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相似文献
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1.
目的 体外研究特异的小干扰RNA(siRNA)对肺腺癌细胞A549 hnRNP B1 基因表达及生长的抑制作用. 方法设计和构建由H1启动子驱动产生的特异的hnRNP B1 siRNA 表达质粒,转染至A549细胞,荧光定量PCR法及Western blot检测hnRNP B1基因的表达,MTT法检测该表达质粒转染后对A549细胞生长的影响.结果 针对hnRNP B1 基因构建的重组质粒具有明显的干扰效果,受特异hnRNP B1 siRNA 干扰的A549细胞hnRNP B1 mRNA及蛋白表达下调,细胞生长受到抑制.结论 应用RNA干扰技术可阻止hnRNP B1基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向.  相似文献   

2.
目的:构建骨桥蛋白(OPN)特异性siRNA(small interfere RNA)真核表达载体,体外观察对OPN基因的沉默作用.方法:采用基因克隆技术,将合成的特异性OPNRNA干扰寡核苷酸序列插入真核表达载体mU6pro,构建OPN siRNA真核表达载体.以脂质体法将mU6pro空载体和2个(mU6pro/OPN—siRNA1和mU6pro/OPN—siRNA2)重组质粒分别导入具有高转移特性的GC9811胃癌细胞系.72h后用RT—PCR和Western blotting技术检测各实验组胃癌细胞内OPN mRNA及蛋白水平的表达情况.结果:成功构建OPN siRNA真核表达载体.转染OPN—siRNA的胃癌细胞,72h后OPN mRNA及蛋白表达下调,而以mU6pro/OPN-siRNA1的抑制效果更为明显.结论:构建的RNA干扰真核表达载体能明显干扰OPN mRNA及蛋白的表达,为将其进一步应用于胃癌的治疗研究奠定了基础。  相似文献   

3.
目的:构建针对绿色荧光蛋白(GFP)基因的发夹结构RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体(pshRNA-GFP),观察对肺癌A549细胞的GFP特异性抑制作用。方法:设计针对GFP基因的shRNA序列,构建pshRNA-GFP质粒。与报告基因质粒PEGFP-N1共转染A549细胞,分别用激光共聚焦扫描显微镜(Laser confocal seanning mieroscope,LCSM)和流式细胞术检测干扰效果。结果:瞬时共转染pshRNA-GFP质粒和PEGFP-N1质粒后,荧光显微镜观察结果显示A549细胞中发出荧光的细胞数量减少,荧光强度明显降低。流式细胞术检测阳性细胞百分率降低至32.4%,差异有显著性。结论:靶向GFP的shRNA表达质粒能有效而特异抑制GFP在A549中的表达,A549细胞中存在RNA干扰现象。  相似文献   

4.
目的 探讨特异性小分子干扰(small interference,siRNA)抑制肺癌A549细胞核内不均一核糖蛋白B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein,hnRNPB1)基因的表达后,对A549细胞增殖的影响. 方法构建hnRNPB1特异性的siRNA真核细胞表达载体并转染人肺癌细胞株A549,观察重组载体分别在第1、4及6周对A549细胞hnRNPB1基因的干扰效果以及对肺癌细胞周期及凋亡的影响.结果 特异性siRNA真核表达可显著抑制肺癌细胞hnRNPB1基因的表达,使hnRNPB1 mRNA的表达减少46%~73%,蛋白表达减少77.69%~83.04%,作用时间至少可维持克隆形成后4周,同时,hnRNPB1基因表达下调抑制了A549细胞在体外的增殖,促进了肺癌细胞的凋亡.结论 特异性siRNA能特异、高效地抑制肺癌细胞株A549细胞hnRNPB1基因的表达,RNAi可能为肺癌的基因治疗提供新策略.  相似文献   

