藏红花病毒病原的分子鉴定

目的 研究栽培藏红花的病毒病原.方法 综合运用病毒粒子形态和细胞病理学电镜观察、DAS-ELISA检测、RT-PCR检测及序列测定等技术进行病原鉴定.结果 透射电镜负染色观察到病株汁液含有600～900 nm的线状病毒粒子;超薄切片观察到病株细胞质内有大量线状病毒粒子、Ⅱ型风轮状内含体和电子致密无定型体,符合菜豆黄花叶病毒Beamyellow mosaic virus (BYMV)的病理学特征.应用BYMV抗体进行病株DAS-ELISA检测结果为阳性,应用马铃薯Y病毒属特异性引物Sprimer和M4对病株进行RT-PCR检测结果为阳性,对阳性结果进行分子克隆及序列测定发现目标序列与BYMV有99％的同源性.结论 综合检测结果判明侵染浙江藏红花的病毒病原为BYMV.     

引起黄蜀葵黄脉症状双生病毒的分子鉴定

目的:采用分子生物学方法鉴定从广西药用植物园科研基地种植的表现曲叶、黄脉的黄蜀葵上得到病毒分离物H。方法:在电镜下观察病毒粒子的形状,并采用双生病毒的简并引物PA和PB对病样进行PCR检测。结果:从分离物H中扩增得到特异片段有同源性的均属双生病毒科菜豆花叶病毒属病毒成员,其中与一点红黄脉病毒的分离物相似性最高,在核苷酸水平上为95%。结论:引起黄蜀葵黄脉症状的病害存在双生病毒侵染,该病害可能是由一点红黄脉病毒引起。     

儿童人偏肺病毒感染临证体悟

<正>人偏肺病毒(h MPV)是2001年荷兰学者Van den Hoogen等首次从不明原因的呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本中分离鉴定出的一种新型呼吸道病原[1]。该病毒在电镜下呈现类似副黏病毒的多极丝状形态,并且生化特征亦与副黏病毒相似。其后许多学者对其基因组成和序列进行分析,支持将其归类于单分子负链RNA目,副黏病毒科,肺病毒亚科,偏肺病毒属,并命名为人类偏肺病毒,成为偏肺病毒属的     

广丰千金薯烟草花叶病毒lncRNA测序鉴定、原核蛋白表达及其序列分析

目的 对广丰千金薯Dioscorea polystachya Turczaninow.cv.Guangfeng Qianjin烟草花叶病毒进行鉴定、原核蛋白表达和序列分析，为广丰千金薯脱毒苗的培育和鉴定提供理论依据。方法 通过lncRNA测序鉴定广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因，利用大肠杆菌重组技术表达广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白，并采用生物信息学方法进行序列分析。结果 广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白基因包括复制酶1（ORF1）、复制酶2（ORF2）、RNA聚合酶、运动蛋白（movement protein，MP）、带电蛋白和外壳蛋白（coat protein，CP）；广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2基因cDNA总长度分别为480、807、1425、123、4851、3351 bp，其蛋白分别由159、268、474、40、1613和1114个氨基酸组成；广丰千金薯烟草花叶病毒蛋白除带电蛋白为疏水性蛋白质外，其余如ORF1、ORF2、RNA聚合酶、运动蛋白和外壳蛋白均为亲水性蛋白质；广丰千金薯烟草花叶病毒带电蛋白二级结构由β-片层和无规则卷曲构成，CP、MP、RNA聚合酶、ORF1和ORF2的二级结构均由α螺旋、β-片层、无规则卷曲构成；广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2三级结构均为单体；广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2的亚细胞定位分别为内质网、细胞核、细胞质、细胞核、线粒体、叶绿体；广丰千金薯烟草花叶病毒CP、MP、RNA聚合酶、带电蛋白、ORF1和ORF2与烟草花叶病毒的亲缘关系较近，同源性分别为99.79%、99.38%、99.23%、100%、99.38%、99.49%；广丰千金薯烟草花叶病毒复制酶、RNA聚合酶、MP和CP可实现大肠杆菌重组表达，表明广丰千金薯烟草花叶病毒的lncRNA测序结果准确。结论 广丰千金薯烟草花叶病毒与烟草花叶病毒同源性极高，氨基酸序列及核酸序列与烟草花叶病毒其他植物分离物相似度高，在进化上高度保守。     

丹参常见病害的病原、发病规律及综合防治

丹参是多年生草本植物,根部入药,是我国大宗中药材。近年来,随着市场需求逐步增加,种植面积不断扩大,丹参病害发生日益严重,已成为丹参产量和品质的重要威胁。其中,以根部病害为害最为严重。丹参根腐病是生产中的最重要病害,其次为丹参枯萎病,叶部病害以叶斑病最为严重。目前生产上对丹参病害的防治主要以化学防治为主,辅助以生防制剂。该文对丹参根腐病、枯萎病、白绢病、根结线虫病、叶斑病、红叶病及病毒病丹参常见7种病害的为害症状、病原菌、发生规律以及防治措施等进行了总结,旨在为丹参生产中病害辨识、病原物的分离鉴定及科学用药,正确防治各病害提供指导。     

