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相似文献
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1.
Yuan Z  Xi Y  Zhang H  Kong F  Guan H  Guo S  Liu N  Liang F  Sun Y  Cui J 《中华医学杂志》2002,82(22):1541-1545
目的:构建重组B7-2-L-PE40KDEL融合蛋白,特异性杀伤CD28高表达的T细胞,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7:CD28/CTLA-4共刺激信号系统,由此诱导免疫耐受,特异性防治移植物抗宿主疾病(GVHD)和宿主抗移植物疾病(HCGD)。方法:采用基因融合序列重叠延伸(SOE)策略,构建新型重组pRSETA-B7-2-L-PE40KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28受体的T细胞的活性进行测定。结果:构建并高效表达了B7-2-L-PE40KDEL融合蛋白,所获融合蛋白的纯度大于95%。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD28的人T淋巴瘤细胞系,而对未来表达CD28的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论:具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7-2-L-PE40KDEL毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。  相似文献   

2.
重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL免疫毒素的构建?表达及纯化   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的:构建绿脓杆菌外毒素PE38KDEL融合全人源抗c-Met单链抗体原核表达载体,并对其产物进行变性、复性和纯化,检测其对肝癌细胞系的毒性作用.方法:以从人源天然Fab抗体库中筛选出的AM2-26克隆作为模板扩增出人源c-Met单链基因,采用基因工程原理,将扩增出的c-Met单链基因和PE38KDEL基因克隆入pBAD/GⅢA表达载体中,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确;转化大肠杆菌Top10F',左旋阿拉伯糖诱导表达,采用镍离子螯合层析法纯化变性的包涵体样品,并用连续梯度透析的方法对纯化后的包涵体进行复性;采用流式细胞术鉴定复性产物与靶细胞的结合活性,MTT法检测c-Met/PE38KDEL免疫毒素对肝癌细胞的体外杀伤活性.结果:成功构建了免疫毒素表达载体pBAD/GⅢA/c-Met/PE38KDEL;诱导产物主要以包涵体形式存在;复性后的免疫毒素c-Met/PE38KDEL具有与靶细胞特异性结合的活性并且对SMMC7721细胞系具有较明显的杀伤作用.结论:全人源抗c-Met单链抗体与PE38KDEL重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果,为进一步肝癌的导向治疗提供依据.  相似文献   

3.
目的 :构建绿脓杆菌外毒素PE38融合人源化鼠抗肝癌单链抗体 (hscFv)原核表达载体 ,并对其产物作初步纯化 ,检测其对人肝癌细胞系SMMC 772 1的毒性作用 .方法 :采用基因工程原理 ,将PE38基因片段亚克隆入hscFv表达载体 pGEX 4T 1中 ,重组克隆载体经酶切及DNA序列测定证实两片段连接正确 ;转化大肠杆菌JM10 9后 ,受IPTG诱导表达GST融合蛋白 ,产物包涵体经变性、复性及重折叠并经GST亲合层析柱层析、凝血酶消化后 ,得到纯化的hscFv PE38融合蛋白 .采用MTT法检测hscFv PE38对SMMC772 1的杀伤作用 .结果 :实验成功构建了免疫毒素表达载体pGEX 4T 1 hscFv PE38(以下简称pGEXh PE38) ;诱导产物主要以包涵体形式存在 ,表达量为 11% ;纯化的hscFv PE38对SMMC 772 1细胞系具有较明显的杀伤作用 ,最大杀伤率为78% ,IC50 为 0 .386mg·L-1.结论 :人源化抗肝癌单链抗体与PE38重组免疫毒素的成功表达纯化及对人肝癌细胞系的试验结果 ,为进一步肝癌的导向治疗提供依据  相似文献   

