金铁锁β-香树素合酶cDNA的克隆、原核表达和功能鉴定

目的 克隆金铁锁Psammosilene tunicoides三萜皂苷生物合成途径中的关建酶基因——β-香树素合酶全长cDNA,并对其进行表达和分析,为研究其在三萜皂苷合成途径的关键作用及次生代谢产物工程技术在金铁锁上的应用奠定基础。方法 应用RT-PCR和RACE等方法,克隆金铁锁β-香树素合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,以2,3-氧化鲨烯为底物进行体外酶促,采用HPLC法鉴定产物。结果 克隆得到金铁锁β-香树素合成酶基因,全长2 882 bp,ORF长2 284 bp,编码760个氨基酸。表达产物具有催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树素合酶的活性。结论 克隆所得的全长cDNA通过大肠杆菌表达β-香树素合酶,并能催化2,3-氧化鲨烯生成β-香树素,为金铁锁次生代谢工程研究提供了重要的基础。     

红花转录因子CtMYB1基因的克隆及原核表达

目的 从红花Carthamus tinctorius 花瓣中克隆转录因子基因CtMYB1,并进行序列分析和原核表达载体的构建。方法 根据红花转录组测序结果中得到的高表达的Unigene123933序列,利用RT-PCR和RACE技术从红花花瓣中扩增得到CtMYB1基因的全长cDNA序列,并进行生物信息学分析;以CtMYB1基因的全长cDNA序列为模板,PCR扩增得到CtMYB1基因的开放阅读框(ORF)序列,构建原核表达载体pEASY-E1-CtMYB1。转化大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。结果 成功从红花中克隆1个MYB基因,命名为CtMYB1,GenBank登录号为KJ524853。CtMYB1基因全长893 bp,ORF为750 bp,编码249个氨基酸。同时,成功构建了该基因的原核表达载体。SDS-PAGE结果显示该蛋白的大小约30 000,与预测的蛋白相对分子质量一致。结论 成功克隆了CtMYB1基因,构建了原核表达载体,初步证明该基因在大肠杆菌中成功表达。     

金龙胆草3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 对金龙胆草Conyza blinii 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）基因进行克隆及序列分析,并检测其是否可作为金龙胆草的内参基因。方法 采用RACE技术克隆金龙胆草GAPDH基因的cDNA全长序列,利用DNAMAN、BLAST、MEGA等工具对序列进行生物信息学分析,并以其为内参进行半定量RT-PCR。结果 克隆获得了1个全长1 418 bp的GAPDH基因,完整开放阅读框1 020 bp,编码340个氨基酸,命名为GLGAPDH。序列比对结果显示,金龙胆草的GAPDH基因与紫背天葵的同源序列相似性达到96%,与薇甘菊的同源序列相似性为93%。通过系统进化树分析发现其与紫背天葵的亲缘关系最近。半定量RT-PCR分析GLGAPDH作为内参基因在不同组织中表达稳定,扩增效果良好,重现性强。结论 首次克隆了金龙胆草GAPDH基因的全长cDNA序列,并通过半定量实验验证了其可作为内参基因用于基因表达量分析,为金龙胆草次生代谢物合成过程中关键酶表达分析及调控机制的研究奠定了基础。     

阳春砂二酮辅酶A合成酶的基因克隆及序列分析

目的 对阳春砂姜黄素生物合成途径的关键酶二酮辅酶A合成酶（diketide CoA synthase,DCS）基因的编码cDNA序列进行克隆,为研究阳春砂姜黄素生物合成与基因调控奠定基础。方法 结合阳春砂的转录组注释,根据编码区序列设计引物,通过PCR方法克隆阳春砂DCS基因的编码区cDNA。结果 PCR扩增了一个长1 170 bp的基因片段,该片段编码由389个氨基酸组成的DCS。同源性比对结果显示基因编码蛋白与姜黄的DCS具有氨基酸一致性达96%,与水仙等植物的查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）氨基酸一致性达66%～69%。进化树分析结果显示,与姜黄Curcumae Longae具有较近的亲缘关系。结论 首次从阳春砂中克隆DCS基因获得其编码区序列,为分析基因表达特性及其在姜黄素生物合成中的功能奠定基础。     

