慢病毒介导的hGM—CSF修饰的肿瘤疫苗免疫活性研究

目的构建编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（humangranulocyte—macrophage colony stimulating factor，hGM—CSF）的慢病毒载体，研究编码hGM—CSF的慢病毒载体对树突状细胞（dendritic cell，DC）疫苗抗肿瘤活性的增强作用。方法以质粒pORFhGM—CSF为模板，采用PCR方法扩增出hGM—CSF基因片段；通过BamHI和XhoI限制性内切酶位点。将hGM—CSF基因定向克隆到慢病毒连接载体L166中构建重组载体L166-hGM—CSF。将重组载体L166-hGM—CSF和包装载体L205以及包膜载体L311共同转染慢病毒包装细胞293T，72h后收集病毒上清液获得编码hGM—CSF的慢病毒颗粒Lenti—hGM—CSF。从脐血中分离出单核细胞，rhGM—CSF、rhIL-4和α—TNF诱导获得DC，通过相差显微镜和流式细胞仪鉴定。应用反复冻融法制备可溶性肿瘤抗原，分别将负载肿瘤抗原的DC疫苗和慢病毒Lenti—hGM—CSF感染的负载肿瘤抗原的DC疫苗与T淋巴细胞共同培养，MTT方法检测并比较两者所诱导的CTL对反应细胞的体外杀伤活性。结果编码hGM—CSF的慢病毒载体L166-hGM—CSF成功构建，获得了编码hGM—CSF的慢病毒。该慢病毒的Hela细胞上清液中hGM—CSF的表达明显高于未感染者。从脐血中分离出的DC，显示其高表达CD80（87.2％）和CD86（92．8％），而单核细胞标志CD14的表达率较低（3．56％o慢病毒介导的分泌hGM—CSF的树突状细胞肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力和抗肿瘤活性较普通DC疫苗明显增强（P〈0．01）。结论本实验制备的慢病毒Lenti—hGM—CSF感染反应细胞后能够显著增强DC肿瘤疫苗刺激同种T淋巴细胞增殖的能力及其诱导的CTL细胞对肿瘤细胞的杀伤能力，为hGM—CSF修饰的DC肿瘤疫苗的临床应用提供了一定的实验依据。     

人肝癌特异性EB病毒载体—p^EBAF介导hGM—CSF基因的转移及表达

目的：探索人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF)基因在肝癌细胞中特异性表达的新途径。方法：构建p^EBAF/hGM-CSF基因克隆,用脂质体转染法将它分别导入分泌甲胎蛋白（AFP）的肝癌细胞株HepG2和不分泌APF的细胞株SMMC7721,构建两围基因的细胞克隆HepG2/hGM-CSF,SMMC7721/hGM-CSF,用MTT比色法测定细胞上清中hGM-CSF活性。结果：HepG2/hGM-CSF细胞上清hGM-CSF活性平均为46．5ng/ml/10^6/24h,SMMC7721细胞上清中无明显hGM-CSF活性。结：载体p^EBAF介导的hGM-CSF基因能在分泌AFP的肝细胞中获得特异性表达。     

负载hTERT基因片段的慢病毒的包装及表达

目的构建编码人端粒酶逆转录酶（hTERT）的慢病毒载体，并测定其滴度，观察hTERT 基因在体外的表达情况。方法采用RT-PCR获得hTERT基因片段，插入转移载体L166，用CaCl2法L166-hTERT、L205、L311共转染293T细胞包装慢病毒，测定病毒滴度，免疫细胞化学法检测慢病毒感染的293T细胞中hTERT的表达。结果测序结果显示成功构建了重组质粒L166-hTERT，测定未经浓缩的病毒滴度为5.25×106IU/mL，免疫细胞化学法检测到慢病毒感染的293T细胞中hTERT呈阳性表达。结论成功构建了负载hTERT基因片段的慢病毒，hTERT能在感染的293T细胞中高效表达，表达持续2个月以上。     

