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相似文献
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1.
目的探讨重组反义波形蛋白cDNA逆转录病毒重组质粒对体外培养损伤的星形胶质细胞(astrocyte,AST)波形蛋白(vimentin)表达的影响.方法采用体外培养AST划伤模型,设实验组及对照组,通过免疫荧光、RT-PCR、Western blot等方法,研究反义波形蛋白逆转录病毒感染对损伤AST波形蛋白表达的影响.结果反义波形蛋白逆转录病毒使损伤AST生长抑制,突起回缩,波形蛋白mRNA及蛋白水平表达降低.结论反义波形蛋白可有效抑制体外培养损伤AST的生长及其波形蛋白的表达.  相似文献   

2.
TH基因修饰的中脑星形胶质细胞的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的 体外构建酪氨酸羟化酶(TH)基因修饰的中脑星形胶质细胞,为进行帕金森病(PD)的转基因细胞治疗奠定基础。方法 应用逆转录病毒表达载体将鼠TH基因转入逆转录病毒包装细胞PA317,通过G418抗性筛选,获取高滴度产毒PA317/pN2ATH细胞株,以其产生的病毒上清感染鼠中脑星形胶质细胞,继续培养7~9d后,免疫组化检测细胞TH表达。结果获得了高滴度产毒PA317/pN2ATH细胞,并且转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞成功表达TH。结论转染pN2ATH的中脑星形胶质细胞可以有效表达TH,为将其应用于PD基因治疗实验研究提供了基础。  相似文献   

3.
目的构建在肝癌细胞中特异性高表达的重组逆转录病毒载体,观察其对体外培养肝癌细胞生物学行为的影响。方法应用DNA重组技术将α-甲胎蛋白増强子(AFE)核心区DNA与单纯性疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因融合,反向插入逆转录病毒载体pLXSN,重组体命名为pL/TK/AFE/SN;经PA317细胞包装、G418筛选、病毒滴度测定,挑选滴度高的抗性克隆细胞株扩增培养,收获病毒上清,感染体外培养的Hap3B肝癌细胞和Hela宫颈癌细胞。用Southernblot、Northernblot检测转染细胞的DNA、mRNA,以羟甲基无环鸟苷(GCV)对细胞的杀伤毒性检测外源基因在转染细胞中的表达。结果酶切及Southernblot证实插入pL/TK/AFE/SN的反义AFE/TK基因大小、方向及克隆位点正确。达到一定的产病毒滴度。Northernblot分析显示Hep3B肝癌细胞有TK基因mRNA水平表达;应用GCV后,导入反义AFE/TK基因的Hep3B肝癌细胞生长明显受抑制(P<0.01)。结论成功构建了含反义AFE/TK基因的重组逆转录病毒载体并包装出具有感染能力的假型逆转录病毒;重组载体所含的反义AFP増强子能调控外源性TK基因特异地在Hep3B肝癌细胞中高表达。  相似文献   

4.
目的:了解反义乙型肝炎病毒(HBV)基因转移、表达的抗HBV作用。方法:BamH Ⅰ酶切HBV质粒获取1504bp前C/C基因片段,将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR构建了正、反义前C/C重组体。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317,G418筛选获取抗性细胞及假逆转录病毒。RT-PCR检测了反义HBV基因表达的反义RNA。将重组假逆转录病毒感染2.2.15细胞,ELISA及斑点杂交法分别检测被感染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA。结果:反义前C/C重组逆转录病毒载体在细胞内能转录HBV反义RNA。反义前C/C重组假病毒感染的2.2.15细胞HBsAg、HBEAg的合成分别降低了55.5%、78%;HBV DNA水平也明显低于空白对照组。该抑制具有一定特异性。增加假病毒感染次数在一定范围内能提高抑制作用。正义假逆转录病毒感染对2.2.15细胞HBV DNA水平及抗原合成无影响。结论:逆转录病毒载体介导反义HBV基因转移表达的反义RNA能抑制HBV复制及抗原合成,具有潜在应用价值。  相似文献   

5.
目的:分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段,构建重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体,并探讨其意义。方法:设计2对PCR引物,分别在上下游引物中引进BamHI和EoRI位点,以胰腺癌细胞株BxPC-3基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子1及侧翼序列,并采用重组DNA技术将目的基因插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中,并经菌液PCR和限制性内切酶酶切鉴定。结果:K—ras基因外显子1及侧翼序列已成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论:LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—raS目的基因外显子1方便可行,可用于重组反义K—ras癌基因逆转录病毒载体的构建。  相似文献   