人参AGO1基因的克隆及序列分析

目的: 从人参叶片中克隆Argonaute 1(PgAGO1)的全长基因,并利用生物信息学方法进行分析。 方法: 根据人参EST序列设计特异性引物,采用RACE方法克隆PgAGO1的cDNA全长,并对PgAGO1蛋白的结构进行预测、氨基酸序列多重比对以及构建系统进化树等分析;同时采用实时定量PCR检测PgAGO1基因在人参不同组织根、茎、叶、花和愈伤中表达水平。 结果: 克隆的PgAGO1全长cDNA为3 776 bp,其中包括5'UTR 204 bp,3'UTR 254 bp,基因内部包含完整的开放阅读框,可编码1 105个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为122.22 kDa,理论等电点pI 9.71;实时定量PCR检测结果表明PgAGO1基因在人参花中的表达量最高,在根中最低。 结论: 从人参叶片中克隆得到PgAGO1的全长cDNA,为进一步研究该基因在人参组织发育中的调节作用打下基础。     

金荞麦花青素合酶基因的克隆及其表达与花青素量的相关性研究

目的 获取金荞麦花青素合成途径关键酶花青素合成酶（anthocyanins synthase,ANS）基因的全长序列,并进行序列分析;对花期金荞麦ANS基因在各组织中表达水平与花青素量的相关性进行分析。方法 利用同源克隆技术获得ANS基因cDNA序列;采用半定量RT-PCR对ANS表达量进行分析;采用分光光度法测量花青素量。结果 金荞麦ANS基因cDNA包含一个1 077 bp的ORF,编码358个氨基酸,命名为FdANS。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白与其他植物ANS蛋白氨基酸序列同源率较高。FdANS在花期金荞麦不同组织中的表达量分析表明,其表达量花＞叶＞茎＞根,花青素量为花＞叶＞茎＞根。结论 在金荞麦中首次获得ANS基因的cDNA序列,编码蛋白具有ANS同源蛋白的典型特征。FdANS基因在金荞麦根、茎、叶和花中的表达量与花青素量具有相关性。     

桑黄麦角甾醇生物合成关键酶PlERG24基因克隆与表达分析

目的 克隆桑黄菌丝甾醇C14还原酶（ERG24）基因全长，并进行生物信息学及表达模式的初步分析。方法 基于桑黄菌丝转录组数据设计PlERG24基因引物，采用PCR技术获得其cDNA全长序列，并通过Ex PASy等在线分析软件对其进行生物信息学分析，同时利用实时荧光定量PCR技术分析该基因的表达模式。结果 从桑黄菌丝中克隆到1 412 bp的PlERG24基因，开放阅读框长度为1 326 bp，编码441个氨基酸，理论相对分子质量为49 358.61，等电点为5.28，为不含信号肽的疏水性蛋白，推测定位于质膜，具有6个磷酸化位点；系统进化树分析表明，该序列与暴马桑黄的ERG24基因同源性最高。表达模式分析表明，在桑黄菌丝生长的一个周期内，PlERG24基因表达在25 d时达到最高6.36。结论 获得了PlERG24基因全长序列，为进一步研究该基因的功能以及利用基因工程等手段改良麦角甾醇生物合成途径奠定基础。     

温郁金法呢基焦磷酸合酶（CwFPPS）基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

目的 克隆温郁金Curcuma wenyujin萜类生物合成中的限速酶法呢基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS）的全长cDNA序列。方法 根据温郁金转录组数据设计特异引物，PCR扩增FPPS全长cDNA序列并对其进行生物信息分析；构建"基因-GFP"融合表达载体，利用农杆菌介导烟草叶片进行亚细胞定位分析；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因在植物组织中的特异性表达。结果 温郁金CwFPPS基因全长1196 bp，包含1个长为1071 bp的开放阅读框，编码356个氨基酸，GenBank登入号为MT489462；CwFPPS编码蛋白属于类异戊二烯生物合成酶超级家族（C1）成员，包含5个保守的功能域，其中2个是富含天冬氨酸（DDXXD）的活性中心；亚细胞定位显示该蛋白位于泡质、细胞膜或细胞核上。qRT-PCR分析表明，CwFPPS基因在根茎中特异表达，相对表达水平是叶片中的13.7倍。结论 克隆获得的温郁金CwFPPS基因全长及其特异表达信息，可为后续进行基因功能鉴定及倍半萜成分的代谢工程研究提供依据。     

