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1.
目的 构建卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体.方法 体外培养卡片介苗菌株并提取基因组DNA,扩增Hsp16.3基因两侧序列5′-Hsp16.3和3'-Hsp16.3,分别插入到pKO质粒载体预定位点中构建Hsp16.3基因置换型打靶载体,筛选并进行PCR、双酶切鉴定及测序鉴定.结果 构建的卡介苗菌株Hsp16.3基因打靶载体,经PCR、双酶切鉴定及测序证实pKO质粒中的2个插入片段为所需目的基因.结论 成功构建出卡介苗菌株Hsp 16.3基因打靶载体. 相似文献
2.
目的:对牙釉质丝氨酸蛋白酶(EMSP1)基因
进行体外扩增,构建基因打靶载体,利用基因打靶技术建立转基因动物模型,研究EMSP1生理功能和病理学意义。方法:根据EMSP1的DNA序列,采用Oligo 6.0软件设计两对引物,以129品系小鼠基因组DNA为模板,分别扩增长为5 000 bp和1 700 bp片段作为同源长短臂。将其分插入通用型基因敲除载体pSSC-9的正向筛选基因neo两侧,用PCR方法、限制性酶切DNA
序列分析进行鉴定。结果:采用双酶切鉴定,阳性重组克隆分别切出5000 bp和1700 bp片段,表明长短臂已克隆于载体中。DNA序列分析表明,成功构建
EMSP1基因打靶载体pSSC-9- EMSP1。结论:成功构建小鼠EMSP1基因打靶载体。 相似文献
3.
目的 构建用于小鼠锌指蛋白基因Znf230条件基因打靶的载体,为产生Znf230基因敲除的小鼠模型准备条件.方法 设计和合成引物,经PCR从小鼠的基因组中扩增出5'同源臂、3'同源臂及锚定序列,长度分别为4,4,1 kb的片段,反向插入pBS载体的neo基因的两侧,从而构建小鼠Znf230条件基因打靶载体Znf230-pBS(5).结果 经过限制性内切酶及DNA测序鉴定,证实该条件基因打靶载体含有的同源序列与Genebank公布的基因序列一致,表明载体构建成功.结论 PCR技术和定向克隆技术是构建条件基因打靶载体简单而可靠的方法.运用该技术可获得小鼠锌指蛋白基因Znf230的条件基因打靶载体. 相似文献
4.
弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体构建方法探讨 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 探讨构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的方法,为建立基因敲除弓形虫基因突变株打下基础。方法 用PCR方法扩增弓形虫SAG3基因同源序列,将所获得的1.53kb和2.81kb序列连接克隆插入TUB5/CAT质粒中,构建置换型打靶载体,采用PCR扩增、酶切分析鉴定。结果 将SAG3基因中1.53kb和2.81kb两个同源序列分别插入TUB5/CAT质粒中,构建了弓形虫RH株5’SAG3-TUB5/CAT-3’SAG3置换型载体,经鉴定所获得的打靶载体结构准确。结论 建立了弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体,并获得了弓形虫RH株SAG3基因置换型打靶载体,为分析弓形虫基因功能提供了可行的方法。 相似文献
5.
目的构建和鉴定微小隐孢子虫CP15/60—23基因重组卡介苗。方法以pET-30a-CP15/60-23质粒为模板,PCR扩增CP15/60—23基因片段,然后克隆至TA载体;通过酶切、测序鉴定后,将CP15/60—23基因片段用限制性内切酶切下定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMV262结核杆菌热休克蛋白(HSP)启动子下游,构建重组质粒pMV262-CP15/60—23,用电穿孔将该质粒导入野生卡介苗(BCG—WT)构建微小隐孢子虫CP15/60—23基因重组卡介苗。结果扩增出792bp的微小隐孢子虫CP15/60—23基因片段,成功构建pMV262-CP15/60—23质粒,并通过PCR扩增和提取质粒、酶切等表明该质粒被正确导入BCG—WT中。结论成功构建微小隐孢子虫CP15/60—23基因重组卡介苗,为研究隐孢子虫病新的防治方法打下了基础。 相似文献
6.
prk基因非融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建prk基因的非融合表达载体,并诱导表达。方法:PCR扩增并回收prk基因片段,将其与亚克隆载体pMDl8-T重组,通过蓝/白斑筛选、酶谱分析和序列测定鉴定出重组质粒,然后从该重组质粒上切下prk基因片段,再克隆至非融合表达载体pBV220中,酶谱分析鉴定出正向重组质粒,诱导含有正向重组质粒的宿主菌表达蛋白,提取全菌总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果:成功构建并筛选出pBV220正向重组质粒,经热诱导表达,得到一可溶性的相对分子质量为65ku的重组蛋白。结论:pBV220-prk表达载体的成功构建和表达,说明扩增所得的基因具有正确的阅读框架,使获得天然Prk蛋白成为可能.为进一步研究prk基因的生物学功能奠定了基础。 相似文献
7.