乳链菌表达hGM-CSF基因的拼装及其载体pNCSF构建

目的 体外拼装适合在乳酸链球菌表达的人粒-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—macrophage colony stimulatingfactor，hGM—CSF），并构建载体pNCSF。方法 根据hGM-CSF的氨基酸序列及乳酸链球菌偏好的密码子，将hGM—CSF基因外显子的全长碱基序列用DNAWORKS程序设计成16条互补的寡核苷酸片段，并且分别在第1条和第16条寡核苷酸片段上分别设计PstⅠ和BamHⅠ酶切位点，将相同终浓度的寡核苷酸混合进行PCR反应，完成hGM-CSF基因拼接，得到目的基因片段，对寡核苷酸片段进行拼装和扩增．产物稀释后进一步纯化扩增，在Tag酶存在的条件下对产物两末端加T，然后TA克隆于pGEM T easy载体中，经酶切鉴定得到阳性克隆并经测序验证。然后亚克隆于含有P59启动子、USP45蛋白信号肽的pNBC1000载体。结果通过PCR得到420左右目的DNA片段，获得了hGM—CSF和pNCSF阳性克隆。其DNA测序结果与设计序列完全一致。结论 运用基因拼装及克隆技术成功拼装了hGM—CSF基因及构建了载体pNCSF，为乳酸链球菌表达重组hGM—CSF奠定了基础。     

hTWEAK基因重组慢病毒载体构建、病毒包装及蛋白表达分析

目的:构建携带人肿瘤坏死因子样微弱凋亡诱导剂(hTWEAK)基因的慢病毒表达载体,体外包装成病毒颗粒,并分析其感染人肝癌细胞HepG2后TWEAK的表达情况。方法:以pORF5-TWEAK为模板,采用普通PCR扩增TWEAK基因,通过酶切、连接等步骤构建Plentilox3.7-TWEAK重组质粒,利用酶切和测序的方法对重组质粒进行鉴定。在293T细胞中包装含TWEAK基因的慢病毒颗粒并感染HepG2细胞,采用荧光定量PCR和Western-blot检测TWEAK表达水平,并通过间接免疫荧光(IMF)检测其细胞表达定位。结果:酶切与测序结果证明重组质粒构建成功,并能在293T细胞中与病毒包装质粒成功包装病毒颗粒。病毒转染的HepG2细胞中,TWEAK基因mRNA表达量约为对照组的500倍,TWEAK蛋白表达量明显高于对照组,且主要定位于胞浆。结论:本研究成功构建了含人TWEAK基因的慢病毒表达载体,其可在人肝癌细胞系HepG2中稳定表达,为后续的功能学研究打下了基础。     

IRF5基因慢病毒表达载体的构建及其在巨噬细胞RAW264.7中的表达

目的: 构建干扰素凋节因子5(IRF5)慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5并转染巨噬细胞RAW264.7,观察IRF5巨噬细胞RAW264.7中的表达。方法: 采用基因重组技术,将PCR技术钓取的目的基因IRF5片段克隆至线性化慢病毒表达载体LV11中,重组载体经PCR、双酶切和测序鉴定构建成功后,采用脂质体转染技术将表达质粒和包装质粒共转染293FT细胞,获得携带IRF5基因的重组慢病毒;收集病毒上清液感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,用G418将非浸染的细胞致死,获得纯净的浸染细胞,即RAW264.7-IRF5细胞(实验组),并将RAW264.7-NC细胞作为对照(对照组)。分别采用RT-qPCR和Western blotting法检测2组细胞中IRF5mRNA和蛋白的表达水平。结果: 重组慢病毒质粒LV11-cmv-neo-IRF5经PCR和酶切法鉴定构建成功;病毒上清液感染RAW264.7细胞并经G418筛选获得阳性细胞;RT-qPCR法检测,与对照组比较,实验组细胞中IRF5mRNA表达水平升高(P<0.001);Western blotting法检测,实验组细胞中IRF5蛋白的表达水平明显高于对照组。结论: 成功构建携带IRF5基因的慢病毒表达载体LV11-cmv-neo-IRF5,IRF5基因在巨噬细胞RAW264.7中稳定表达。     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

重组腺病毒为载体的人GM—CSF基因在不同受体细胞中的表达研究

将携带人ＧＭ－ＣＳＦ基因的重组腺病毒分别感染人外周血 单个核细胞、胃癌、乳腺癌、直肠细胞，并将该基因转染的人胃癌、乳腺癌、直肠癌细胞以３５Ｇｙ剂量辐照处理后，检测上述细胞培养上清中ＧＭ－ＳＣＦ含量。     

