K-ras突变基因的克隆及逆转录病毒pEGZ/MCS HA载体的构建

目的 克隆K-ras癌基因，测定其序列及突变类型，构建逆转录病毒表达载体。方法 通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从胰腺癌细胞株中克隆K—ras基因，与T-Vector载体连接后测序。构建含K—ras基因的逆转录病毒载体。结果 胰腺癌细胞株Bxpc-3、Sw1990未及点突变，Patu8988 12位密码子的GGT突变为GTT，13、61位无突变。酶切证明逆转录病毒表达载体构建成功。结论 K-ras癌基因的成功克隆及逆转录病毒表达载体的构建，为胰腺癌的免疫治疗研究奠定了基础。     

肝癌组织芭向性正义与反义表达载体pEBAF／N—ras的构建

目的：用分子克隆技术构建肝癌组织特异性N－ras cDNA正义与反义表达载体。方法：用BamHI酶切携带目的基因的质粒pZIP-NeoSV(X)1,获得1．06kb N-ras cDNA；同时以BamHI将载体pEBAF线性化，并行去磷酸化修饰，用T4 DNA连接酶将两者连接，转化感受态细菌DH5α。先以酶切和随机引物法标记的N－ras cDNA探针进行菌落原位杂交筛选阳性重组克隆，再以PvuⅡ酶切鉴定插入方向，同时进行DNA测序和同源性分析。结果：成功构建肝癌组织特异性正义与反义表达载体pEBAF/s-N-ras和pEBAF/as-N-ras。结论：成功构建的N－ras cDNA正／反义表达载体，为原发性肝癌的发生机理和基因治疗研究奠定良好的基础。     

慢性粒细胞白血病MGMT基因的克隆及逆转录病毒表达载体的构建

目的：从慢性粒细胞白血病病人外周血中克隆人MGMT基因，并进行逆转录病毒表达载体的构建。方法：用RT－PCR方法从慢性粒细胞白血病病人外周血白细胞中克隆得到长为684bp MGMTcDNA。将该片段与pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌DH5后得到重组质粒pGEM-T-MGMT，进行限制性内切酶酶切分析、PCR及测序鉴定。再将MGMTcDNA亚克隆到GlNa逆转录病毒载体EcoRI和xhoI位点之间，并进行酶切、PCR鉴定。结果：成功克隆了人MGMT基因，经酶切分析、PCR初步筛选及测序鉴定证实序列正确，并成功构建到逆转录病毒载体上。结论：通过克隆人MGMT基因，并构建逆转录病毒载体GlNa-MGMT，为探讨将耐药基因导入造血干细胞对烷化剂类化疗药物抗性的研究奠定了基础。     

人类p27kip1基因正、反义真核表达质粒的构建

目的：克隆人类p27^kip1基因，构建其正、反义真核表达质粒。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)技术，从人类伯基特淋巴瘤细胞株Raji中扩增出人类p27^kip1 cDNA全长序列，通过DNA重组技术将该基因重组于pcDNA3．1真核表达载体上，构建p27^kip1正、反义表达质粒。通过酶切电泳分析及DNA测序的方法对重组表达质粒进行鉴定。结果：通过酶切鉴定及测序分析证实，本实验构建的重组表达质粒目的基因片段为人类p27^kip1 cDNA。结论：本实验成功地克隆了人类p27kipl基因并构建了其正、反义真核表达质粒，为进一步研究p27^kip1在淋巴瘤发生中的意义奠定了基础。     

