Dynamic changes of Nephrin expression in rats with chronic proteinuria renal fibrosis

目的 检测蛋白尿多柔比星肾损伤大鼠足细胞相对数目及Nephrin的表达变化,探讨Nephrin表达变化在蛋白尿发生发展中的意义.方法 36只雄性SD大鼠随机分为对照组(n=16)和模型组(n=20),应用多柔比星(4 mg/kg)尾静脉注射、一周末后重复的方法建立大鼠蛋白尿慢性肾纤维化模型,于第1次注射多柔比星后4、7、10、13周末收集标本,观察大鼠24 h尿蛋白、血生化指标等,光镜、电镜观察肾组织的病理改变,Western blot检测大鼠肾皮质中Nephrin蛋白的表达,免疫组化观察Wilm肿瘤蛋白1(WT1)表达.结果 ①第4周末开始,模型组大鼠蛋白尿显著高于对照组(P<0.01).②肾脏病理在第7周末时出现局灶肾小球硬化,第13周末肾小球呈明显硬化表现,第10周末见足细胞脱离基底膜.③肾皮质WTl蛋白的表达量逐渐减少,但肾脏Nephrin蛋白表达4周末时较对照组增加(P<0.01),7周末后逐渐降低.结论 足细胞相对密度及相对数量的减少可能是蛋白尿发生、发展的重要因素,病程中Nephrin蛋白表达量呈先升后降的变化趋势,疾病早期其表达增加可能是足细胞抵抗损伤的一种代偿反应.     

肝细胞生长因子及其受体在蛋白尿慢性肾纤维化大鼠肾组织中表达的动态变化

目的 探讨蛋白尿慢性肾纤维化大鼠肾组织中肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-Met表达和意义.方法 36只♂ SD大鼠随机分为对照组和蛋白尿慢性肾纤维化组,应用多柔比星(4 mg/kg)尾静脉注射1周后重复的方法建立大鼠蛋白尿慢性肾纤维化模型,分别于第1次多柔比星注射后第4、7、10、13周末收集标本,观察大鼠24 h尿蛋白、血清白蛋白(ALB)、血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)及病理变化.应用Western blot与免疫组化技术分别检测肾组织HGF及c-Met蛋白表达.结果 ①模型组大鼠24 h尿蛋白、ALB、TG、TC明显高于对照组(P＜0.01).②4周末时模型组尿蛋白较对照组明显增多,随着病程进展,肾小球硬化程度加重,第7周肾小球硬化呈局灶节段性分布,肾小球肥大,肾小囊扩张,肾小球有不同程度的硬化,间质可见明显纤维化和局灶件炎细胞.10周及13周肾纤维化程度及面积加重.③肾脏HGF及c-Met表达4周时较对照组增加(P＜0.01),7周时开始降低,并随病程呈进一步降低.结论 肾纤维化过程中,肾脏HGF及c-Met的表达早期上升是一种有益的防御反应;后期HGF、c-Met表达逐渐降低,肾纤维化逐渐发展.肾脏HGF及c-Met表达的下降可能是慢性肾纤维化发展的机制之一.     

糖尿病大鼠肾组织Nephrin mRNA与Podocin mRNA表达的研究

目的观察糖尿病大鼠肾组织中nephrinmRNA、podocinmRNA蛋白表达与分布，探讨nephrin和podocin分子在糖尿病肾病蛋白尿中的可能作用。方法采用健康雄性Sprague—Dawley大鼠随机分为正常对照组、糖尿病组，第4、8周任取6只大鼠，收集血、尿标本测定生化指标。大鼠肾组织分别作组织学、超微结构、应用逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）观察nephrinmRNA、podocinmRNA在肾组织中的表达。结果在4周、8周，糖尿病组血糖、肌酐清除率、尿白蛋白排泄率较正常对照组均有不同程度的升高。糖尿病组大鼠肾组织nephrinmRNA和podocinmRNA和蛋白表达较正常对照组明显降低。尿白蛋白排泄率与nephrin、podocin表达量呈负相关，nephrin与podocin表达量呈正相关。结论糖尿病大鼠肾小球上皮细胞足突nephrin、podocin蛋白表达的减少可能是糖尿病肾病蛋白尿发生的机制之一。     