SUMF2基因过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的 构建硫酸酯酶修饰因子2(SUMF2)基因过表达慢病毒载体,以便进一步研究SUMF2功能。方法 针对人SUMF2 DNA序列设计带酶切位点的引物,PCR法获得目的基因片段;用AgeⅠ和NheⅠ酶双酶切SUMF2基因片段及PLJM1-EGFP载体。用T4连接酶对两种酶切产物进行连接、PCR鉴定、测序。将阳性克隆质粒与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染293T细胞,并荧光显微镜观察EGFP的表达。结果 PCR和测序证实成功构建了SUMF2的慢病毒表达载体,病毒效价为1×10⁸ TU/ml。结论 成功构建SUMF2-PLJM1-EGFP慢病毒载体,并在293T细胞中得到表达。     

GM-CSF基因腺病毒表达载体的构建及其在树突状细胞的表达

目的构建人GM-CSF基因的重组腺病毒载体,探讨其在树突状细胞(DC)中的表达。方法设计一对GM-CSF基因上下游引物,以质粒pBlu-hGM-CSF为模板,经PCR扩增获得GM-CSF基因全部序列。片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒,获得重组质粒pshuttle-CMV-GM-CSF。经双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,将2种重组腺病毒质粒分别进行酶切、线性化、纯化,用脂质体转染293细胞。制备病毒上清并测定其滴度,并感染人树突状细胞。结果完成构建含有人GM-CSF基因的重组腺病毒,病毒滴度Ad-GM-CSF 5.2×109pfu/mL。RT-PCR及ELISA检测证实GM-CSF在DC中表达。结论构建重组腺病毒载体,并在DC表达GM-CSF抗原蛋白。     

GM-CSF及其受体与早期自然流产的关系研究

目的：探讨母胎界面局部细胞因子GM-CSF及其受体与早期自然流产的发生的关系．方法采集2009年8月至2011年12月间来云南省第三人民医院进行人工流产及自然流产病例的绒毛及脱膜组织各30例,用放射免疫法检测2组外周血中绒毛膜促性腺激素（HCG）含量,利用免疫组织化学和Western blot检测绒毛及脱膜组织中巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）及其受体（GM-CSFR）表达情况．结果自然流产组HCG值与人工流产组相比明显下降（P〈0.05）．绒毛及脱膜组织中GM-CSF和GM-CSFR 2组均有表达．与人工流产组相比,绒毛组织中,自然流产组的 GM-CSFR增加（P〈0.05）,GM-CSF的表达上调,但无统计学意义（＞0.05）．脱膜组织中,自然流产组的GM-CSF和GM-CSFR均增加（P〈0.05）．结论在脱膜组织中,适量的GM-CSF和GM-CSFR浓度维持妊娠的继续,浓度过高则不利于妊娠,可能是自然流产的原因之一．     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA的克隆及鉴定

目的:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA以构建相应腺病毒表达载体。方法:根据人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子基因序列设计合成可扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cD-NA的特异性引物,用RT-PCR法从骨髓细胞总RNA中扩增人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA,并克隆至pGEM-T载体中,经酶切鉴定后再行序列分析。结果:逆转录多聚酶链反应扩增产物长度与预期的456 bp一致;用M13正、反向引物行荧光测序,证实克隆出的序列与GenBank的人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子cDNA序列完全一致;人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA被成功地插入到质粒pGEM-T中。结论:克隆人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子全长cDNA为构建相应腺病毒表达载体及应用B7-1行肿瘤免疫基因治疗提供了可能性。     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对正常参考血管重构的影响