5.
目的:探讨Nuclestemin基因(NS)特异性RNA干扰对人肺腺癌紫杉醇耐药株A549/Taxol细胞耐药性的逆转作用。方法:NS特异性RNAi表达载体转染A549/Taxol细胞。提取肿瘤细胞总RNA,用RT—PCR方法检测NS的表达;利用M1Tr法检测紫杉醇的半数抑制浓度(IC50)。结果:NS特异性RNAi表达载体转染A549/Taxol细胞后,Ns的表达量明显降低,并且对紫杉醇敏感性的相对逆转率达65.3%。结论:.Nuclestemin基因siRNA能有效逆转A549/Taxol细胞的耐药性,明显提高耐药细胞对紫杉醇的敏感性。  相似文献   

6.
目的:探索基于人甲胎蛋白基因启动子构建的siRNA表达载体介导目的基因RNA干扰的可行性,为实现肝癌细胞靶向RNAi治疗作一初步研究。方法:PCR法扩增获得人甲胎蛋白基因启动子并插入pSilencer1.0-U6中以置换其U6启动子;依据人hIRH-1基因RNAi靶位点设计出siRNA模板DNA,体外合成相应寡核苷酸片段后经退火形成短双链。再克隆构建成靶向人hLRH-1基因siRNA表达载体;脂质体转染法将上述重组质粒转入HepG2细胞中,实时定量RT—PCR法初步分析所建系统在AFP表达细胞中触发靶基因hIRH-1的RNAi效应,以及hIRH-1调控下游靶基因的表达改变。结果:获得人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体pSWFPo以人hLRH-1为报告基因,本研究发现所建的RNAi载体系统可在表达AFP的细胞HepG2中有效诱导靶基因表达下调,抑制率约达85%;同时引致hLRH-1调控下游靶基因CydinEl与Oct4的表达相应下调。结论:人甲胎蛋白基因启动子驱动的siRNA表达载体可在表达AFP的细胞HepG2中有效介导靶基因的RNAi效应,为临床肝癌细胞靶向的基因特异性RNAi治疗提供了初步的实验依据。  相似文献   

7.
目的构建靶向survivin siRNA真核表达质粒载体,通过RNA干扰技术阻断survivin基因的表达。方法针对目的基因survivin序列设计双链DNA(dsDNA),采用DNA重组技术与载体连接,转化感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子。结果重组质粒经酶切、测序鉴定,证实插入载体目的基因片段大小与插入方向正确,且转染至肿瘤细胞,可见其发出绿色荧光,转染率为70%-80%。结论靶向survivin—siRNA真核表达载体pGU6/GFP/Neo/survivin—siRNA可用于转染肿瘤细胞、阻断survivin基因表达并诱导细胞凋亡的RNAi实验研究,为肿瘤的基因治疗奠定一定的基础。  相似文献   

8.
靶向EGFR基因的siRNA表达载体构建及其生物学效应的研究   总被引:1,自引:3,他引:1  
目的构建靶向表皮生长因子受体(EGFR)基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体(pSi-EGFR),并观察其抑制人肺腺癌细胞株A549中EGFR基因表达的效果及生物学效应.方法利用Lipofectamine2000将构建的pSi-EGFR载体转入A549细胞中,应用实时定量荧光PCR、免疫荧光和流式细胞仪检测EGFR基因mRNA和蛋白水平的表达,并采用四甲基偶氮唑蓝显色法(MTF)、集落形成实验观察细胞生长变化.结果pSi-EGFR可显著抑制A549细胞中EGFR基因的表达;转染pSi-EGFR细胞生长抑制率为67.8%,集落形成抑制率为59.4%.结论pSi-EGFR载体能够在A549细胞中引发RNA干扰(RNAi)效应下调EGFR基因表达来抑制细胞增殖.  相似文献   

9.
王海东  蒋耀光  杨康  林一丹  王如文  邓波 《重庆医学》2008,37(4):337-339,F0002
目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。  相似文献   

