VEGF反义寡核苷酸对K562细胞VEGF表达的影响

目的　研究硫代磷酸化修饰的血管内皮生长因子 (VEGF)反义寡核苷酸 (ASODN)对慢性红白血病细胞K 5 62VEGF表达的影响。方法　将终浓度分别为 10、2 0、3 0 μmol·L-1的VEGFASODN和错义序列与K 5 62细胞分别孵育 2 4、48h ,另设空白对照组。采用RT PCR检测VEGFmRNA的表达 ,免疫组织化学方法检测VEGF蛋白的表达。结果　VEGFA SODN对K 5 62细胞VEGF表达有明显的抑制作用 ,与错义序列组和空白对照组比较有显著性差异 (P <0 .0 5 )。错义序列组与空白对照组比较VEGF的表达无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　VEGFASODN可下调慢性红白血病细胞K 5 62VEGFmRNA和蛋白的表达水平     

树突状细胞抗原提呈活化T细胞的机制研究

树突状细胞(Dendritic cells DCs)是一种重要的抗原提呈细胞,关于DCs抗原提呈如何活化T细胞,目前尚不十分清楚。本文应用小鼠脾脏分离到的树突状细胞和腹腔巨噬细胞(MΦ),在LPS的刺激下,观察了DCs和MΦ产生IL-1、TNF的能力,结果表明MΦ可以产生IL-1、TNF,而DCs可产生低浓度IL-1,但不产生TNF;DCs和T细胞共育的上清,观察到在低浓度的IL-2的共同作用下可以明显地促进CTLL-2细胞的增殖活性,提出了DCs对T细胞的活化可能是DCs产生低浓度IL-1触发T细胞,DC-T细胞聚集可以产生白细胞介素2增强因子(IL-2EF),增强T细胞对IL-2的反应性进而活化T细胞,据此提出了DCs活化T细胞的可能机制。     

核因子-κB圈套寡核苷酸转染对小鼠成熟树突状细胞生物学特性的影响

目的 探讨核因子KB圈套寡核苷酸(NF-κB decoy ODN)转染对小鼠成熟树突状细胞(DCs)生物学特性的影响.方法 体外诱导Balb/c小鼠骨髓细胞生成未成熟DCs(imDCs),经抗原OVA以及LPS孵育后成为OVA冲击的骨髓来源成熟nCs(mDCs),流式细胞仪检测DCs表面分子CDllc以及MHC-Ⅱ的表达予以鉴定;将NF-KB decoy ODN体外转染小鼠骨髓来源成熟DCs,同时设立阴性对照组(转染NF-KB"变异"ODN)以及未转染组,EMSA检测转染后NF-KB的活性变化;流式细胞仪检测各组DCs表面共刺激分子(CIMO、CDSO、CD86)的表达;混合淋巴细胞反应观察各组DCs对OVA致敏的T淋巴细胞增殖的影响.结果 成功培养出骨髓来源成熟DCs;NF-κB decoy ODN转染DCs的NF-KB活性明显降低(P<0.05),DCs表面CD40、CDS0共刺激分子的表达与阴性对照组、未转染组比较无明显改变(P0.05),而CD86的表达与其他各组比较明显降低(P<0.05);在混合淋巴细胞反应中,NF-KB decoy ODN转染DCs对T细胞的增殖有抑制作用(P<0.05),而阴性对照组与未转染组的DCs具有强烈的激发T细胞增殖的能力(P<0.05).结论 NF-KB decoy ODN转染DCs可能通过CD86的表达降低显著抑制抗原特异性T细胞活化,该改良的DCs有可能用于哮喘的免疫治疗.     

VEGF反义核酸对Lewis肺癌细胞作用的研究

目的 探讨利用血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)反义寡核苷酸的基因治疗肺癌.方法 制作C57BL/6小鼠皮下肺癌模型30只,分为VEGF反义寡核苷酸(ASODN)治疗组、VEGF正义寡核苷酸(SODN)治疗组及对照组.接种Lewis肺癌细胞后24h内,用ASODN及SODN皮下注射进行治疗,对照组只注射生理盐水,观察小鼠肿瘤的生长情况.用免疫组化方法检测VEGF蛋白表达,RT-PCR方法检测VEGF mRNA的表达.结果 VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组、对照组平均瘤重分别为(4.31±0.45)g、(6.47±0.71)g、(6.23±0.76)g.VEGF反义寡核苷酸治疗组、VEGF正义寡核苷酸治疗组抑瘤率分别为41.8%、5.2%.VEGF反义寡核苷酸能明显抑制VEGF蛋白表达及VEGF mRNA的表达.结论 原位注射VEGF反义寡核苷酸能抑制小鼠肺癌生长.     