4.
目的:构建原核表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL,并诱导和鉴定其蛋白表达.方法:用PCR方法扩增所需要的目的片段IL3及PE38KDEL再通过酶切和连接的方法定向克隆到载体PQE30-Linker中得到融合基因PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL.重组载体经酶切,菌落PCR鉴定,DNA序列分析插入片段完全正确,转化感受态大肠杆菌SG13009,经IPTG诱导,SDS-PAGE分析分子量大小,Western blot鉴定.结果:经限制性内切酶酶切鉴定,菌落PCR及DNA序列分析表明重组表达载体PQE30-IL3-Linker-PE38KDEL构建成功,IPTG诱导后得到了与预计分子量相符的目的蛋白.经Western blot鉴定在分子量57 kD处有明显特异性条带,说明目的蛋白正确表达.结论:成功构建融合蛋白IL3-PE38KDEL,为后续的蛋白质纯化及功能研究奠定基础.  相似文献   

5.
Guo L  Yang K  Li Y  Situ HF  Chen WJ  Hong M  Lu JZ  Lu SD 《中华医学杂志》2003,83(10):848-852
目的 探讨和构建一种用于靶向性基因治疗的非病毒载体。方法 采用基因工程的方法构建H1s—EGFc融合蛋白表达载体,在毕赤酵母表达系统中获得分泌表达的融合蛋白。使用阴离子交换柱及分子筛进行纯化。制备H1s—EGFc融合蛋白与pKG杀伤基因表达重组体的复合物。选用表皮生长因子受体高表达的HeLa细胞及表皮生长因子受体不表达的Jurkat细胞进行复合物特异性杀伤活性测试。结果 构建并表达了H1s—EGFc融合蛋白,所获融合蛋白纯度可达90%以上。该融合蛋白能够有效地包装杀伤基因表达载体,将其导入表皮生长因子受体特异性表达的肿瘤细胞中,达到靶向性杀伤作用,当融合蛋白/杀伤基因复合物使用剂量分别是3、6、9μg/ml时,杀伤率分别为30.6%、36.2%和58.1%;而对表皮生长因子受体不表达的细胞无杀伤作用。结论 融合蛋白H1s—EGFc能够有效地用于功能基因的包装及转运,可以作为非病毒载体应用于恶性肿瘤的靶向性基因治疗。  相似文献   

6.
目的 探讨该所发明的新方法对重组人白细胞介素2-绿脓杆菌外毒素(IL-2-PE66^4lu)融合蛋白进行纯化与复性的效果。方法 采用该所发明的新方法提纯包涵体,包涵体复性后,样品经DEAE=SepharoseFF离子交换层析,获得融合蛋白纯品。结果 获得的具有生物学活性的融合蛋白纯度达到95%,复性咽收率为80%。结论 此包涵体分离纯化技术简便、实用,可为中试研究和规模化生产提供基础。  相似文献   

7.
IL6(23)-PE40重组毒素的表达和对肿瘤细胞的杀伤效果   总被引:1,自引:0,他引:1  
柳增善  朱平  孟锐奇  王晓玉 《医学争鸣》2003,24(11):972-975
目的: 以IL-6作为导向载体,PE40作为杀伤毒素,构建重组毒素对肿瘤细胞具有特异的杀伤功能. 方法: 通过构建IL6(23)-PE40重组毒素质粒,经大肠杆菌高效表达,纯化表达产物,进行细胞的毒性试验. 结果: 表达产物具有杀伤骨髓瘤细胞、急性髓样白血病细胞,胃癌细胞,肝癌细胞和喉癌细胞的毒性,当重组毒素浓度为0.6 μg *L-1时可杀伤50%的SP2/0细胞,而对其他细胞无毒性. 结论: 表达的重组毒素可特异杀伤骨髓瘤细胞等5种肿瘤细胞,而对试验中其他5种肿瘤细胞及5种正常细胞无杀伤作用.  相似文献   