红白忍冬SABATH甲基转移酶基因克隆及其生物信息学分析

目的: 克隆红白忍冬SABATH甲基转移酶基因(rLjSABATHMT),比较忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶同源基因表达量和基因内含子序列的差异,为金银花的活性成分形成及调控机制研究提供基础。方法: 根据cDNA文库提供的基因片段设计特异性引物,从红白忍冬中克隆获得rLjSABATHMT基因cDNA序列及基因组序列。通过生物信息学对该基因蛋白的特征进行分析,使用MEGA 5.0构建SABATH甲基转移酶系统进化树,利用RT-PCR分析SABATHMT同源基因在忍冬与红白忍冬的不同器官、不同花期的表达量,对忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列进行分析和比较。结果: 克隆获得的rLjSABATHMT基因cDNA序列全长为1 251 bp,具有完整编码框,编码365个氨基酸。该基因蛋白序列具有保守的SABATHMT结构域,系统进化树结果表明它可能是水杨酸/安息酸甲基转移酶。基因表达分析结果表明SABATHMT同源基因主要在花中表达。忍冬和红白忍冬SABATHMT同源基因内含子区序列具有丰富的多态性,且有2个SNP为红白忍冬的特有基因型;内含子区motif元件中碱基变异在2个同源基因间具有显著差异。结论: SABATHMT同源基因内含子区变异可能导致了忍冬和红白忍冬SABATH甲基转移酶表达差异,为金银花活性成分调控机制研究提供了重要研究基础。     

姜黄苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与序列分析

目的对姜黄Curcuma longa苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(Cur PAL)全长进行克隆并开展生物信息学分析,为姜黄次生代谢产物的生物合成机制研究奠定基础。方法利用RT-PCR和RACE相结合的方法,以姜黄叶片c DNA为模板,克隆获得Cur PAL全长,进行生物信息学分析。结果克隆的Cur PAL(登录号为KJ780359)全长c DNA为1 293 bp,其中包括5’-UTR 243 bp,3’-UTR 123 bp,含有1个927 bp的完整开放阅读框(opening reading frame,ORF),编码308个氨基酸;预测蛋白质相对分子质量为33 000,理论等电点p I为5.76;Cur PAL蛋白性质稳定,为可溶性蛋白;Cur PAL编码的蛋白质序列包含与夹竹桃PAL蛋白质相同的脱氨基位点和催化活性位点,氨基酸序列多重比较发现,Cur PAL编码的氨基酸序列与中国李、浙江红山茶、拟南芥、辣椒、小果野蕉PAL氨基酸序列的同源性达到75%以上;与姜目类的植物(如小果野蕉)的PAL聚为一支,说明两者亲缘关系较近;通过蛋白质二维、三维结构的预测,表明Cur PAL蛋白为全α型蛋白,由同源四聚体构成。结论首次克隆并获得Cur PAL基因全长c DNA,为姜黄素生物合成途径的阐明和改善中药材品质提供科学依据。     

红花DHDPS基因全长cDNA的克隆及植物表达载体构建

目的克隆红花赖氨酸生物合成途径关键酶二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase DHDPS)基因的全长c DNA序列,构建植物超表达载体。方法根据红花转录组文库注释信息获得红花DHDPS(CtDHDPS)基因的中间序列,通过RT-PCR与RACE技术从红花种子中克隆CtDHDPS基因全长c DNA序列。采用DNA重组技术构建p BASTA-CtDHDPS植物超表达载体。结果分离CtDHDPS基因全长1 309 bp,开放阅读框954 bp,编码317个氨基酸,编码蛋白理论等电点为5.93,相对分子质量约为34 750.79。通过DNA重组技术成功构建了植物超表达载体p BASTA-CtDHDPS。结论获得CtDHDPS基因全长c DNA序列并成功构建植物超表达载体,为阐明CtDHDPS基因的生物学功能及其在红花赖氨酸生物合成途径中作用机制提供科学依据。     