含自杀基因酵母菌Fcy::Fur融合基因重组逆转录病毒表达载体的构建与鉴定

目的：构建并鉴定含自杀基因酵母菌Fcy：：Fur融合基因的重组逆转录病毒表达载体，拟将用于肿瘤的基因治疗研究。方法：设计一对PCR引物，在引物的5′端分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点。以质粒pORF5-Fcy：：Fur为模板，采用常规PCR方法扩增Fcy：：Fur融合基因，并将其分别克隆进测序载体PCS2^ 及原核表达载体pGEX-6p-1进一步进行核酸序列测定和原核诱导表达研究。用EcoRⅠ和BamHⅠ将Fcy：：Fur融合基因从测序载体上切出，按正确阅读框架克隆进pLXSN中，重组子鉴定采用PCR法和酶切消化。结果：序列测定表明，扩增的基因即为Fcy：：Fur序列．Fcy：：Fur融合基因在大肠杆菌中获得了融合表达；重组逆转录病毒表达载体经PCR及双酶切鉴定表明：Fcy：：Fur以正确方向插入到pLXSN中。结论：成功构建含有自杀基因Fcy：：Fur的逆转录病毒表达载体，为进一步进行肿瘤实验性基因治疗奠定基础。     

N-ras基因DNA损伤检测方法的建立

目的 建立应用依赖随机化末端连接物PCR（RDPCR）技术检测N—ras基因DNA损伤的试验方法。方法 采用单引物PCR技术制备N—ras基因外显子1单链探针,酶切构建DNA损伤模型,再经RDPCR扩增后与探针杂交显色。结果 单引物PCR技术制备单链探针获得成功,目的基因在相应位置出现了清晰的杂交条带。结论 RDPCR技术可定位检测到该酶切DNA损伤位点,表明该方法已成功建立,将有利于其在化学致癌作用机制研究及肿瘤预防领域的应用。     

BALB/c小鼠MHCⅠ类基因的克隆与逆转录病毒载体的构建

目的：构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子的逆转录病毒表达载体。研究：用RT－PCR从BALB/c小鼠脾细胞基因组中扩增BALB/c小鼠MHCⅠ类分子H－2Dd的编码基因，克隆于载体pGEM-T中。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后，亚克隆于逆转录病毒载体pMSCV，构建pMSCV-H2Dd4重组逆转录病毒表达质粒，并进行酶切和序列测定鉴定。结果：用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定证实，H－2Dd基因正确插入载体pMSCV,H-2Dd的编码基因经序列测定证实，与文献报道完全一致，阅读框架与设计相符。结论：成功构建BALB/c小鼠MHCⅠ类分子编码基因的逆转录病毒载体，为进一步研究MHC分子在移植免疫中的作用奠定了基础。     

人肝细胞癌抗原HCA661 DNA疫苗的构建

目的：构建人肝细胞癌特异性抗原HCA661的DNA疫苗。方法：通过PCR从SMMC7721中获得编码肝细胞癌特异抗原HCA661的基因组DNA序列,插入pGEM-T easy载体后测序,并将目的基因定向亚克隆进入真核表达载体pCI-neo,以PCR和酶切方法鉴定构建的重组真核表达质粒pCI-neo-HCA661。结果：PCR产物为 1 040 bp,测序结果与Gene Bank登记完全相同;PCR和酶切结果表明,构建的重组真核表达质粒中含有正确编码的目的基因片段。结论：成功地构建了含有HCA661基因的DNA疫苗。     

乳酸菌同源重组载体的构建与鉴定

目的:构建乳酸菌同源重组载体,实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。方法:根据乳酸菌L.lactisMG1363全基因组中ThyA基因序列设计引物,PCR扩增乳酸菌基因组中ThyA基因起始密码上游及终止密码下游约1000bp的基因序列,将获得的目的基因依次克隆至载体pMUTIN4中,以琼脂糖凝胶电泳检测目的条带,以双酶切技术、DNA测序予以确证。结果:琼脂糖凝胶电泳结果显示,目的基因成功扩增,双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pThyA-up-down。结论:乳酸菌同源重组载体pThyA-up-down为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。     