10.
目的:构建以柯萨奇病毒B4的1A和2A基因为靶基因并带有绿色荧光蛋白标志的可表达发夹结构的双链siRNA的表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A。方法:选择柯萨奇病毒B4的1A和2A区基因21 bp为靶序列分别合成65 bp的互补片段并克隆到pSilencer2.1U6 Neo 和pGCsi-U6/Neo/GFP质粒中,经限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳分离、回收DNA片段,及连接酶连接构建双siRNA表达质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A;将构建的载体转染Hela细胞后,荧光显微镜观察荧光的表达。结果:限制性内切酶消化、琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A/2A,有正确的特异性片段,DNA测序也证明其具有正确序列;将该重组质粒转染入Hela细胞后,重组质粒构建成功并在真核细胞内表达GFP,表达时间可达15 d以上。结论:针对柯萨奇病毒B4的1A和2A基因的双siRNA表达载体pU6/double-siRNA/Neo/GFP/1A /2A构建成功,并可在真核细胞内持续表达15 d以上。  相似文献   

11.
目的构建针对肿瘤凋亡基因FasL的小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究RNA干扰技术对人肺腺癌A549细胞FasLmRNA表达的抑制作用,探索Fas/FasI途径在肺癌转移中的作用机制。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasLmRNA为靶基因,合成2对编码短发夹结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达质粒pSilencer2.0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR检测细胞FasL mRNA水平的变化。结果成功构建发卡样FasLsiRNA真核表达载体,转染人肺腺癌A549细胞后,FasLmRNA的表达水平显著下降。结论成功构建的FasL基因siRNA真核表达载体pSi2.0-FasL能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasLmRNA的表达。  相似文献   

12.
目的:探讨DNA载体途径的RNA干扰技术抑制肿瘤细胞的作用和机制。方法:设计和构建由U6启动子驱动产生hTERT的siRNA表达质粒,转染至ALVA-41前列腺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,W estern-b lot检测端粒酶蛋白的表达,细胞记数法检测对细胞生长的影响。结果:构建的针对hTERT基因的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的ALVA-41肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论:应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,抑制肿瘤细胞的增殖。  相似文献   

13.
目的利用小分子RNA干扰沉默碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)基因的表达,探讨其对肺腺癌A549细胞Oct-4表达、细胞增殖和凋亡的影响。方法将A549细胞分为转染干扰质粒组(干扰质粒组)、转染阴性对照质粒组(阴性对照组)和未转染质粒组(空白对照组)。采用Real-Time PCR检测质粒干扰后A549细胞bFGF基因mRNA表达的变化;Western Blot检测Oct-4蛋白表达的变化;CCK-8比色分析法绘制生长曲线观察细胞增殖能力变化及Annexin-V-PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果 Real-Time PCR结果显示质粒干扰后A549细胞中bFGFmRNA表达下降(P<0.01);Western Blot显示干扰组A549细胞Oct-4蛋白表达下降(P<0.01);生长曲线结果显示干扰质粒组细胞增殖活力下降明显(第2~4天P<0.0 5,第6~7天P<0.01);流式细胞仪检测凋亡结果显示细胞凋亡增加(P<0.0 5)。结论靶向bFGF基因的小分子RNA可以抑制bFGF表达;bFGF基因被抑制后下调Oct-4表达,细胞凋亡增加,增殖能力下降。  相似文献   

14.
目的 研究siRNA干扰Pokemon基因对肺腺癌A549细胞增殖抑制效应的变化.方法 专业设计合成3条针对Pokemon的siRNA,分别转染A549细胞后,RT-PCR检测转录水平Pokemon mRNA表达的变化,筛选出其中最高效的1条siRNA;用MTT法检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞增殖的抑制作用;流式细胞技术检测该siRNA干扰Pokemon对A549细胞凋亡的影响.结果 3条siRNA均成功转染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察细胞呈圆绿色.RT-PCR结果显示有2条siRNA使细胞中Pokemon的mRNA表达降低(P<0.05).MTT法结果显示siRNA干扰Pokemon后对A549细胞增殖有抑制作用(P<0.05),其中48 h抑制效率达(24.14±1.39)%.流式细胞技术检测结果显示该siRNA干扰Pokemon可增加A549细胞的凋亡,凋亡率为14.05%.结论 应用RNA干扰Pokemon基因能够抑制A549细胞的增殖,促进A549细胞的凋亡.Pokemon基因有可能成为肺癌治疗中的一个新靶点.  相似文献   

