靶向于SW1990细胞K-ras exon 1反义RNA腺病毒的构建

目的:构建靶向于SW1990细胞K-ras exon 1序列的反义RNA腺病毒,观察其对SW1990细胞的增殖和凋亡的影响.方法:将K-ras exon 1 cDNA克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,筛选出反向插入的克隆,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染大肠杆菌BJ5183,同源重组产生腺病毒重组质粒.腺病毒重组质粒转染293细胞进行包装,产生重组腺病毒.腺病毒载体Ad-LacZ转染SW1990细胞,X-gal染色观察感染效率.重组腺病毒感染体外培养的SW1990细胞,MTT法检测SW1990细胞增殖,AnnexinⅤ/PI流式细胞术检测SW1990细胞凋亡.结果:所构建的重组腺病毒PCR扩增出282 bp的目的基因片段;制备出了高滴度重组病毒,CsCl2密度梯度纯化前后病毒滴度分别为7.6×108pfu/ml和5.0×1010 pfu/ml,当MOI=100时对SW1990的感染效率接近100%;重组腺病毒体外转染能抑制SW1990细胞增殖(P＜0.05),转染后4～5 d,抑制效应达到最高峰,抑制率约为40.5%,也能促进SW1990细胞凋亡,转染后72 h,凋亡率为 (22.54±5.38)% (P＜0.01). 结论:成功构建了靶向于SW1990细胞K-ras exon 1序列的反义RNA腺病毒,为进一步探讨胰腺癌以K-ras为靶点的反义基因治疗奠定了基础.     

人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

构建人肺癌细胞Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋交换泵－１（Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋ｅｃｘｈａｎｇｅｒ－１，ＮＨＥ－１）基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制ＮＨＥ－１基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法采用ＰＣＲ技术从人肺癌Ａ５４９细胞基因组中克隆出长为４５４ｂｐ的ＮＨＥ－１基因外显子部分序列，在上、下游引物５’－端带上ＢａｎＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ的多克隆位点。最后对产生的     

子宫内膜良恶性组织中K-ras癌基因的表达

目的:探讨Kras癌基因在子宫内膜良恶性组织中的表达及与子宫内膜癌发生、发展的关系。方法:采用抗生物蛋白链菌素标记(LSAB)法检测33例子宫内膜癌、31例子宫内膜非典型增生、39例子宫内膜单纯型增生及31例正常子宫内膜标本中Kras癌基因的表达。结果:Kras癌基因在正常子宫内膜、单纯型增生、非典型增生及子宫内膜癌中的阳性表达率分别为35.48%、35.90%、41.94%、69.70%,其阳性表达率随着病变程度的加重而升高(r=0.2853,P<0.05),正常子宫内膜及单纯型增生与非典型增生及子宫内膜癌之间差异有统计学意义(P<0.05)。低分化子宫内膜癌中Kras癌基因阳性表达率明显高于中高分化者,Ⅱ、Ⅲ期子宫内膜癌中Kras癌基因阳性表达率明显高于Ⅰ期(P均<0.05)。Kras癌基因阳性表达率与其年龄及绝经情况无关。结论:Kras癌基因在子宫内膜癌发生、发展中起重要的作用,Kras癌基因的检测对于子宫内膜癌早期诊断、估计预后有一定的意义。     