足细胞蛋白Nephrin、Podocin与肾小球疾病

肾小球疾病是指累及两侧肾小球的一类疾病,多以蛋白尿为主要临床表现,由于发病机理尚不明确,因此疾病早期缺乏准确有效的检测和诊断手段。近来研究发现足细胞蛋白Nephrin和Podocin在多种肾小球疾病发生发展和诊断预测中起重要作用。本文就近几年Nephrin、Podocin与肾小球疾病的相关研究进行综述。     

大鼠足细胞的原代培养及其Nephrin的特异表达

目的 建立简便的大鼠足细胞原代培养体系,检测其去氧肾上腺素(Nephrin) mRNA及蛋白的表达水平.方法 无菌取肾,分离肾皮质,胶原酶消化法分离肾小球,培养9～10d,胰蛋白酶差异消化法传代,过筛去除肾小球继续培养5～7 d:形态学观察和间接免疫荧光法进行足细胞鉴定;流式细胞仪分析足细胞纯度;实时定量PCR(qRT-PCR)、间接免疫荧光法和Western blot法比较前三代足细胞中Nephrin mRNA及蛋白的表达水平.结果 接种5d后大部分肾小球贴壁,肾小球周围有细胞爬出,其最外缘有树枝状细胞分布,形态学及特异性抗体Nephrin、WT-1鉴定为足细胞;流式细胞仪分析足细胞纯度为94.7％;间接免疫荧光和qRT-PCR均显示:与第二、三代足细胞相比,第一代足细胞中Nephrin mRNA和蛋白表达均较高(均P＜0.05);Western blot示体外培养大鼠足细胞表达两种分子量的Nephrin,且第一代足细胞Nephrin灰度值高于第二、三代足细胞(P＜0.05).结论 酶消化法结合差异过筛法接种可促进肾小球贴壁,有利于培养纯度高的足细胞;大鼠足细胞体外培养条件下能特异性表达Nephrin结构及功能蛋白.     

足细胞蛋白Nephrin、Podocin和肾小球疾病

【摘要】肾小球疾病是指累及两侧肾小球的一类疾病,多以蛋白尿为主要临床表现,由于发病机理尚不明确,因此疾病早期缺乏准确有效的检测和诊断手段。近来研究发现足细胞蛋白Nephrin和Podocin在多种肾小球疾病发生发展和诊断预测中起重要作用。本文就近几年Nephrin、Podocin与肾小球疾病的相关研究作一综述。 【关键词】足细胞蛋白;Nephrin;Podocin;肾小球疾病     

足细胞相关蛋白与蛋白尿

蛋白尿是肾脏病常见表现之一，也是肾脏病持续进展的重要因素，深入探究蛋白尿的发生机制对临床上早期防治肾脏病以及延缓病程进展具有重要的意义。传统观点认为蛋白尿发生主要与肾小球滤过屏障有关，人们围绕肾小球滤过屏障的电荷屏障及机械屏障进行较多的研究。近年随着慢性肾脏病蛋白分子机制的深入研究，已发现肾小球脏层上皮细胞，即足细胞裂孔隔膜分子结构和功能是维持肾小球滤过屏障的主要因素，多种重要的足细胞相关蛋白异常与蛋白尿密切相关。本文就足细胞具有代表性的几类相关蛋白结构特征、功能及异常与蛋白尿的关系做一综述。     