目的 分离、鉴定卡介苗fbpA基因 ,探求新型结核病疫苗的候选保护性抗原。方法 用PCR法从卡介苗基因组DNA中分离fbpA基因 ,克隆在pUCm -T载体上 ,用单菌落PCR扩增快速鉴定DNA片段后再用HindⅢ酶切进一步鉴定。结果 单菌落PCR和HindⅢ酶切鉴定证实fbpA基因与预期大小一致。结论 用单菌落PCR扩增快速鉴定克隆在pUCm -T载体上的fbpA基因是一种简便、经济的方法。fbpA基因的分离为进一步分析其功能与探索新型结核病疫苗奠定了基础。 相似文献
8.
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结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT—6基因重组穿梭质粒的构建与鉴定 总被引:3,自引:0,他引:3
目的:构建分泌性表达结核分枝杆菌抗原蛋白ESAT-6的重组卡介苗,方法:分别以卡介苗(BCG)和结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板。通过PCR扩增得到的117bp的BCGα抗原(α-Ag)信号肽序列和285bp的结核杆菌esat-6基因序列,将esat-6基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒载体pMV261重组,得到重组质粒pME,再将BCGα-Ag信号肽序列克隆至pME中,得到重组质粒pSME。结果:质粒pSME用双酶切和PCR扩增鉴定证实,克隆基因α-Ag信号肽序列和esat-6正确插入载体pMV261,结论:重组质粒pSME可望在BCG中分泌性表达结核分枝杆菌的免疫保护性抗原蛋白ESAT-6,该质粒的构建成功为改造卡介苗,发展新型结核病疫苗奠定了基础。 相似文献
10.
目的:构建弓形虫RH株表面抗原P30基因的重组表达质粒,为下一步免疫与诊断研究制备高纯度P30重组蛋白奠定基础。方法:自弓形虫RH株感染小鼠腹水中收集速殖子,用酚/氯仿法提取基因组DNA,用PCR法扩增编码P30的基因片段(经电泳切带纯化),定向插入到PQE-30表达质粒中,转化入TG1宿主菌,在含有青霉素的SOB平板上筛选阳性重组子,采用酶切、PCR扩增和DNA序列分析等方法对插入片段进行鉴定。结果:阳性重组质粒PQE30-P30经Sal HindⅢ双酶切下的插片及PCR扩增产物均与原插入的P30基因片段大小一致为976bp,通过序列测定证实插入片段为编码P30的基因片段。结论:成功构建弓形虫表面抗原P30基因的重组质粒PQE30-P30。 相似文献
11.
Ag85a-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定 总被引:2,自引:1,他引:2
目的 构建结核分枝杆菌ag85a-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性或治疗性疫苗.方法 通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85a的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗.结果 通过PCR扩增获得约800 bp的ag85a基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明ag85a基因正确插入到pYUB295质粒中.将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好.pYUB295-ag85a重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明:ag85a-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85a蛋白在卡介苗中分泌表达.结论 成功构建了ag85a-卡介苗重组疫苗. 相似文献
12.
目的 构建小鼠MPI基因的基因打靶载体转染ES细胞 ,构建用于同源重组筛选的对照载体。方法根据计算机分析小鼠MPI基因的基因组序列 ,构建用于同源重组载体的长臂和短臂并且转染小鼠ES细胞 ,经抗性筛选后得到阳性克隆 ,抽提基因组DNA后用PCR的方法进行重组子的初步筛选。结果 成功构建了MPI基因的基因打靶载体并且摸索了用PCR的方法进行重组细胞初步筛选的方法。结论 这个载体的构建为MPI基因功能的研究打下了基础 ,同时用PCR方法进行初步筛选大大减少了Southern杂交的工作量 ;利用实验小鼠来研究印迹基因是非常有效的方法 ,它不仅能了解印迹基因在小鼠生长发育过程中的功能 ,而且进而有助于研究人的相应印迹区。 相似文献
13.