检测胰液和粪便中K-ras和p53基因突变对胰腺癌早期诊断的价值

目的 通过检测胰液、粪便癌基因K－ras和抑癌基因p53的突变,探索早期诊断胰腺癌的手段。方法 1994年至2000年5月住院和门诊患者共201例,正常对照60例,通过聚合酶链反应－限制片段长度多态性（PCR－RFLP）方法检测胰液、粪便K－ras突变,PCR－SSCP方法检测p53突变。结果 胰腺癌患者胰液K－ras突变率为87．8％（36／41）,胰腺良性病变为23．5％（4／17）。粪便K－ras扩增成功率为90．0％（235／261）。胰腺癌患者粪便K－ras突变率为88．0％（66／75）,胰腺良性病变为51．1％（24／47）,正常人粪便K－ras突变率为19．6％（9／46）。胰腺癌胰液细胞p53突变率47．4％（18／38）,胰腺良性疾病为12．5％（2／16）。胰腺癌粪便p53突变率为37．1％（23／62）,慢性胰腺炎为19．1％（4／21）。结论 胰腺癌患者胰液K－ras突变的敏感性、特异性高,可以作为胰腺癌诊断的辅助手段。粪便K－ras结合p53检测可以提高敏感性,在胰腺癌筛选中有潜在的价值,联合血清CA19－9等肿瘤标记物检测有助于提高胰腺癌早期诊断率。     

胰腺癌K-ras基因12密码子突变率的研究

目的阐明中国胰腺癌患者Ｋ－ｒａｓ基因１２密码子突变频率，为临床应用打下基础。方法两轮ＰＣＲ－ＲＦＬＰ技术对３２例石蜡包埋胰腺癌标本和１５例阴性对照作基因分析。结果３２例胰腺癌标本中３０例检测到Ｋ－ｒａｓ基因１２密码子突变，阳性率为９３．８％，而１５例阴性对照无１例检测到突变。结论中国胰腺癌患者Ｋ－ｒａｓ基因１２密码子突变率高达９０％左右，该突变的有无可作为在基因水平上鉴别诊断胰腺癌的一个可靠标志。     

MGMT反义RNA真核表达载体的构建与鉴定

目的：探讨反义RNA逆转胶质瘤细胞耐药的可能性，构建MGMT反义RNA的真核表达载体。方法：以Xho Ⅰ和PvuⅡ双酶切质粒pHM14，回收178bp的片段，定向插入以HpaⅠ和XhoⅠ双酶切pLXSN所获得的线性化载体，构建针对MGMTmRNA5′端的反义表达载体pLaMT5SN；以EcoRⅠ单酶切pHM14，回收779bp的片段，插入以EcoRⅠ单酶切pLXSN并经CIAP去磷酸化的线性载体，构建针对MGMTmRNA全长序列的反义表达载体pLaMTSN。结果：pLaMT5SN经HindⅢ酶切可见370bp的片段；pLaMTSN经PCR扩增证明目的片段反向插入pLXSN，鉴定结果表明构建成功。结论：成功构建了两个MGMT反义RNA的真核表达载体，为研究MGMT反义RNA逆转胶质瘤耐药细胞的耐药表型提供了良好的实验材料。     

K-ras突变基因的克隆及逆转录病毒pEGZ/MCS HA载体的构建

目的 克隆K-ras癌基因，测定其序列及突变类型，构建逆转录病毒表达载体。方法 通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从胰腺癌细胞株中克隆K—ras基因，与T-Vector载体连接后测序。构建含K—ras基因的逆转录病毒载体。结果 胰腺癌细胞株Bxpc-3、Sw1990未及点突变，Patu8988 12位密码子的GGT突变为GTT，13、61位无突变。酶切证明逆转录病毒表达载体构建成功。结论 K-ras癌基因的成功克隆及逆转录病毒表达载体的构建，为胰腺癌的免疫治疗研究奠定了基础。     

癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用

目的:探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用.方法:用Moloney逆转录病毒载体先后将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因转导入小鼠正常卵巢上皮细胞(MOSE),建立表达c-myc或(和)K-ras基因的细胞系,分别称为Myc细胞、Ras细胞、RM细胞,通过细胞增殖试验、裸鼠体内成瘤试验研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变.结果:用携带有c-myc和K-ras基因的重组逆转录病毒感染MOSE后,用RT-PCR和Western blot能分别检测到有相应的c-myc或(和)K-ras mRNA转录以及蛋白的表达;Ras细胞增殖显著快于MOSE和Myc细胞(P＜0.01),RM细胞显著快于Myc细胞(P＜0.05);将Ras和RM细胞腹腔注射于裸鼠体内,有肿瘤形成,免疫组化结果显示瘤组织有K-ras和c-myc蛋白的表达;MOSE细胞和Myc细胞没有肿瘤形成.结论:重组逆转录病毒载体具有高转导效率,突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc不能使MOSE发生恶性转化,但具有协同作用.     