目的 观察血管成形术后,病变近端正常参考血管重构的发生以及与病变部位血管重构的关系,并观察了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)对血管重构的影响.方法 健康新西兰大白兔28只随机分为GM-CSF组和单纯损伤组.GM-CSF组皮下注射GM-CSF10 μg·kg-1·d-1,单纯损伤组皮下注射同等量生理盐水.7 d后球囊扩张损伤髂动脉.分别于术前、术后4周耳缘静脉采血检测一氧化氮(NO)浓度;4周后提取损伤动脉标本,观察内膜增生情况并测定病理形态学参数.结果 术后4周GM-CSF组N0浓度(98±10)μmol/L高于单纯损伤组(83±12)μLmol/L.单纯损伤组球囊损伤处血管残余管腔面积(LA)小于GM-CSF组[(0.87±0.40)mm2 vs(1.34±0.52)mm2,P＜0.05],损伤处内膜+中膜面积(I+M)大于单纯损伤组[(2.62±0.48)mm2 vs(2.26±0.43)mm2,P＜0.05],两组损伤处外弹力膜环绕面积(EELA)差异无统计学意义[(3.48±0.80)min2 vs(3.60±0.91)mm2,P＞0.05].单纯损伤组参考血管LA小于GM-CSF组[(1.60±0.48)mm2 vs(1.99±0.54)mm2,P＜0.05],两组参考血管I+M无明显差异,LA与I+M之间不存在相关性,而参考血管EELA与LA及I+M之间有明显的相关性(r=0.91,P＜0.001;r=0.685,P＜0.001).两组参考血管LA、EELA与损伤处血管LA、EELA也明显相关(r=0.919,P＜0.001;r=0.909,P＜0.001).结论 血管重构不仅发生在病变血管,同时也发生在近端参考血管.GM-CSF可以促进受损内皮细胞修复,改善负性血管重构.     

糖尿病创面愈合与GM-CSF关系的研究

目的探讨糖尿病创面愈合与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的关系。方法70只C 57B L/6小鼠分为野生小鼠组（对照组,n=35）和糖尿病模型组（DM组,n=35）。腹腔麻醉后在背部中线两侧各制作0.8cm×0.8cm创面。创面动态摄像并于相应时间段取标本,观察创面组织愈合情况,同时计算创面愈合率;EL ISA法测定创面GM-CSF表达。结果创面形成后第3天起,DM组小鼠创面愈合率较对照组明显下降,以创面形成后7 d内变化最为明显;创面形成后第1天,两组小鼠创面GM-CSF表达均明显增高;创面形成后第1天和第3天,对照组小鼠创面GM-CSF表达显著高于DM组。结论GM-CSF的低表达可能与创面愈合早期炎症细胞浸润减少有关。     

慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞杀伤作用的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞的杀伤作用。方法:在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8.2、包膜基因pCMV.VSVG、目的基因pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染T淋巴细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测基因的整合及表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,MTT法测定细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。对照组荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见许多病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在T淋巴细胞中高效、稳定表达,单独使用GCV或5-FC对T细胞/CD+tk的存活率与未转染T细胞比较明显降低(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染T淋巴细胞,双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSV-tk/GCV)对T淋巴细胞的杀伤具有明显增强作用。     

木村病患者血清TNF-α、GM-CSF的变化

目的研究木村病（kimma disease）患者血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落激活因子（GM-CSF）水平的变化并探讨TNF-α和GM-CSF水平的改变与其发病之间的关系。方法采用放射免疫分析法对11例已行手术治疗的木村病患者血清中TNF-α和GM-CSF水平进行了检测。结果木村病患者血清中TNF-α、GM-CSF的含量明显升高,分别为（9.01±3.37）μg/L及（1.07±0.35）μg/L,与对照组比较,差异均有统计学意义（P〈0.01和P〈0.05）。结论木村病患者外周血存在着细胞因子TNF-α、GM-CSF的表达,TNF-α和GM-CSF水平的变化与木村病发病有着密切的关系。     

应用清除支原体后的TF－1细胞检测人IL－3，IL－5，GM－CSF及EPO的生物学活性

作者将从国内有关实验室引进的一株受支原体污染的人红白血病细胞系ＴＦ－１，通过清除支原体和有限稀释法进行克隆化，获得一株对人ＩＬ－３，ＩＬ－５，ＧＭ－ＣＳＦ和ＥＰＯ均高度敏感的ＴＦ－１细胞亚克隆，并建立了稳定而敏感的人ＩＬ－３，ＩＬ－５，ＧＭ－ＣＳＦ及ＥＰＯ生物学活性检测方法．本方法的建立不仅可用于研究这四种细胞因子的表达调控和生物工程生产中这些细胞因子活性定量，而且还可用于这些细胞因子与其受体的相互作用以及受体的结构与功能关系的研究。