6.
目的:建立分泌重组人糖皮质激素β受体cDNA的逆转录病毒的细胞系。方法:脂质体介导含人糖皮质激素β受体正义和反义全长cDNA的重组逆病毒质粒分别转染包装细胞PA317,经G418筛选抗性克隆。结果:细胞培养上清液的RT-PCR联合序列分析表明G418抗性PA317细胞克隆能稳定合成并分泌相应的重组病毒颗粒;NIH3T3细胞测定的正、反义cDNA重组病毒滴度分别为2×105 CFU/ml和1.8×105 CFU/ml。结论:成功建立了能分别产生重组hGRβ正义和反义cDNA逆转录病毒的高滴度细胞系,为后续研究工作打下坚实基础。  相似文献   

7.
目的 利用α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)基因重组反义和正义逆转录病毒载体,探讨α-SMA逆转录病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的影响。方法 用含α-平滑肌肌动蛋白cDNA,重组反义和正义逆转录病毒载体,并感染培养的瘢痕和皮肤成纤维细胞,进行α-SMA在蛋白水平表达等的研究,观察瘢痕与皮肤成纤维细胞形态学与功能的变化。结果 反义α-SMA逆转录病毒抑制了瘢痕成纤维细胞的增殖,细胞形态变小;α-SMA在瘢痕与皮肤成纤维细胞表达降低,并随着作用时间延长,效果更明显;正义α-SMA逆转录病毒则具有相反的作用,促进α-SMA的表达。结论 α-SMA重组病毒对瘢痕与皮肤成纤维细胞的形态、生长、细胞功能均有影响。  相似文献   

8.
目的:构建人白细胞介素2(hIL-2)逆转录病毒载体及包装细胞。方法:用基因重组法将hIL-2cDNA与pLNCX重组成正义和反义LNCIL-2基因。用磷酸钙-甘油法及感染法将LNCIL-2基因转入PA317包装细胞内。所得克隆A8的hIL-2分泌量,DNA、RNA分别用ELISA、Southern印迹和Northern杂交法分析。结果:A8分泌的hIL-2量为8.4ng·(24h·106细胞)1,hIL-2基因完整地整合到转导细胞基因组内并有hIL-2mRNA表达,细胞上清内病毒滴度为106·CFU·ml1。结论:本研究成功地构建编码hIL-2的逆转录病毒载体,并筛选出能产生病毒粒子、分泌hIL-2的包装细胞。  相似文献   

9.
目的:构建 mIL-12重组逆转录病毒载体。方法:将 mIL-12 DNA克隆到载体pLEGFP,用该重组质粒转染PA317包装细胞获得重组逆转录病毒。结果:重组质粒pLEGFP-mIL12酶切及PCR产物在2 290 bp区域见强荧光条带与mIL-12基因大小相符;转染PA317细胞后的上清感染NIH3T3细胞后,经共聚焦显微镜能观察到融合蛋白的表达。结论:包装细胞上清中有含mIL-12 DNA的重组逆转录病毒,mIL-12重组逆转录病毒可感染NIH3T3细胞并在细胞中进行有效的复制。  相似文献   

10.
目的 构建重组病毒载体,将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞,提高细胞增殖及分泌基质能力,维持表型,延缓老化。方法 应用基因工程技术,构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体。分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增,获得假病毒上清液,经浓缩纯化后转染靶细胞结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体,其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月。结论 通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞,延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌,获得组织工程所需要的大量种子细胞,为组织工程构建奠定了基础。  相似文献   

11.
星形胶质细胞对损伤反应的体外实验研究   总被引:5,自引:1,他引:4  
目的:研究体外星形胶质细胞(Ast)反应性胶质化的发生、发展过程与规律。方法:体外分离培养Ast,利用划伤的方法,建立Ast对损伤反应的实验模型,通过形态学观察、RT-PCR、免疫细胞化学、原位杂交及图像分析等方法,研究体外Ast对损伤的反应及规律。结果:损伤体外培养的Ast后,观察到反应性胶质化的典型特征,表现为Ast胞体肥大、突变增粗、延长,GFAP免疫细胞化学染色增强;原位杂交、RT-PCR分析表明,GFAPmRNA表达显著提高。上述变化在伤后1d即可见到,5-7d达到高峰。结论:体外分离培养的Ast对损伤表现出活跃的反应,呈现出典型的反应性胶质化特征,其发生、发展过程与规律类似于在体情况下的Ast反应。  相似文献   