反义寡核苷酸对血管瘤内皮细胞VEGF表达的影响

目的探讨反义寡核苷酸(AS-ODN)对培养的血管瘤内皮细胞中血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor,VEGF)表达的影响。方法将VEGF反义寡核苷酸(AS-ODN)、正义寡核苷酸(S-ODN)和错义寡核苷酸(M-ODN)分别转染至体外培养的皮肤血管瘤内皮细胞中,采用RT-PCR技术检测各组细胞中VEGF mRNA的表达水平;ELISA法检测各组细胞培养上清液中VEGF蛋白分泌的改变。结果 RT-PCR结果显示:AS-ODN组VEGF mR-NA表达水平较空白对照组明显下降,而S-ODN组、M-ODN组与空白对照组比较,其VEGF mRNA表达未见明显改变。ELISA结果显示:AS-ODN组细胞培养上清液中的VEGF蛋白分泌浓度较空白对照组明显下降,而S-ODN组、M-ODN组与空白对照组比较,VEGF浓度未见明显变化。结论 VEGF AS-ODN转染可以有效地抑制血管瘤内皮细胞VEGF mRNA表达,降低VEGF蛋白分泌,从而有效地抑制血管瘤内皮细胞的生长。     

GM—CSF诱导红白血病细胞向树突状细胞分化及其抗原提呈功能的研究

目的探讨粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）诱导小鼠红白血病细胞分化过程中，树突状细胞的产生及其抗原提呈功能的变化。方法采用流式细胞仪分析、电镜技术和４小时５１Ｃｒ释放法等，进一步观察了ＧＭ－ＣＳＦ的诱导分化作用。结果１００ｎｇ／ｍｌＧＭ－ＣＳＦ处理３天后的ＦＢＬ－３细胞，树突状细胞的特异性标志３３Ｄ１和ＮＬＤＣ１４５的表达阳性率显著升高；同时，ＭＨＣ－Ⅱ、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｉ－ＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ－１和ＣＤ４０表达水平均增加；扫描电镜显示ＧＭ－ＣＳＦ处理的ＦＢＬ－３细胞，表面出现许多树突状突起，透射电镜下可见细胞浆内有丰富的线粒体，核呈分叶状。同时，能够显著刺激同种异体Ｔ淋巴细胞增殖，促进ＩＬ－２的产生；可显著提高细胞毒性Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）细胞对ＦＢＬ－３细胞的特异性杀伤活性。结论ＧＭ－ＣＳＦ诱导的红白血病细胞可向树突状细胞分化，本身具有抗原提呈功能。     

急性白血病VEGF的表达及其对HL-60细胞生长的影响

目的 :研究急性白血病患者血清及细胞株 (HL 6 0 ,U937,NB4 ,JM ,K5 6 2 )培养上清中血管内皮细胞生长因子(VEGF)的表达水平及其反义寡脱氧核苷酸 (VEGF ASODN)对HL 6 0细胞生长的影响 .方法 :32例急性白血病患者和 10例健康者血清及 5种白血病细胞株培养上清 ,用夹心ELISA法测定VEGF浓度 ,血清VEGF浓度经血小板数标化后以VEGF/PLT(pg·10 -6)作为标准比较其差异 ;急性白血病细胞株HL 6 0经不同浓度VEGF ASODN作用后 ,利用噻唑蓝、ELISA法分别测定靶细胞的生长状态及VEGF分泌水平 .结果 :急性白血病和健康者血清VEGF/PLT相差显著 (P <0 .0 5 ) ;4株白血病细胞株培养上清中VEGF浓度范围为(91.2～ 2 6 0 .9)ng·L-1;与对照组相比HL 6 0细胞存活率经 ,0 .5 ,1及 5 μmol·L-1VEGF ASODN作用 2 4h后明显降低(P <0 .0 5 ) ;经 1,5 ,2 0 μmol·L-1VEGF ASODN作用 2 4h后 ,HL 6 0细胞培养上清中VEGF浓度分别与对照组相比均有明显降低 (P <0 .0 5 ) .结论 :急性白血病患者血清VEGF水平较健康人有明显升高 ;部分白血病细胞株VEGF自分泌较高 ;用VEGF ASODN可以抑制VEGF表达从而抑制HL 6 0细胞生长 .     