人ODC基因第三外显子反义RNA腺病毒载体的构建

目的：构建人鸟氨酸脱羧酶(ODC)基因第三外显子反义RNA的腺病毒载体。方法：RT-PCR方法克隆出人ODC基因第三外显子的片段，插入pMDl8-T载体中，经SalⅠ、BglⅡ酶切，插入穿梭质粒pAd-Track-CMV形成重组质粒pAdTrack-CMV-ODCr。经Pme Ⅰ酶切线性化后，转入pAdesy-1细菌中与含腺病毒基因骨架的质粒pAdesy-1同源重组。将重组质粒pAdesy-ODCr经Pac I酶切后，转染293细胞包装成腺病毒颗粒，经荧光显微镜和PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果：用RT-PCR方法从人前列腺癌组织中扩增出120bp的cDNA片段，经测序证实为ODC基因第三外显子的片段。重组质粒pAdTrack-CMV-ODC。转入pAdesy-l细菌中获得多个阳性克隆。重组质粒pAdesy-ODC。转染293细胞进行包装，经荧光显微镜观察可见其在293细胞中表达。进一步通过PCR法证实其含有目的基因。结论：成功地构建了ODC基因第三外显子反义RNA重组腺病毒载体，为研究其抗肿瘤的作用奠定了基础。     

凋亡抑制基因survivin表达载体的构建及其在HepG2中的表达

目的:克隆细胞凋亡抑制蛋白Survivin(SVV)的编码序列,构建含SVV基因的真核细胞表达载体并在肝癌细胞系HepG2中表达,为进一步研究该基因在肝癌发病中的作用奠定基础. 方法:根据已发表的SVV基因的核苷酸序列设计并合成一对引物,以HL-60细胞系抽提的RNA为模板进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用BamHI和XhoI双酶酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.0中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.0-SVV和DNA序列测定进行鉴定. 用脂质体法将pcDNA3.0-SVV导入肝癌细胞系HepG2中,G418选择培养,经免疫组化法和RT-PCR鉴定其表达. 结果:RT-PCR扩增出长445 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.0后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致. pcDNA3.0-SVV在HepG2细胞中有稳定表达. 结论:成功克隆了SVV的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.0-SVV,有助于对SVV基因在肝癌发生中的致瘤机制做进一步研究.     

Cloning of NHE-1 gene fragment from human lung can.cer cells and construction of its antisense expression vector

Objective: To clone the partial sequence of Na^ /H^ exchanger- 1 (NHE- 1) gene of human lung cancer cells and insert it reversely into the multiclone site of pLXSN in order to construct an antisense expression vector for tumor gene therapy it~ vivo. Methods: With use of the upstream and downstream primers containing Barn H I and EcoR I in their 5‘ ends respectively, a partial sequence of the first exon of NHE-1 gene was cloned in a length of 454 bp from genomic DNA of human lung cancer cell A549 with PCR method. The product was then direetionally and reversely insert into the multiclone site of pLXSN. Finally, the constructed recombinant was identified with agarose gel electrophoresis and DNA sequencing. Results: The cloned fragment was 461 bp in length and successfully ligated to pLXSN with the identification by agarose gel etectrophoresis. DNA sequencing confirmed that the fragment cloned and inserted into the vector was identical with the targeted one. Conclusion: The targeted fragment is successfully cloned and reversely inserted into pLXSN in our experiment. The antisense expression vector of NHE-1, pNHE-1, was constructed successfully.     

人肺癌细胞NHE-1基因片段的克隆及其反义表达载体的构建

构建人肺癌细胞Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋交换泵－１（Ｎａ＾＋／Ｈ＾＋ｅｃｘｈａｎｇｅｒ－１，ＮＨＥ－１）基因的反义表达载体，为将来能在体内应用抑制ＮＨＥ－１基因表达的肿瘤治疗奠定基础。方法采用ＰＣＲ技术从人肺癌Ａ５４９细胞基因组中克隆出长为４５４ｂｐ的ＮＨＥ－１基因外显子部分序列，在上、下游引物５’－端带上ＢａｎＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点。然后将该片段反向插入逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ的多克隆位点。最后对产生的     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