RON基因反义核酸真核表达载体的构建策略

目的 构建RON基因跨膜区段(RONm)的反义核酸真核表达载体。方法 用RT-PCR技术，从人肺癌细胞提取的总RNA克隆RONm eDNA序列。然后酶切鉴定与测序分析得到RONm的T载体，再将RONm反向插入peDNA3．1 中，酶切鉴定得到RONm反义真核表达载体。结果 用RT-PCR亚克隆RONm，测序结果与GenBank的RONm相应序列(X70040)一致，阅读框无改变。构建出正确的RONm反义真核表达载体。结论 成功构建RONm反义核酸真核表达载体，为进一步将RON基因反义核酸作为一种肺癌基因治疗方法的研究打下了分子生物学基础。     

PCR－SSP快速检测胰腺癌石蜡切片中K－ras基因点突变

胰腺癌第１２位点Ｋ－ｒａｓ基因点突变检出率达７２％～１００％，检测其点突变方法有数种。我们采用针对Ｋ－ｒａｓ基因点突变方式设计的引物，对胰腺癌石蜡包埋组织进行多聚酶链反应（ＰＣＲ），产物借助常规电泳即可判定有无Ｋ－ｒａｓ基因突变及突变方式，无需酶切、杂交、放射性及非放射性显影等技术。研究发现：３１例胰腺癌标本有２３例存在Ｋ－ｒａｓ基因点突变，方式分别为ＣＧＴ、ＧＡＴ、ＧＴＴ，而９例正常胰腺组织、１９例胰腺良性疾病、７例胆管癌及４例十二指肠乳头癌均未见Ｋ－ｒａｓ基因突变。该法简便、快速、特异、灵敏，易临床推广应用，可以作为胰腺病变良恶性鉴别的一种新方法。     

结直肠癌K-ras基因的研究进展

K-ras基因在结直肠癌(CRC)发生、发展中均有重要作用,K-ras野生型的CRC患者对西妥昔单抗(C225)敏感,而突变型者不敏感。目前K-ras状态已确定为是否对CRC患者使用C225的标准。CRC的K-ras突变主要发生在第一外显子的12、13位点,原发灶是最常用的检测标本,转移灶及晚期患者的血浆检测也有一定意义。K-ras突变的检测方法很多,目前测序法仍是金标准。     

结直肠癌MICA基因的表达与p53K-ras基因突变的关系研究

目的:分析结直肠癌MICA基因的表达与p53、K-ras基因突变的关系.方法:回顾性分析我院2014年3月至2016年3月收治的66例结直肠癌患者的临床资料,应用半定量PCR-SSCP技术,对癌组织mdr1基因表达量与p53、K-ras进行检测,并分析结直肠癌MICA基因表达与p53、K-ras基因突变间的相互关系.结果:经研究发现,MICA表达与结直肠癌患者肿瘤部位、年龄、性别无相关性(P>0.05).于66例患者中,22例淋巴结转移者的MICA平均表达量明显高于淋巴结未转移者,差异具有统计学意义(P<0.05).8例K-ras、p53基因联合突变者MICA基因平均表达量高于非联合突变者,差异具有显著统计学意义(P<0.05),12例K-ras基因突变者MICA平均表达量稍高于未突变者,但比较差异无统计学意义(P>0.05),16例p53基因突变者MICA平均表达量显著优于p53基因未突变者,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:MICA基因高表达已成为了结直肠癌的关键检测指标,而p53、K-ras基因与其高表达具有相关性.     