HIF—la asODN转染的树突状细胞对胶质瘤细胞生长的影响

目的研究缺氧诱导因子-1a（HIF-1a）反义寡核苷酸（asODN）转染的树突状细胞（DC）与U251胶质瘤细胞融合后的抗胶质瘤活性。方法将HIF-1a asODN利用脂质体包裹转染DC,采用PEG化学融合方法将DC与U251胶质瘤细胞融合,通过MTT法及流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率。结果HIF-1a asODN转染DC组与各对照组相比细胞增殖下降,凋亡增加（P〈0．01）。结论HIF-1a asODN转染DC后,再与U251胶质瘤细胞融合能够比单纯使用HIF-1a asODN转染U251细胞或单纯使用DC细胞取得更好的抑制胶质瘤细胞生长及促进其凋亡的效果。     

HIF-1α asODN转染的树突状细胞对胶质瘤细胞生长的影响

目的 研究缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)反义寡核苷酸(asODN)转染的树突状细胞(DC)与U251胶质瘤细胞融合后的抗胶质瘤活性.方法 将HIF-1α asODN利用脂质体包裹转染DC,采用 PEG化学融合方法将DC与U251胶质瘤细胞融合,通过MTT法及流式细胞仪检测胶质瘤细胞凋亡率.结果 HIF-1α asODN转染DC组与各对照组相比细胞增殖下降,凋亡增加(P<0.01).结论 HIF-1α asODN转染DC后,再与U251胶质瘤细胞融合能够比单纯使用HIF-1α asODN转染U251细胞或单纯使用DC细胞取得更好的抑制胶质瘤细胞生长及促进其凋亡的效果.     

树突状细胞的分化发育、抗原提呈及其功能调控的研究

树突状细胞(dendritic cell,DC)是机体内重要的抗原提呈细胞,在免疫应答的诱导中具有独特的地位.     

血管内皮生长因子反义核酸与高三尖杉酯碱联用对白血病细胞的增敏效应

目的　探讨血管内皮生长因子(VEGF)反义核酸与高三尖杉酯碱(homoharringtonin ,H)联用,对HL6 0和K5 6 2细胞药物敏感性的影响。方法　采用实验筛选所得的最优反义核酸(A7) ,2 0mer,全硫代修饰;以脂质体介导进行转染2 4h开始加入高三尖杉酯碱,继续培养4 8h ,共72h ,用MTT法计算细胞生长活力,求IC50 值,用ELISA法检测培养液中VEGF蛋白的浓度,用Giemsa染色观察细胞凋亡形态学改变,用流式细胞仪检测细胞凋亡百分数。结果　VEGF反义核酸可显著降低对HL6 0和K5 6 2细胞H的IC50 值,下调VEGF蛋白的表达,增加H诱导的HL6 0和K5 6 2细胞凋亡。结论　VEGF反义核酸与H联用对HL6 0和K5 6 2细胞具有增敏效应,VEGF反义核酸可增强H诱导的凋亡作用;同时反证内源VEGF蛋白具有降低HL6 0和K5 6 2细胞对H的敏感性。     

肺癌可溶性抗原与树突状细胞构建肿瘤疫苗的杀伤机制体外研究

目的:通过肺癌的可溶性抗原致敏的树突状细胞(DC)激活细胞毒性T细胞 (CTL)的杀伤作用各个环节的研究,初步探讨其作用机制及影响条件. 方法:从健康人外周血中提取外周血单核细胞(PBMC),加入GM-CSF和IL-4后,在第4日加入不同的促成熟因子,观察DC的表型变化及测定上清中的细胞因子情况. 通过DC表面HLA-DR的表达来比较不同抗原致敏DC的优劣. 应用不同浓度的肿瘤可溶性抗原(TSA),DC负载TSA的不同时间,不同活化时间的CTL及不同TAK与GLC-82细胞的效靶比来测定其中各种引起TAK最高杀伤活力的情况. 结果:DC较好的促成熟因子是MCM,第7日时达到高峰;TSA是较好的致敏DC抗原;最佳效靶比为1∶50. 结论:肺癌可溶性抗原是良好的DC致敏物,可在单核细胞条件培养基(MCM)协助下致敏并使DC成熟,表达更多的HLA-DR,高效激活T细胞.     