8.
IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定   总被引:3,自引:1,他引:2  
目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因,再通过适当的酶切及连接反应,构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL-18PE38,重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后,再转染感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实,IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建,重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达,表达产物的相对分子质量与预期值一致,且所表达蛋白可被抗IL-1818的特异性抗体所识别。结论IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得,为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。  相似文献   

9.
目的 构建含有hTERT启动子和PE38KDEL基因片段的质粒phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP并对其鉴定.方法 通过PCR方法扩增hTERTp,用其取代pIRES2-EGFP质粒的CMV启动子,全基因合成PE38KDEL基因片段,将其亚克隆到hTERTp-IRES2-EGFP的MCS中,经酶切及测序鉴定.结果 经鉴定,成功将hTERTp及PE38KDEL两个基因片段插入亚克隆到pIRES2-EGFP中.结论 成功构建phTERTp-PE38KDEL-IRES2-EGFP真核表达载体,有望使PE38KDEL阳性的胰腺癌细胞中特异性表达,起到杀伤胰腺癌细胞的作用,为肿瘤的靶向基因治疗提供了一条新思路.  相似文献   

10.
目的:制备具有杀伤活性的新型抗白血病免疫毒素.方法:在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopmpyl-beta-D-thmgalac-top yranoside,IPTG)的诱导下,高效表达免疫毒素IL3-PE38KDEL,采用细胞毒性实验.对毒素活性进行检测.结果:免疫毒素IL3-PE38KDEL以包涵体形式为主高效表达,该蛋白具有较好的毒素活性.结论:免疫毒素IL3-PE38KDEL具有良好的生物学活性,为其作为抗白血病药物的进一步研究打下了基础.  相似文献   

11.
IL-2-PE664Glu是由白介素2同改构的绿脓杆菌外毒素通过基因融合构成的嵌合蛋白。我们研究了它对ConA诱导的小鼠脾母细胞和PHA激活的人外周血淋巴细胞的细胞毒活性,结果显示其半数抑制剂量(LD50)分别是50ng/ml和20ng/ml,而对IL-2R细胞则无明显的作用;同时,探讨了IL-2的浓度、MTT浓度及作用时间对实验结果的影响  相似文献   

12.
OBJECTIVE: To evaluate the effect of a novel approach for purification and renaturation of recombinant human interleukin-2-pseudomonas exotoxin (IL2-PE66(4Glu)) fusion protein. METHODS: A novel purification method established in our laboratory was adopted for the purification of the inclusion body, and after renaturation, recombinant human IL2-PE66(4Glu) fusion protein was purified by DEAE-Sepharose FF ion-exchange chromatography. RESULTS: The purity of the fusion protein that retain its biological activity was as high as 95%, and a recovery rate over 80% of the refolded IL2-PE66(4Glu) fusion protein was achieved. CONCLUSION: The purification and refolding method for inclusion body adopted in this study is simple and practical, which lays the foundation for a large-scale production of the fusion protein.  相似文献   

13.
CLONINGANDEXPRESSIONOFTHEGENECODINGFORIL-2(60)-PE40,AMOLECULARTARGETEDPROTEINZhangMeng(张萌)ZhaoXue(赵雪)LiHuanlou(李焕娄)andLuSheng...  相似文献   

14.
利用PCR-Cloning技术和DNA重组技术,构建了两类IL-2-PE40'嵌合基因的表达载体,分别由IPTG和温度(42℃)诱导表达。在对表达产物进行了酶切位点和片段大小、电泳迁移率、分子量的初步鉴定后,又对融合蛋白的白细胞介素2(IL-2)和PE40'组分的抗原性进行了ELISA鉴定。从菌体蛋白中初步分离纯化了重组毒素,并测定其对细胞表面表达IL-2受体的活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明,IL-2-PE40'融合蛋白确实对IL-2R+细胞具有明显的靶向杀伤效应并呈剂量依赖关系,与对照组相比,随着保温时间的延长(6、24、48h),杀伤效应趋于增强(P<0.05)。混合淋巴细胞培养结果显示,该融合蛋白对单相和双相反应均有不同程度的免疫抑制作用(P<0.01)。  相似文献   