糖尿病肾病大鼠蛋白尿和肾组织WT1表达的相关性研究

目的 观察WT1在糖尿病肾病大鼠模型中的表达,从而探讨WT1与蛋白尿的相关性及其在蛋白尿发生发展过程中的作用.方法 56只雄性Wistar大鼠,随机分为对照组和模型组,建立糖尿病肾病大鼠模型,在第1、2、4、8、12周,应用HE染色光镜观察肾小球、肾小管组织结构变化,免疫组织化学技术检测肾组织WT1蛋白的表达,二辛可宁酸（BCA）法测定24 h尿蛋白排泄量,Western bolt法检测大鼠肾皮质中WT1的表达.结果 随着模型组大鼠蛋白尿排泄量的增加,肾组织病理改变逐渐加重,WT1表达量逐渐增加,模型组大鼠的WT1表达量均高于对照组（P＜0.05）.WT1的表达量和24h尿蛋白排泄量之间为正相关（r=0.723 52,P＜0.01）.结论 WT1的表达量随着尿蛋白量的增加而逐渐增多,二者呈正相关;WT1有可能作为判定早期肾脏损伤的参考指标.     

Nephrin,α-actinin-4在糖尿病大鼠肾组织中的表达及其与足细胞数目的相关性研究

目的:探讨糖尿病肾病发展过程中Nephrin及α-actinin-4的表达变化及其与足细胞数目的相关关系.方法:应用SD大鼠,建立1型糖尿病大鼠模型,分为糖尿病组及正常对照组,应用免疫组化及RT-PCR方法观察在糖尿病肾病发展过程中Nephrin,α-actinin-4蛋白及mRNA表达变化,以及应用WT-1来标记足细胞核,观察足细胞数目的变化.结果:8周时,糖尿病组Nephrin染色强度较正常组明显降低(P＜0.05),12周时变化更为明显(P＜0.01),糖尿病组α-actinin-4染色强度在两个时间点较正常组均明显增高(P＜0.01),足细胞数目在两个时间点较正常组均明显减少.Nephrin表达与足细胞数目呈正相关(r=0.93,P=0.002 4),α-actinin-4表达与足细胞数目表达呈负相关(r=-0.923,P=0.008 6),而足细胞数目与尿蛋白呈负相关(r=-0.950 8,P=0.003 6).结论:Nephrin,α-actinin-4的表达在糖尿病肾病发展过程中发生改变,此种改变与足细胞数目减少、尿蛋白的发生密切相关.     

血浆凝血酶敏感蛋白-1在肾间质纤维化中的表达

目的：观察不同时间点血浆凝血酶敏感蛋白-1（TSP-1）在蛋白超负荷肾病大鼠中的表达,分析其与肾小管间质纤维化的关系。方法：45只雄性SD大鼠右肾切除后,随机分成牛血清蛋白（BSA）组和对照组,BSA组大鼠予以腹腔注射牛血清白蛋白,对照组注射生理盐水。分别在第1,5,9周末,检测血常规及生化指标,各时相尿蛋白定量;肾组织行光镜、免疫荧光及电镜检查。采用免疫印迹法检测血浆TSP-1蛋白表达。分析血浆TSP-1表达与肾小管间质病理损害积分之间的相关性。结果：BSA组大鼠24 h尿蛋白定量和肾功能均较对照组有明显差异;肾小管间质病理积分和肾小球硬化指数明显增高;IgG荧光强度明显高于对照组;与对照组比较,BSA组大鼠血浆TSP-1蛋白均明显增高。BSA组血浆TSP-1的蛋白表达水平与肾小管间质病理积分呈正相关（r=0.836,P<0.01）。结论：血浆TSP-1与肾间质纤维化呈正相关,血浆TSP-1可能是临床判断肾间质纤维化程度的重要指标。     