慢性粒细胞白血病患者树突状细胞抗原加工递呈和迁移功能观察

目的:研究细胞因子体外联合诱导培养的慢性粒细胞白血病(CML)患者树突状细胞(DCs)的表型和抗原递呈、分泌和迁移功能的变化.方法:分离CML患者(CML组)和健康志愿者(正常组)外周血单个核细胞(PMNCs),经培养获取贴壁细胞,将CML组和正常组的贴壁细胞及K562细胞用细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α体外诱导10 d后,流式细胞仪检测细胞的免疫表型;培养5 d后,用ELISA检测细胞的内吞功能;应用混合淋巴细胞培养分析3组DCs对静息T细胞的免疫刺激活性.结果:正常组、CML组、K562组DCs的特异性标志CD83和共刺激分子标记CD80和CD86以及CD11和HLA-DR的表达差异无统计学意义(P＞0.05);DCs的抗原吞噬、迁移能力和对T细胞的免疫刺激活性,CML组和K562组之间差异无统计学意义(P＞0.05),CML组和正常组间差异有统计学意义(P＜0.05).结论:CML患者DCs的免疫表型和正常人相似,但其抗原捕获、递呈和迁移功能有缺陷.     

颗粒抗原交叉呈递机制的初步研究

目的以噬菌体颗粒抗原为模式抗原,研究其交叉呈递的可能机制。方法将该抗原与巨噬细胞共培养后,采用流式细胞技术和共聚焦显微镜,进行了多肽-MHC-Ⅰ类分子复合物形成的动力学研究。进而,采用流式细胞技术研究了不同蛋白酶体抑制剂以及TAP对噬菌体颗粒抗原交叉呈递的影响。结果巨噬细胞负载重组噬菌体颗粒pC89h isOVA或pC89h isHa后,细胞质MHC-Ⅰ类分子-肽复合物很快形成(约5 h);并且该颗粒抗原的交叉呈递以TAP(transport assoc iated prote in,TAP)依赖的方式进行。MG132,lactacystin以及NH4C l可以显著抑制胞内MHC-Ⅰ类分子-肽复合物的形成,而leupeptin或bestatin处理细胞却不影响该颗粒抗原的交叉呈递。结论噬菌体颗粒抗原交叉呈递是以TAP依赖的方式进行,并对多种蛋白酶体抑制剂敏感。     

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目的:判断深低温冷冻保存对于脐血单个核细胞和CD34+细胞集落形成能力及凋亡率的影响,从而选取能准确反映冷冻损伤的指标以及优化脐血冷冻保存的方式。方法:从脐血中分离出单个核细胞及CD34+细胞,对这两种形式的细胞进行深低温冷冻保存,保存30 d后复温,并分别进行冷冻前后的粒-巨噬细胞集落形成单位(colony formingunit-granulocyte/monocyte,CFU-GM)和髓系多向造血干细胞(colony formingunit-granulocyte,erythrocyte,monocyte and megakaryocyte,CFU-GEMM)的培养,比较冷冻前后的细胞集落产率,同时AnnexinV–FITC-PI染色后流式细胞仪检测两种保存形式的细胞冷冻前后的细胞凋亡率。结果:冷冻保存对于以单个核细胞形式保存的细胞其集落形成能力和以CD34+细胞形式保存细胞的CFU-GM产率均无明显影响(P=0.31),而对以CD34+细胞形式保存的细胞其CFU-GEMM的产率却有明显影响,冷冻后的CFU-GEMM的产率明显低于冷冻前(P<0.05),且冷冻前即发现两种形式的细胞均有凋亡,冷冻后以单个核细胞形式保存的细胞其细胞凋亡率稍有所上升,但以CD34+细胞形式保存的细胞其细胞凋亡率更高。结论:冷冻前细胞即存在凋亡,冷冻对于以CD34+细胞形式冷冻保存的细胞中的较早期的祖细胞CFU-GEMM存在一定的损伤,其损伤可能主要为诱导细胞凋亡所致,而对于以单个核细胞形式保存的细胞的影响较小。     

Expressions of IL-10 on leukemic cells in acute leukemic patients and its significance

Objective: To explore the expressions of IL-10 on leukemic cells in acute leukemia patients and its significance.Methods :The expressions of IL-10 on leukemic cells in thirty patients was measured by indirect immunofluorescence technique. Results:Observed yellow-green bright fluorescence on leukemic cells membrane, the positive rote of cells was 10-80%, there were 18 patients expressing IL-10 (18/30, 60% ) positively, among them 11 with ANLL (11/19, 58% ) and 7 with ALL (7/11, 64% ) respectively while that of peripheral mononucleate cells in control group was 13%. Compared with that in the control group, there was a significant increase of positive rote in ANLL and ALL but with no significant difference between ANLL and ALL. Conclusion: IL-10 secreted by leukemic cells, contributed to the immunosuppressive state at the tumor site. This is probably one of the important mechanisms of acute leukemic escape.     