丹参枯萎病及其病原菌的研究

丹参是世界公认的治疗心脑血管病的首选药物,栽培丹参枯萎病发生严重,严重影响栽培丹参产量和质量。针对上述问题,采用形态学和病原学实验手段对从发生枯萎病丹参植株茎和根中分离得到的病原菌进行鉴定,同时根据ITS序列采用PCR的方法进行进一步确定。结果表明丹参枯萎病多发生7—8月高温、多雨季节,栽培一年丹参枯萎病的发生率为10%左右,而栽培三年或者三茬丹参枯萎病的发生率达到了60%~70%。枯萎病会引起丹参根腐,因此生产上易误认为根腐病。形态学鉴定结果表明该病原菌为尖孢镰刀菌,ITS序列也表明其与黄瓜枯萎病菌的ITS序列同源性为99%。因此,作者认为引起丹参枯萎病的病原菌为尖孢镰刀菌。     

白花丹参鲨烯合酶SQS2的克隆与原核表达分析

该研究根据丹参的转录组数据提供的基因片段设计引物,采用逆转录聚合酶链式反应方法,从白花丹参中克隆鲨烯合酶SQS2的全长cDNA序列,命名为SmSQS2,GenBank注册号KM244731.序列长度为1 597 bp,包含1 245 bp的开放阅读框,推测编码414个氨基酸,含有115 bp的5'UTR和237 bp的3'UTR.利用生物信息学软件对获得的序列进行同源性分析,得出白花丹参SQS2的与紫花丹参SQS2的序列无明显差异.原核表达分析结果表明SmSQS2在大肠杆菌中能表达出与预测蛋白大小相当的目标蛋白,对影响蛋白表达的4个因素,即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度和诱导时宿主菌的吸光度(A600)进行了优化,得出SmSQS2蛋白表达的最佳条件为:IPTG终浓度0.2 mmol· L-1,宿主菌的吸光度(A600)为0.6,温度30℃,诱导时间20 h.这为进一步研究白花丹参鲨烯合酶SQS2在丹参萜类和甾醇类生物合成途径中的作用提供了理论依据.     

怀山药病毒病的研究

目的 探明怀山药病毒病的症状和感染病毒的种类，为脱除怀山药病毒、提高产量、改善品质奠定基础。方法 调查怀山药大田感病情况，应用电镜法观察病毒的大小和形状，采用分子生物学方法进一步探明病毒种类。结果 怀山药感染病毒后的症状为叶色失绿、花叶、畸形；在透射电镜下，观察到长600～1200nm的线状病毒，并初步判断为马铃薯Y病毒；PCR扩增后的电泳检测显示出了清晰的马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒的电泳条带。结论 首次发现怀山药感染的病毒为马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒，它是造成怀山药产量下降和品质退化的主要原因。     

应用IC-RT-PCR法检测怀地黄中烟草花叶病毒(TMV)

目的: 建立一套快速、灵敏、高效的怀地黄TMV检测技术,为怀地黄TMV的脱毒检测提供技术支持,以实现怀地黄脱毒苗的产业化生产,改善病毒病引起的品种退化现象。 方法: 根据GenBank上登录的TMV外壳蛋白基因保守序列,设计特异性引物,利用免疫捕捉RT-PCR(IC-RT-PCR)技术检测怀地黄中的TMV,并对PCR扩增产物进行测序。 结果: 利用IC-RT-PCR技术扩增出了预期目的条带,其扩增产物与地黄TMV CP基因(登录号为AY555269)核苷酸序列的同源性达95.29%,氨基酸同源性达96.7%。 结论: 建立了怀地黄TMV的IC-RT-PCR检测技术,集免疫学与分子生物学检测技术于一体,灵敏度高,操作简便,适合于怀地黄TMV的快速检测。     

侵染三七的三七Y病毒和中国番茄黄化曲叶病毒PCR同步检测技术

目的 建立一种高效、快速、准确地同步检测侵染三七Panax notoginseng的2种病毒——三七Y病毒（Panax notoginsengvirus Y,PnVY）和中国番茄黄化曲叶病毒（tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）的双重PCR技术。方法 分别以单一感染PnVY或TYLCCNV及复合侵染了这2种病毒的染病三七植株为样品,CTAB法提取叶片总核酸作为模板,根据GenBank上已登录的PnVY和TYLCCNV这2种病毒核酸序列设计特异性检测引物。通过单一PCR技术明确染病三七样品PnVY和TYLCCNV的发生情况,筛选出可用于一步法双重PCR检测PnVY和TYLCCNV的引物组合及引物浓度,并对反应条件进行优化。对扩增产物进行克隆测序,验证一步法双重PCR检测的准确性和特异性。结果 建立的一步法双重PCR检测技术能同步有效地检测三七病样中的PnVY和TYLCCNV,检测灵敏度高,最低检测限点为核酸原液的0.01稀释倍数,特异性强。结论 所建立的一步法双重PCR检测技术可以高效、快速、准确、特异地同步检测三七样品中的PnVY、TYLCCNV2种病毒。     