15.
Objective Nucleostemin (NS) is a GTP-conjugated protein located in the nucleoli of stem cells and some cancer cells,and maintains cell self-renewal.We aimed to evaluate NS as a potential target for lung carcinoma gene therapy by investigating NS gene expression and its effect on A549 cell proliferation.Methods NS mRNA and protein expression in A549,HepG2,SMMC-7721,HeLa,and U251 cells was analyzed by RT-PCR and western blotting following transfection of NS siRNAs and negative control siRNA (NC).The effect on cell proliferation was also analyzed by MTT assays.Results NS mRNA and protein were both expressed in A549 cells and four other tumor cell lines; the relative expression levels were similar in all five cell lines.The three pairs of NS siRNA,either transfected alone or cotransfected into A549 cells,could effectively inhibit the expression of NS mRNA and protein.Moreover,the interference ratio showed an obvious concentration-dependent relationship.NS siRNA treatment resulted in significant inhibition of A549 cell proliferation by 35.7%.Conclusion NS gene was not only highly expressed but also played an important role in A549 cell proliferation.Thus,targeting of NS may be a promising novel strategy for the treatment of lung carcinoma.  相似文献   

16.
目的研究神经元特异性烯醇酶(NSE)对肺癌细胞增殖和凋亡的影响。方法用免疫细胞化学检测人小细胞肺癌(SCLC)细胞株NCI-H446和非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549中NSE蛋白的表达,再用RNA干扰技术抑制细胞中NSE基因的表达,最后用流式细胞术、Western blotting及分光光度法检测NSE基因下调后细胞周期分布、Ki67蛋白表达、凋亡细胞百分率及Caspase-3活性。结果 A549和NCI-H446细胞均表达NSE蛋白,特异性siRNA转染显著抑制了细胞中NSE基因的表达,抑制率达90%以上,NSE下调后细胞中S期细胞百分率、Ki67蛋白表达量显著降低,而凋亡细胞百分率和Caspase-3活性显著增加。结论 NSE基因的表达促进了伴有NE分化的肺癌细胞的增殖和抑制细胞凋亡,这可能是NE分化的肺癌细胞具有更为恶性表型的原因之一。  相似文献   

17.
目的:研究RNAi技术对人肺腺癌A549细胞系中STAT3基因的阻断效应,探讨STAT3在肺癌中的重要作用,为肺癌的基因治疗寻找新的靶点。方法:将化学合成siRNA用脂质体介导法转染肺腺癌A549细胞,应用荧光定量PCR法检测RNA干扰后STAT3 mRNA表达量,得出抑制率。应用Western-blot检测RNA干扰后对STAT3蛋白表达的影响。结果:成功将siRNA转染肺腺癌A549细胞,荧光定量PCR结果显示,在转染24h、48h、72h后,各干扰组与阴性组比较STAT3基因表达量明显下调(P〈0.05),Western blot显示转染前后STAT3蛋白的表达水平明显受到抑制,干扰组与阴性组空白组相比具有显著差异(P〈0.05),内参基因在各组的表达量无明显差异。结论:将合成的STAT3 siRNA能有效抑制STAT3蛋白的表达、降低STAT3 mRNA水平,对STAT3有高效和特异的沉默作用,以STAT3为靶点的RNA干扰技术可望成为肺癌基因治疗的新策略。  相似文献   

18.
目的应用载体介导的RNA干扰(RNA i)技术特异性地抑制甲状腺癌细胞人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的表达。方法构建利用U6启动子转录功能性小干扰RNA(siRNA)的质粒载体,对阳性克隆进行酶切和测序鉴定后,转染人甲状腺癌FRO细胞,利用RT-PCR和W eston blot法检测hTERT基因的表达情况。结果构建的表达质粒转染FRO细胞后,hTERT基因mRNA和蛋白质的表达水平明显降低,抑制率分别为76%和81%。结论siRNA的表达质粒能成功抑制甲状腺癌细胞hTERT基因的表达,为RNA i技术应用于甲状腺癌的基因治疗提供了实验基础。  相似文献   

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