高乳酸血症对脓毒症小鼠树突状细胞功能的影响及作用机制

背景 树突状细胞(dendritic?cell,DC)功能障碍是脓毒症发生发展的重要原因之一.乳酸作为无氧糖酵解重要中间代谢产物,对多种免疫细胞包括DC具有明显的抑制效应.目的 探讨脓毒症小鼠高乳酸血症对DC功能的影响及作用机制.方法 C57BL/6小鼠随机分为假伤组及脓毒症组.采用盲肠结扎穿孔术构建小鼠脓毒症模型,通过血气分析仪检测小鼠外周血乳酸浓度.抗小鼠CD11c+免疫磁珠分离脾树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD86及主要组织相容性复合体-Ⅱ(major?histocompatibility?complex-Ⅱ,MHC-Ⅱ)表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、IL-4、IL-12及γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)细胞因子表达;激光共聚焦显微镜观察自噬体的形成及数量.结果 脓毒症组小鼠外周血乳酸浓度较假伤组明显升高,且在术后24?h及48?h较为显著[24?h:(2.61±0.54)?mmol/L?vs(1.43±0.58)?mmol/L,P<0.01;48?h:(2.12±0.51)?mmol/L?vs?(1.32±0.53)?mmol/L,P<0.01].脓毒症组小鼠DC表面分子CD80及MHC-Ⅱ表达在24?h时较假伤组明显升高(CD80:61.40％ ± 9.20％?vs?7.94％±1.01％,P<0.05;MHC-Ⅱ:79.91％±8.32％?vs?30.34％±2.47％,P<0.05),并能有效刺激T细胞IFN-γ分泌,诱导T细胞向Th1极化,而脓毒症组小鼠48?h时DC功能出现明显抑制,并诱导T细胞向Th2极化(IFN-γ/IL-4:0.41±0.06?vs?1.00±0.00,P<0.01).乳酸体外刺激可显著抑制DC功能,导致其表面分子表达及刺激T细胞分泌能力显著下调[脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组vs乳酸组.CD80:5.11％±0.52％?vs?0.09％±0.02％,P<0.01;MHC-Ⅱ:96.89％±0.16％?vs?95.96％±0.20％,P<0.05;CD86:67.26％±1.23％?vs 32.45％±2.95％,P<0.01;IL-2:(3.12±1.25)?pg/mL?vs?(0.44±0.14)?pg/mL,P<0.05],LPS联合乳酸刺激DC呈现出相同的趋势,且与乳酸组差异无统计学意义(P>0.05).脓毒症暴露和乳酸刺激均可诱导DC自噬过度活化,分别予以3-MA及Bafilomycin干预自噬均可有效逆转乳酸对DC功能的抑制效应.结论 脓毒症小鼠高乳酸血症可能是DC功能紊乱的重要原因,乳酸可通过诱导过度细胞自噬的方式介导DC应答障碍.     

抗癌剂诱导白血病细胞凋零的生化机理研究

探讨足叶乙甙诱导人Ｔ淋巴白血病细胞ＣＥＭ凋零的生化机理。     

大肠癌肿瘤抗原修饰的树突状细胞活性检测

目的:测定经大肠癌肿瘤抗原修饰的树突状细胞(DC)的活性. 方法:分离结肠癌患者的外周血单个核细胞,应用粒细胞/ 巨噬细胞集落刺激因子联合白细胞介素-4进行体外诱导,获取DC,以流式细胞仪进行表型鉴定;用Lovo细胞制备大肠癌肿瘤抗原并用以修饰DC,以肿瘤抗原修饰后的DC为刺激细胞,以自体淋巴细胞为效应细胞,采用MTT法检测刺激细胞与效应细胞在不同比例(1:10,1:100,1:1 000)以及不同共孵时间(24 h,48 h,72 h)下,效应细胞对大肠癌细胞的排斥杀伤率.结果:从大肠癌患者外周血单个核细胞中成功诱导出表达CD11c、CD80和HLA-DR的DC,经肿瘤抗原修饰后,上述分子表达上调.肿瘤抗原修饰后的DC与淋巴细胞以1:100共孵48 h时,淋巴细胞的肿瘤细胞排斥杀伤率较高.结论:从大肠癌患者外周血中分离诱导出的DC,被肿瘤抗原修饰后,在体外可激活自体淋巴细胞,提高淋巴细胞的杀瘤活性.