。结论 成功设计、筛选、生产针对小鼠VEGFa基因沉默的特异性siRNA慢病毒。