北葶苈子GGPS基因的克隆、序列分析与原核表达

目的:获得北葶苈子(Lepidium apetalum)中牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPS)的编码基因,进行生物信息学分析,在大肠杆菌中表达该蛋白。方法:根据北葶苈子转录组测序结果中的GGPS基因序列,设计特异性引物,通过PCR扩增得到北葶苈子GGPS的c DNA序列,进行TA克隆、测序及序列分析,构建原核表达载体并于大肠杆菌中表达北葶苈子GGPS蛋白。结果:得到北葶苈子GGPS c DNA全长1 146 bp,编码381个氨基酸;序列分析表明北葶苈子GGPS基因编码的氨基酸序列包含类异戊二烯合成酶结构域,氨基酸序列进化关系表明北葶苈子GGPS与拟南芥(Arabidopsis thaliana)和白芥(Sinapis alba)亲缘关系最近;成功构建了p ET-32a-La GGPS原核表达载体,并在大肠杆菌BL21菌株中成功诱导表达。结论:首次克隆得到北葶苈子GGPS基因,并在大肠杆菌中成功表达了北葶苈子GGPS蛋白,为纯化该蛋白并研究其结构和功能奠定了基础。     

复方丹参注射液对血管内皮细胞基因表达谱的影响研究

 目的探讨复方丹参注射液对血管内皮细胞基因表达谱的影响。方法培养人脐静脉内皮细胞;复方丹参注射液作用细胞18 h,以正常培养的细胞作对照,用心血管疾病及细胞因子相关的基因芯片研究复方丹参注射液对培养的人脐静脉内皮细胞基因表达谱的影响,并用RT-PCR方法对表达上调与表达下调的基因进行了扩增和电泳检测。结果基因芯片分析筛选出复方丹参对内皮细胞的影响基因9个,其中上调基因3个,下调基因6个,包括一些与免疫、血管舒缩、细胞黏附及抗氧化的相关基因;对差异表达的基因用RT-PCR扩增及电泳检测结果与基因芯片结果一致,证实了基因芯片的检测结果。结论复方丹参可通过多种途径在基因水平调节内皮细胞的功能。     

红花天冬氨酸激酶基因片段的分离及表达分析

目的克隆红花种子中的天冬氨酸激酶(aspartokinase,AK)基因并研究其在种子不同发育时期的表达量。方法根据红花转录组文库注释信息筛选与红花天冬氨酸激酶(Ct AK)基因相关的Unigenes,设计引物,以红花种子总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增Ct AK基因片段并连接到克隆载体上,经PCR及酶切鉴定,筛选阳性克隆进行测序。同时利用荧光定量PCR技术对其进行基因表达量的分析。结果克隆了红花Ct AK基因的核心片段,分离到486 bp的基因序列。根据Ct AK基因片段设计引物,对不同品种不同发育时期红花种子进行荧光定量PCR分析,Ct AK基因在红花品种川红1号初花后13 d表达量最高。结论系统发育树分析表明,该基因与其他物种的AK基因具有较高的同源性。     

中药材鹿心分子鉴定方法及检测试剂的研究

目的建立中药材鹿心DNA指纹鉴定方法,研发鹿心DNA检测试剂盒。方法以梅花鹿和马鹿mtDNA Cytb基因作为靶基因,设计小片段特异性引物,研制鹿心DNA提取及PCR检测试剂;应用分子克隆及测序技术,克隆鹿心对照药材;并对试剂的特异性、重现性、稳定性及灵敏度进行考察;对市售鹿心样品进行真伪鉴定。结果自主研发的试剂提取鹿心的DNA浓度纯度均达到PCR的要求;在退火温度为63℃时引物的特异性最强;克隆测序后的鹿心DNA序列与鹿心mtDNA Cytb特异指纹区段序列一致;自主研发的试剂重现性、稳定性良好,灵敏度达到0.5%;对市售30个鹿心样品进行检测,伪品率为40%。结论建立的鹿心DNA指纹鉴定方法特异、准确、可靠,研制的鹿心DNA检测试剂盒操作简便、结果稳定。     

红花黄酮醇合成酶基因片段的克隆及表达分析

目的克隆红花花瓣中的黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)基因并研究其在不同开花时期的表达量。方法根据红花花瓣转录组测序结果挑选FLS基因的设计引物,以红花花瓣总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增FLS基因片段并连接到PEASY-T1载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。结果获得了224 bp的序列,将获得的序列在NCBI上进行Blast比对,该基因与其他物种的FLS基因具有较高的同源性。结论克隆了红花FLS基因中间片段,根据FLS基因片段设计引物,对红花不同品种不同开花时期进行荧光定量PCR分析,红花FLS基因在吉红油姊妹系的盛花期表达量最高。