逆转录病毒载体介导HBV前C/C反义RNA的体外抗HBV作用

目的：了解反义乙型肝炎病毒(HBV)基因转移、表达的抗HBV作用。方法：BamH Ⅰ酶切HBV质粒获取1504bp前C／C基因片段，将其正、反向插入逆转录病毒载体pDOR构建了正、反义前C／C重组体。将重组体转染逆转录病毒包装细胞PA317，G418筛选获取抗性细胞及假逆转录病毒。RT-PCR检测了反义HBV基因表达的反义RNA。将重组假逆转录病毒感染2．2．15细胞，ELISA及斑点杂交法分别检测被感染细胞培养上清中HBsAg、HBeAg及HBV DNA。结果：反义前C／C重组逆转录病毒载体在细胞内能转录HBV反义RNA。反义前C／C重组假病毒感染的2．2．15细胞HBsAg、HBEAg的合成分别降低了55．5％、78％；HBV DNA水平也明显低于空白对照组。该抑制具有一定特异性。增加假病毒感染次数在一定范围内能提高抑制作用。正义假逆转录病毒感染对2．2．15细胞HBV DNA水平及抗原合成无影响。结论：逆转录病毒载体介导反义HBV基因转移表达的反义RNA能抑制HBV复制及抗原合成，具有潜在应用价值。     

Inhibitary effects of antisense oligonucleotide specific to K-ras point mutation on the target gene expression in human pancreatic carcinoma cells

The prognosis of pancreatic carcinoma is disappointing due to the difficulty of early and accurate diagnosis,low operative resection rate, insensitivity to radiation therapy and chemotherapy. The incidence of pancreatic carcinoma has increased considerably in the past few years, the progress of diagnosis and treatment, however, has not been significantly improved. The overall 5-year survive rate is still as low as 5%-10%, and the improved 5 years survive rate is about 20%-40% after successive Whipple-operation. The early diagnosis is critical to the successful surgical treatment. It depends on the establishment of the new way for that.[第一段]     

结直肠癌患者不同组织中K-ras基因研究

目的 研究结直肠癌患者不同组织中K-ras基因的临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR方法检测患者原发灶组织100例、转移淋巴结组织64例、远处转移灶13例、腺瘤组织19例中K-ras基因突变情况。结果 结直肠癌原发灶、转移淋巴结组织、远处转移灶、腺瘤组织的K-ras基因检出率分别为100%、92.2%、92.3%、89.5%;K-ras基因突变率分别为39.0%、30.5%、33.3%、17.6%。主要突变基因第12编码子34位 G>T, G>A, G>C, 35位 G>A, G>T, G>C;第13编码子 37位 G>C, 38位 G>A等8种基因发生突变。结论 结直肠癌原发灶、转移淋巴结组织、远处转移灶的K-ras基因突变率基本一致, 而腺瘤组织K-ras基因突变率明显低于原发灶、转移淋巴结组织、远处转移灶组织。K-ras基因突变在结直肠癌的发生、发展中起重要作用, 这对结直肠癌的防治有重要的指导意义。     

Epstein-Barr病毒LMP1-exonl反义表达载体对NPC细胞生长的抑制作用

目的　研究EB病毒LMP1反义基因对人鼻咽癌CNE2细胞恶性表型的逆转作用。方法　用反义LMP1DNA的真核表达载体anti—pcDNA3．1—LMP1转染人鼻咽癌细胞CNE2，G418筛选抗性克隆;Western-blot法检测转染前、后瘤细胞的LMP1表达；用MTT法、细胞生长曲线和软琼脂集落形成能力实验观察转染前后细胞体外生长增殖特性。结果建立反义CNE2细胞克隆；转染后LMP1蛋白表达降低；转染后细胞活力和生长速度均有下降，集落形成能力显降低。结论　将反义LMP1真核表达载体导入细胞能成功抑制NPC细胞的生长，逆转其恶性表型。本研究还为鼻咽癌的基因治疗提供了实验依据。