人子宫颈癌基因HCCR-2真核表达载体的构建及鉴定

目的:克隆人子宫癌基因HCCR-2并构建其真核表达载体,为研究其在人胃癌细胞中与P53的相互作用关系奠定基础. 方法:从人肝癌细胞株HepG2提取RNA,利用RT-PCR方法,先克隆出一包括HCCR-2编码区的长约1 kb的片段,并将其与T载体连接并转化,测序证实无误后,以HCCR-2/T载体为模板,再通过PCR克隆出HCCR-2的编码区序列,将其连接到pIRES2-EGFP真核表达载体,并通过测序获得证实. 结果:RT-PCR扩增出一长约1 kb的HCCR-2片段,PCR扩增出约0.9 kb大小的目的片段,HCCR-2/T,pIRES2-EGFP/HCCR-2( ) DNA测序均表明编码序列及读框完全正确. 结论:成功构建HCCR-2真核表达载体pIRES2-EGFP/HCCR-2( ),为进一步研究其致癌机制打下基础.     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

应用AdEasy-1腺病毒系统构建含人nm23-H1基因的重组腺病毒质粒

目的应用AdEasy-1腺病毒载体系统制备含人nm23-H1基因的重组腺病毒载体。方法设计带有限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ双酶切位点的引物,利用PCR法从质粒pMD18-T-nm23-H1上克隆出nm23-H1 cDNA并定向连接至穿梭载体pShuttle-CMV上,行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定和测序。将pAdEasy-1腺病毒骨架载体电转化B J5183感受态细菌,Pm eⅠ酶线性化并去磷酸化处理重组质粒pShuttle-CMV-nm23-H1,并电转化含pAdEasy-1的B J5183感受态细菌,利用卡那霉素筛选,PacⅠ酶切鉴定,重组腺病毒质粒在XLGold-10感受态细菌中大量扩增,产物行PCR鉴定。结果经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切pShuttle-CMV-nm23质粒得到460bp的片段,该片段经测序与nm23-H1基因序列一致,重组腺病毒质粒pAdEasy-nm23-H1经PacⅠ酶切后可以得到3.0kb和4.5kb的片段,大量扩增重组腺病毒质粒后行PCR仍然得到460bp的片段。结论利用AdEasy-1腺病毒系统成功构建含人nm23-H1基因重组腺病毒质粒。     

HBX基因重组腺病毒载体的构建

目的:构建携HBX基因的腺病毒载体,为进一步研究HBX基因的功能,为阐明HBV感染导致肝癌的机制研究建立基础.方法:采用PCR技术从HBV全基因组DNA中扩增HBX基因;将HBX基因亚克隆至质粒pHAHA,构建质粒pHAHA-HBX,酶切pHAHA-HBX质粒,将HAHA-HBX片段克隆到腺病毒载体pAd-Track-CMV中,得到pAdTrack-CMV-HBX,同时与pAdEasy-1共转染293细胞,确定转染效率.检测培养上清病毒中HBX的存在.结果:将PCR扩增HBX片段成功克隆到腺病毒载体中,并经序列分析证实;建立了产病毒细胞株,证实重组病毒中含有HBX基因.结论:成功构建了携HBx基因的腺病毒载体.     

人ALEX2部分cDNA序列的克隆与表达

目的：克隆人ALEX2基因部分片段的cDNA,构建重组表达载体并诱导其表达．方法：通过RT—PCR技术从人胚胎脑组织中特异扩增出ALEX2基因部分编码序列片断(630—1058位核苷酸),克隆入pGEM—Teasy载体中,测序后亚克隆于表达载体pGEX-4T-3中,酶切鉴定正确,转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导4h后,可表达Mc417000的目的蛋白．结果：特异扩增出大小约440bp的片断,经测序与已知序列完全一致,构建了融合蛋白的重组表达质粒PGEX-ALEX2,表达的融合蛋白产物经凝胶薄层扫描检测,占菌体总蛋白量的15．5%．结论：获得了人ALEX2部分基因编码片断及其原核表达产物,为下一步ALEX2 mAb的制备和研究其生物学功能奠定了基础．