目的:利用Cas9/RNA system gene targeting技术高效构建Vash2基因敲除小鼠模型?方法:根据Vash2基因序列,设计2对Vsah2基因的单链向导RNA(single-guide RNA,sgRNA)引物序列并克隆进入pU57-T7-GDNA载体?利用T7 RNA聚合酶体外转录sgRNA和Cas9 mRNA?将体外转录的gRNA/Cas9 mRNA显微注射入小鼠受精卵,通过PCR和基因测序对Vash2移码突变进行检测和鉴定?繁育Vash2基因敲除小鼠并分析后代突变情况?结果:顺利构建表达sgRNA载体并体外转录,成功将有活性的sgRNA和Cas9 mRNA直接注射入受精卵?基因测序鉴定获得5只F0代初建鼠?选取5号鼠与野生型鼠回交,得到F1代鼠,再相互交配得到F2代鼠?PCR显示F2代鼠Vash2基因移码突变,成功建立Vash2基因敲除小鼠模型并传代繁育? 结论:通过Cas9/RNA systemgene targeting技术可以成功制备Vash2基因敲除鼠模型,是用于Vash2研究的有效工具? 相似文献
14.
小鼠PKD1基因的克隆及打靶载体的构建 总被引:1,自引:1,他引:0
目的:克隆小鼠的多囊肾病1(PKD1)基因,构建PKD1基因的Knockout载体,为产生PKD1基因缺陷小鼠品系准备条件。方法;以正常小鼠基因组DNA为模板,扩增小鼠PKD1基因部分序列为探针,应用噬斑原位杂交技术筛选129SvTer小鼠基因组DNA库,并应用Southern杂交,亚克隆及测序等方法鉴定所得克隆。对克隆到的PKD1基因组DNA片段进行结构分析,选择合适的亚克隆片段,以pTK-N 相似文献
15.
目的 克隆卡介苗(BCG)的热休克蛋白16.3基因(hsp16.3),并在大肠杆菌中表达.方法 利用PCR技术从BCG中扩增hsp16.3基因,并将其克隆到质粒pProEX HTb中,进行测序.将得到的重组表达质粒pProEX HTb-hsp16.3在大肠杆菌BL21中进行表达.结果 成功地克隆了BCG hsp16.3基因.经DNA测序证实,与Gen Bank公布的序列一致.含pProEX HTb- hsp16.3重组质粒的大肠杆菌BL21经诱导后,能够表达相对分子质量约为16KDa的融合蛋白.结论 获得了BCG hsp16.3基因,成功构建原核表达质粒pProEX HTb- hsp16.3,并在大肠杆菌得到高效表达. 相似文献
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目的探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础。方法首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS—rHPRT质粒。然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50bp HPRT基因同源序列的IRES-eGFPCre—Frt/Neo/Frt同源重组片段,最终构建HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。结果PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功。结论成功快速地构建了HPRT基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究。 相似文献
17.
糖皮质激素受体基因片段的克隆和目标载体的构建 总被引:2,自引:2,他引:0
构建针对糖皮质激素受体基因第2外显子的目标载体,为获糖皮质激素受体基因缺陷型胚胎干细胞准备条件。方法通过限制性酶切对DNA片段进行了结构分析,克隆相应DNA片段进行DNA序列测定,利用pTK-Neo质粒框架和同源片段构建载体。 相似文献
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目的:构建针对乙型肝炎病毒x基因(HBx基因)的小干扰RNA (siRNA)重组腺病毒表达载体,并在能表达HBx基因的人肝癌细胞株HepG2中观察其对HBx基因表达的抑制作用.方法:重组腺病毒穿梭载体pShuttle-HBx与骨架载体在大肠杆菌BJ5183中同源重组得到重组腺病毒载体,后者转染HEK293细胞,包装并扩增出病毒颗粒.用获得的病毒感染能表达HBx基因人肝癌细胞株HepG2,收集细胞总RNA和总蛋白,采用RT-PCR和Western Blot方法检测细胞中HBx基因表达的变化.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,证实针对HBx基因的siRNA重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR和Western Blot方法证实,在HepG2细胞中,HBx基因在mRNA和蛋白水平均有降低.结论:腺病毒介导的针对HBx基因的siRNA在体外能够高效、特异地抑制HBx基因的表达. 相似文献