超声造影技术评价慢性肾脏病患者肾脏纤维化的价值

目的探讨超声造影技术在慢性肾脏病肾脏纤维化中的评估价值。方法采用超声造影技术检测25例患者穿刺侧肾脏,肾组织Masson染色评估纤维化程度,进行相关性分析。结果25例肾穿刺患者以肾脏病理进行纤维化分级,估算肾小球滤过率与肾脏纤维化面积呈负相关（r=-0.65,P＜0.05）;定量分析超声参数上升时间和平均渡越时间与肾脏纤维化面积有相关性,相关系数分别为0.45和0.49（均P＜0.05）。最大峰值强度和上升时间在T3组和T0组差异有统计学意义（P均<0.05）。结论超声造影参数上升时间和平均渡越时间与肾组织纤维化面积有相关性,超声造影技术在肾脏纤维化无创评估中具有诊断价值。     

高蛋白饮食及大量蛋白尿对慢性肾功能衰竭大鼠的加重损害作用

目的:观察高蛋白饮食及大量蛋白尿对慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)大鼠的加重损害作用。方法:通过先用5/6肾切除大鼠法制作CRF动物模型,成功后再分别给予5/6肾切除大鼠不同蛋白饮食喂养2个月,制作有大量蛋白尿的CRF动物模型。生化检测不同蛋白饮食喂养的5/6肾切除大鼠血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、血清肌酐(serumcreatinine,Scr)和24 h尿蛋白定量;放免检测血内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、血栓素B2(thromboxane B2,TXB2)、6-酮-前列腺素Flα(6 ketone prostaglandin Flα,6-Keto-PGFlα);分光光度计比色法检测血和肾组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)水平。结果:高蛋白饮食及大量蛋白尿可通过加重CRF大鼠的血液动力学异常,升高TXB2和ET-1,降低血6-keto-PGFlα;减弱大鼠血SOD和GSH-Px的活性,加速肾损害。结论:高蛋白饮食可通过导致5/6肾切除大鼠大量蛋白尿,影响肾脏血管活性物质表达,降低5/6肾切除大鼠抗氧化能力而加速CRF的进展。     

实验性肾间质纤维化大鼠肾小管上皮细胞凋亡的观察

目的观察单侧输尿管结扎（UUO）大鼠肾小管上皮细胞凋亡。方法采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）法检测肾小管细胞凋亡,结果应用图像分析系统进行半定量分析。结果与假手术组相比,模型组检测到较多的凋亡细胞（P〈0.01）。随着时间延长,肾小管凋亡细胞逐渐增多,有显著差异（P〈0.01）。结论肾小管上皮细胞凋亡参与了肾间质纤维化的发生发展。     

氧化苦参碱对阿霉素大鼠慢性肾纤维化组织中核因子-κB表达的影响

目的 探讨氧化苦参碱(OM)对大鼠慢性肾纤维化组织中核因子-κB(NF-κB)表达的影响.方法 实验第1天、第21天尾静脉注射阿霉素(2 mg/kg)建立慢性肾纤维化大鼠模型,分为模型组、苯那普利治疗组和OM治疗组.正常对照组给予等量生理盐水尾静脉注射.检测各组的24 h尿蛋白含量、血生化及肾脏组织病理改变,并应用免疫组织化学法检测肾组织内NF-κB、抑制性κB(IκB)蛋白的表达,并进一步分析NF-κB与IκB蛋白的表达、肾脏病理改变及肾功能损害的关系.结果 苯那普利治疗组、OM治疗组的肾脏病理改变、肾功能损害均轻于模型组,第2次注射后8周时组织内NF-κB蛋白的表达轻于模型组,而IκB蛋白的表达高于模型组,但两者之间差异无显著性.模型组大鼠肾组织中NF-κB与IκB成负相关,而与肾脏病理改变及肾功能损害成正相关.结论 OM可能通过下调阿霉素大鼠肾组织中NF-κB的表达而抑制肾纤维化的发生,从而起到保护肾脏的作用.     