12.
目的观察电针对体外培养星形胶质细胞(Astrocyte,Ast)机械性损伤后反应性胶质化的影响。方法取新生3d龄SD大鼠的大脑皮层进行Ast原代培养,取第三、四代细胞制作细胞机械性损伤模型,电针刺激,用倒置相差显微镜及免疫细胞化学荧光染色观察细胞生长增殖,细胞形态及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达的变化。结果模型组Ast机械性损伤后,细胞增生,体积变大,GFAP表达增强。电针组较模型组细胞增生减少,细胞体积变化不大,GFAP表达较弱。结论电针刺激可以抑制体外培养Ast机械性损伤后的增生,降低细胞内GFAP的表达,即电针可以抑制Ast的反应性胶质化。  相似文献   

13.
人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:克隆人类p27^kip1基因,构建其正、反义真核表达质粒。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术,从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列,通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3.1真核表达载体上,构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果:通过酶切鉴定及测序分析证实,本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论:本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒,为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。  相似文献   

14.
反义VEGF165真核表达载体的构建和表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
吴景文  章翔  费舟  高大宽  屈延  粱景文  刘先珍 《医学争鸣》2000,21(10):1174-1177
目的 进行抗血管生成治疗人脑胶质瘤实验,构建和鉴定携带人反义VEGF165基因的真核表达载体。方法 将VEGF165cDNA反向克隆入pcDNA3,构建CMV启动子控制的真核表达载体pcDNA-AVEGF165,用酶切鉴定结果;应用该载体转染人脑胶质瘤细胞SHG44,G418筛选阳性克隆;Western blot和免疫组化检测转染前、后瘤细胞的VEGF表达。检测转染前、后瘤细胞的生物学性状。结果 获得反向构建的pcDNA-AVECF165真核表达载体,VEGF165反义RNA阻断了SHG44细胞的VEGF表达,该细胞生物学性状不受外源基因的表达影响。结论 成功构建的反义VEGF165真核表达载体,为人脑胶质瘤的反义基因治疗提供了必要的条件。  相似文献   

15.
Astrocytes play a major role in the reactive processes in response to neuronal injuries in the brain. Excessive gliosis is detrimental and can contribute to neuronal damage. CDS1 (TAPA), a member of the tetraspanin family of proteins, is upregulated by astrocytes after traumatic injury to the rat central nervous system (CNS). To further understand the role of CD81 in the inhibition of astrocytes, we analyzed the effects of a CD81 antibody, on cultured rat astrocytes. The results indicated that the effect worked in a dose-dependent manner with certain dosage range. It, however, reached a dosage equilibrium at a high dosage. Furthermore, anti-CD81 antibody remarkably inhibited the proliferation of astrocytes after incubation with astrocytes for different periods of time and the effect presented a time-dependent fashion. However, anti-CDS1 antibody substantially inhibited the proliferation of astrocytes at low density and middle density but slightly inhibited the proliferation of as- trocytes at high density, suggesting that the effect was positively correlated with the proliferative ability of astrocytes. Finally, the cell cycle of astrocytes exposured to anti-CD81 antibody was arrested in S phase at the initial stage and at G0/GI phase over time. These findings indicated that CD81 exert significant inhibitory effect, dose-dependently and time-dependently, on the proliferation of astrocytes and the effect is positively correlated with the proliferative capability of astrocytes.  相似文献   

