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相似文献
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1.
我们报告一种简单、快速提取和纯化质粒的方法。经过细菌培养、质粒扩增制备出清亮裂解液,经酚处理后,用Sephacryl S—1000凝胶过滤层析除去了菌体RNA。制备出的高纯度质粒DNA可用于限制内切酶等分析与应用。  相似文献   

2.
目的探讨8型腺相关病毒的制备方法,初步检测其在体内的表达。方法采用载体质粒、辅助质粒和包装质粒三质粒磷酸钙共沉淀方法转染HEK293细胞,包装病毒,经超声破碎一饱和硫酸铵沉淀一氯化铯梯度离心提取并纯化病毒。肌肉注射感染肌肉组织,检测报告基因增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluoresent protein,EGFP)在体内的表达活性。结果成功包装制备出8型腺相关病毒,重组病毒能够有效感染肌肉组织,绿色荧光蛋白在肌肉组织中稳定高效表达。结论此实验方法制备病毒的质量能够满足小动物体内实验的要求,为进一步应用其进行基因治疗打下基础。  相似文献   

3.
董娟  刘蓓蓓  严正杰 《现代医学》2013,(10):705-708
目的:克隆构建表达人雌激素受体仅(ERα)的真核表达质粒,并探讨通过质粒免疫的方法制备ERa抗体的可行性。方法:利用RT—PCR方法从MCF一7细胞中克隆出ERα基因,并将其构建在pCDNA3.1载体中,质粒经鉴定为正确后,大量提取重组质粒,利用脂质体转染试剂包裹,肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过测定血清抗ERα效价,观察重组质粒携带ER仪在小鼠体内的表达情况。结果:成功克隆构建了表达ERα的真核载体,细胞内瞬时转染实验证实重组质粒成功表达目的蛋白;通过采用该质粒免疫小鼠,获得了高效价的小鼠多克隆抗体,经验证抗体可识别内源性ERα。结论:采用真核表达质粒进行免疫制备ER仅抗体具有可行性,为进一步通过质粒免疫制备ERα单克隆抗体奠定基础。  相似文献   

4.
目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程,选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备,并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板,构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白,并纯化。利用蛋白质免疫印迹,蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示,成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中,考马斯亮蓝染色检测,相较于诱导前,加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达,且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明,制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示,相较于对照组,制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性,结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒,利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白,利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白,为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。  相似文献   

5.
本文用过Sepharose 4B除去质粒粗提物中RNA,然后用改良的酸酚法除去开环型质粒。用0.8%琼脂糖凝胶电泳、紫外荧光薄层扫描和pst Ⅰ限制性内切酶消化质粒法鉴定。此方法可制备出足够的高纯度质粒。  相似文献   

6.
大肠杆菌耐药质粒的头孢哌酮抗性基因克隆和定位   总被引:3,自引:2,他引:1  
用鸟枪法从耐药质粒PFC上克隆到头孢哌酮抗性基因,快速小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株,经多次传代,克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒pEC物理图谱比较,定位出头孢哌酮抗性基因在pEC物理图谱上3.2kb至4.8kb区间内,其分隔量约1.6kb。  相似文献   

7.
人血管内皮细胞生长因子165基因真核表达载体构建   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的获得人血管内皮生长因子(hVEGF165)cDNA,构建其真核表达载体。方法采用PCR技术,从HL60细胞中扩增出hVEGF165 cDNA,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,构建成为pCD-hVGEF165重组质粒。结果经酶切鉴定,克隆的基因片段为人hVGEF165 cDNA;建立了pCD-hVGEF165重组质粒。结论成功地克隆和表达出了人VEGF165基因,为大量制备重组质粒的研究奠定了基础。  相似文献   

8.
用鸟枪法从耐药质粒pFC上克隆到头孢哌酮抗性基因。快速小规模制备质粒DNA进行限制性酶切分析鉴定含重组质粒的克隆株,经多次传代,克隆株抗性表达稳定。多种限制性内切酶谱分析并构建重组质粒的物理图谱与质粒pFC物理图谱比较,定位出头孢哌酮抗性基因在pFC物理图谱上32kb至48kb区间内,其分子量约16kb。该基因包含有EcoRⅠ、SmaⅠ、及PvuⅡ位点。  相似文献   

9.
目的探讨耐药性质粒在肺炎克雷伯杆菌中的耐药机制。方法采用琼脂稀释法测定临床分离的31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素的耐药性,采用质粒DNA小量制备的碱裂解法对耐药菌株进行质粒提取,通过转化试验对质粒的耐药性进行鉴定。结果31株肺炎克雷伯杆菌对阿奇霉素、氨苄西林和头孢菌素类抗生素有不同程度的耐药现象。其中从两株耐药性肺炎克雷伯菌中分离出两种质粒,经转化后鉴定为耐药性质粒,大小分别为2.3kb和8.2kb。结论肺炎克雷伯杆菌的临床分离株的耐药性部分决定于耐药性质粒的存在。  相似文献   

10.
载绿色荧光蛋白基因壳聚糖纳米粒载体的制备和转染的研究   总被引:17,自引:1,他引:16  
目的 优化试验条件,制备合适的壳聚糖纳米粒,并连接上质粒,研究壳聚糖纳米粒对DNA的结合能力。方法 以离子交联法制备壳聚糖纳米粒,并送激光微粒度仪及扫描电子显微镜检测,了解粒径的分布与形态;通过静电吸附作用连接上增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1(报告基因);经琼脂糖凝胶电泳分析载体与:DNA结合能力,并通过紫外分光光度计检测其载药量和包埋率。结果 微粒度分析仪及电镜检测证实壳聚糖纳米粒呈均匀分散的球形颗粒,最小粒径为50nm,平均直径为95nm,琼脂糖凝胶电泳的结果显示壳聚糖纳米粒能有效地结合增强型绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,紫外分光光度计检测不同比例结合(纳米粒:质粒)pEGFP-C1,质粒的壳聚糖纳米粒的包埋率分别为:100%(50:10),100%(50:20),92%(50.75)和65%(50.100)。结论 制备出粒径较小、均匀的壳聚糖纳米粒,并且壳聚糖纳米粒能有效地连接上质粒。  相似文献   

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