实验性肺纤维化大鼠肺组织Cathepsin B表达的动态变化

目的探讨溶酶体组织蛋白酶B(cathepsinb,CB)在肺纤维化发病中的作用。方法应用博莱霉素(5mg/kg)气管内注入建立实验性大鼠肺纤维化模型,采用HE染色、Masson三联染色、免疫组织化学染色、RT-PCR等方法,观察实验性大鼠肺纤维化的发病过程及其肺组织中CathepsinB蛋白及mRNA表达水平的动态变化。结果实验性大鼠肺纤维化发病过程中,呈现典型的肺泡炎(7d)、纤维组织增生(14d)及稳定的肺纤维化(28～35d)等表现;CathepsinB在正常肺组织表达较弱,在肺纤维化组7d时表达增强,14d进一步增强,28d明显增强,35d时较28d开始减弱,但仍强于正常组;CathepsinBmRNA在正常肺组织中表达较弱,在肺纤维化组7d时表达增强,14d进一步增强,28d明显增强,35d时较28d开始减弱,但仍强于正常组。结论CathepsinB在实验性大鼠肺纤维化发病过程中起重要作用,其过度表达可能参与了肺纤维化的发生发展过程。     

阿米洛利抑制尿激酶受体表达及减少蛋白尿的机制

目的：观察阿米洛利在经典的5/6肾切除大鼠模型中对蛋白尿的影响,探讨其影响蛋白尿的机制。方法构建经典的5/6肾切除大鼠模型,实验分为3组：假手术对照组（Sham）、5/6肾切除组（NTX）、5/6肾切除+阿米洛利干预组（NTX+阿米洛利）。采用考马斯亮蓝法检测各组24 h尿蛋白,利用免疫荧光共聚焦、实时荧光定量PCR等技术,检测足细胞尿激酶受体（uPAR）蛋白和uPAR mRNA的表达情况。结果第2周时,与假手术对照组（Sham）相比较,5/6肾切除组（NTX）24 h尿蛋白明显升高（47.50±28.05 mg vs 14.28±3.8 mg,P=0.023）,有统计学意义;与NTX组相比,NTX+阿米洛利24 h尿蛋白无统计学意义（51.56±21.03 mg vs 47.50±28.05 mg,P=0.748）。第12周时,与NTX组（188.31±29.82）mg相比,NTX+阿米洛利组（121.37±31.14）mg、Sham组（21.32±8.59）mg 24 h尿蛋白增加量均进一步减少,具有统计学意义[P值分别为0.001,0.000]。激光共聚焦显微镜观察,与Sham组相比较,NTX组PLAUR mRNA表达明显增高（9.74±1.44 vs 1.01±0.13,P<0.01）,有统计学意义;与NTX组相比较, NTX+阿米洛利mRNA表达明显降低（9.74±1.44 vs 5.01±1.36,P<0.01）,有统计学意义。结论阿米洛利可能通过抑制受损足细胞uPAR的表达,从而起到降蛋白尿、延缓肾小球硬化的作用。     

1型糖尿病大鼠肾小管间质纤维化的病理改变

目的探讨不同病程1型糖尿病大鼠模型肾小管问质的病理变化。方法腹腔注射链尿佐菌素（STZ,65mg／kg）建立SD大鼠1型糖尿病模型,注药后7d造模成功后分别于4周、12周和24周Masson染色观察血管周围胶原面积（PVCA）、肾小管间质病变评分（TILS）,用免疫组织化学法对肾脏胶原蛋白（collagenⅠ、collagenⅢ）在肾脏的分布及表达进行半定量分析,肾脏光镜与电镜观察,并与同龄正常大鼠进行比较。结果与正常对照组比较,糖尿病组肾脏纤维化指标PVCA、TILS、collagenⅠ、collagenⅢ的表达均明显增高（P〈0．05）。电镜发现糖尿病组肾小球毛细血管基底膜弥漫性增厚,近曲小管上皮细胞空泡化。结论早期糖尿病大鼠模型已出现肾小管间质纤维化改变,损伤的肾小管问质有助于早期判断糖尿病肾病肾脏损伤程度。