16.
研究背景:胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)表达增高是星形胶质细胞对中枢神经系统外伤后的自发反应,是胶质细胞活化、增殖以及胶质瘢痕形成的重要原因。该过程的调控机制目前并不完全清楚。本研究旨在探讨ephrinB2对小鼠脑外伤胶质瘢痕形成的影响。 研究方法:利用Loxp/Cre基因敲除系统,培养在中枢神经系统星形细胞中不表达ephrinB2的条件性基因敲除小鼠(KO),基因敲除的结果采用DNA-PCR技术以及大脑切片后免疫组织化学ephrinB2/GFAP共染色方法证明。随机选取基因敲除小鼠及野生型小鼠各12只,制备改良的控制性皮层撞击小鼠闭合性颅脑损伤模型,利用尼氏染色、GFAP免疫荧光强度测量,比较损伤后28天,基因敲除小鼠与野生型小鼠脑萎缩程度以及GFAP表达程度的不同。 研究结果:本研究成功建立了在胶质细胞中特异性敲除ephrinB2的转基因小鼠种系。该基因敲除小鼠在中枢神经系统星形胶质细胞中特异性不表达ephrinB2。 通过组织病例学研究发现创伤后28天时,基因敲除小鼠和野生型小鼠均呈现不同程度的脑损伤和脑萎缩。损伤灶局部出现胶质瘢痕形成以及神经元丢失。免疫组化染色后的组织学形态分析发现,ephrinB2基因敲除小鼠损伤侧大脑半球及海马的萎缩程度均显著低于野生型小鼠(p<0.05)。基因敲除小鼠损伤侧的GFAP免疫荧光强度亦显著低于野生型小鼠(p<0.05)。 研究结论:在小鼠胶质细胞特异性敲除ephrinB2基因后,脑损伤后大脑半球GFAP免疫荧光强度以及半球和海马萎缩程度均显著降低。提示酪氨酸激酶配体ephrinB2在小鼠脑创伤修复中是促使胶质瘢痕形成的因素之一。  相似文献   

17.
目的 通过体外培养星形胶质细胞,探讨星形胶质细胞水通道蛋白-9(aquaporin-9,AQP9)对损伤反应的表达变化及其所起的作用.方法 取出生后2 d的Wistar大鼠乳鼠大脑皮层进行星形胶质细胞纯培养,随机分为对照组和损伤组,每组分为1、3、5、7 d共4个时间点,采用划伤的方法建立星形胶质细胞对损伤反应的实验模型,通过形态学观察、免疫细胞化学染色、原位杂交图像分析等方法研究星形胶质细胞对损伤的反应及AQP9的表达变化.结果 星形胶质细胞受损后,形态学上表现为胞体肥大、突起增粗,呈反应性胶质化的典型特征;胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色增强;原位杂交分析表明,AQP9 mRNA表达在损伤后1 d显著增高,第3天至第5天达到高峰,与对照组相比,差异有统计学意义(P〈0.05).结论 体外培养的星形胶质细胞对损伤表现为反应性胶质化、AQP9 mRNA表达增强,提示AQP9可能直接参与损伤性脑水肿的形成.  相似文献   

18.
目的:应用p16(MTS1)反义寡核苷酸抑制转染p16逆转录病毒载体后外源性p16基因的表达,减弱p16表达对包装细胞的生长抑制作用.方法:合成p16 cDNA起始密码子区的反义寡核苷酸和正义寡核苷酸,加入筛选的转染p16逆转录病毒载体的包装细胞培养液中,记录各孔中出现细胞克隆的时间和数量,测量各形成细胞克隆的病毒上清滴度.Western blot 检测反义寡核苷酸对外源性P16蛋白表达的影响.MTT法检测加入反义寡核苷酸后对转染的包装细胞生长的影响.结果:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达.加入反义寡核苷酸的包装细胞形成细胞克隆的时间提前,克隆数量和滴度都高于对照组.结论:p16(MTS1)反义寡核苷酸可以抑制外源性p16基因的表达,促进p16逆转录病毒载体转染的包装细胞的生长并提高病毒滴度.  相似文献   

19.
目的观察大鼠创伤性脑损伤(TBI)后不同时间点脑损伤区周围脑组织脑脂结合蛋白(BLBP)的表达变化。方法采用大鼠颅脑液压损伤模型,在伤后1、3、7、14 d用Western blot检测损伤区周围脑组织BLBP的表达,用免疫荧光双标法检测BLBP和波形蛋白。结果 TBI后1 d,BLBP含量显著下降,后逐渐上升,至伤后7 d达到高峰,伤后14 d又急剧下降(均P〈0.01)。BLBP和波形蛋白双标阳性细胞主要分布在损伤区周围皮质及损伤侧胼胝体,损伤侧皮质阳性细胞大多为反应性星形胶质细胞形态;损伤侧胼胝体阳性细胞基本呈放射状胶质细胞(RGCs)形态。结论 TBI后损伤区周围脑组织RGCs样细胞可能与皮质神经再生和神经功能恢复有关。  相似文献   

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