15.
目的构建单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40并探讨其导向细胞毒作用.方法采用亚克隆技术,首先将HAb25(scFv)与绿脓杆菌外毒素基因突变子PE40,在ply5载体上构建HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pBV220原核表达载体中, 转化DH5α宿主菌,温度诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法;间接免疫荧光染色鉴定HAb25(scFv)-PE40与肝癌细胞结合的特异性;体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择性靶细胞杀伤活性.结果限制性酶切图谱和序列分析证实在ply5载体上成功地构建了HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;该单链免疫毒素基因在pBV220载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的43.3%;纯化后的HAb25(scFv)-PE40间接免疫荧光染色显示具有与亲本抗体HAb25相同的抗原结合特性;导向细胞毒实验结果显示HAb25(scFv)-PE40具有明确的选择性靶细胞杀伤活性. 结论已成功构建和高效表达了单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40,该免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性 (P<0.001),为其进一步的基础和临床应用研究奠定了基础.  相似文献   

16.
Objective:To develop an agent that is more active against receptor bearing target cells without increasing the toxic effect on non target cells.Methods:By the use of molecular biology techniques,we designed and constructed a fusion protein 5′IL6 TNF △ by connecting the human interleukin 6 (hIL 6) gene and a human tumor necrosis factor α derivative (TNF △) gene through a synthetic linker sequence followed by subsequent expression in E.coli .Results:In cytotoxicity assay with myeloma cell line U266,the normal type of 5′IL6 TNF △ showed an antitumor activity 3 times higher than that of TNF △;and the antitumor activity of 5′IL6 TNF △ blocked by IL 6R was only 1/30 of that of normal type of 5′IL6 TNF △.Meanwhile,the 5′IL6 TNF △ blocked by anti TNF antibody did not show any cytotoxicity to U266 cells.In activity assay with L929 cells,the toxic effect of the fusion protein was found 1/22 of that of TNF △.Conclusion:The 5′IL6 TNF △ fusion protein might be a useful cytotoxic agent in cancer treatment.  相似文献   

17.
为实现免疫毒素在大肠杆菌内的可溶性表达,避免包涵体的形成带来的繁琐操作,本实验选用抗间皮素单克隆抗体SS1,以及其与毒素PE38KDEL连接的产物SS1P为实验对象;采用促溶标签结合低温诱导方式实现重组蛋白在大肠埃希菌(SHuffle T7)胞质内可溶性表达,其中促溶标签连接在NpuCD118G突变体的N端,SS1/SS1P连接在NpuCD118G突变体的C端;采用Dextrin Beads 6FF柱亲和色谱和镍柱亲和色谱方法实现目的蛋白纯化;采用分别表达纯化后混合的方法实现断裂内含肽Npu DnaE的自我断裂;采用镍柱亲和色谱除去未剪切的前体和断裂后促溶标签,其中,SS1进一步用Capto L捕获富集;采用Fortebio检测蛋白亲和力。本实验通过内含肽与促溶标签和纯化标签连用,实现了免疫毒素在大肠埃希菌中的可溶性表达,简化了纯化方式。该方法为开发基于大肠埃希菌表达系统的可溶性表达、纯化免疫毒素类药用重组蛋白方法提供了理论参考。  相似文献   

18.
目的 观察IL-6对急性白血病原代细胞体外生长的作用。方法 应用MTT、CFU-L及间接免疫荧光法以IL-6及其与其他细胞因子联合应用对18例急性白血病鹗2骨髓细胞的作用进行观察。结果 IL-6体外单独应用对急性白血病原代细胞无明显促增殖及话导分化作用,但与G-CSF联合应用则常可抑制原代白血病增殖。结论 IL-6与G-CSF联合用于化疗、放疗后的骨髓抑制可能更为安全 。  相似文献   

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