建泽泻鲨烯合酶基因克隆及其生物信息学分析

目的 对建泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成关键酶鲨烯合酶(squalene synthase,SS)进行基因全长的克隆和生物信息学分析.方法 以建泽泻总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆建泽泻SS基因的cDNA全长,并通过DNAMAN软件及ExPASy在线分析等方法对其进行生物信息学研究.结果 获得建泽泻SS基因全长cDNA,GenBank注册号为JX866770,序列分析表明,所克隆的cDNA序列全长为1577bp,包含一个长1230bp的开放阅读框架,编码409个氨基酸的蛋白,与其他药用植物具有较高的同源性.预测该蛋白的相对分子质量为4.68×104,等电点为5.97,无信号肽,包含2个富含天冬氨酸(DXXDD)的保守功能域.结论 首次克隆获得建泽泻SS基因的全长cDNA,为泽泻原萜烷型三萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据.     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

灰毡毛忍冬LmPAL1基因的克隆及表达分析

目的克隆灰毡毛忍冬苯丙氨酸解氨酶(LmPAL1)基因全长序列,并进行生物信息学和表达模式分析。方法提取灰毡毛忍冬花总RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和RACE技术克隆LmPAL1基因的全长cDNA序列;运用相关软件对该基因序列进行生物信息学分析;利用qRT-PCR测定灰毡毛忍冬茎、叶和不同花期花中该基因的相对表达量。结果克隆的LmPAL1基因开放阅读框(ORF)长度为2 145 bp,编码714个氨基酸,生物信息学分析预测为亲水性蛋白,定位于叶绿体中,包含PAL shielding结构域(527～641 aa),并且含有PAL/HAL活性中心序列GTITASGDLVPLSYIAG(196～212aa),与其他LmPAL1具有较高的相似度;LmPAL1基因q RT-PCR结果显示,7个花期材料以金黄色开花期相对表达量较高;与茎、叶比,白色花蕾期花的相对表达量最高,叶的最低。结论成功克隆了LmPAL1基因,为进一步研究该基因的功能以及遗传改良灰毡毛忍冬品质奠定基础,同时为探究灰毡毛忍冬绿原酸生物合成和调节机制提供了依据。     

太子参鲨烯环氧酶基因的克隆及其表达分析

目的对太子参三萜类皂苷生物合成关键调控酶鲨烯环氧酶1(SQE1)基因进行全长c DNA克隆和功能分析。方法基于其他植物SQE基因的同源序列设计简并引物,以太子参块根总RNA为模板,RT-PCR结合RACE技术克隆太子参SQE1基因的全长c DNA,并进行生物信息学分析。利用农杆菌叶盘转化法将SQE1基因转化烟草,研究其对烟草总三萜量的影响。结果获得太子参SQE1基因全长c DNA序列2 038 bp,该序列包含1 554 bp的开放阅读框,编码517个氨基酸,相对分子质量为5.67×104,等电点为8.8,与其他药用植物的SQE蛋白具有较高的同源性,含有FAD结合结构域和4个跨膜区域,转太子参SQE1基因的烟草的总三萜量明显高于非转基因植株。结论首次克隆获得太子参SQE1基因的全长c DNA,该基因的异源表达可一定程度提高转基因植物的总三萜量,为阐明与应用太子参三萜类成分生物合成途径提供科学依据。     

山茱萸CoDXR基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸关键酶基因1-脱氧-D-核酮糖5-磷酸还原酶(CoDXR)的全长cDNA序列,为山茱萸的进一步研究提供依据。方法以本实验室获得的山茱萸转录组数据中的转录本序列c147202_g1为模板,通过Primer Premier 5.0设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆CoDXR基因的全长cDNA序列,并通过相关的生物信息学软件对其进行相关的生物信息学分析和功能预测。结果 CoDXR基因长度为1 505 bp,ORF长度是729 bp,编码242个氨基酸。而通过SignalP4.0Server和HMMTOP对CoDXR蛋白预测分析结果可知,该蛋白不具有信号肽和跨膜区,为疏水性蛋白。系统进化树分析结果表明CoDXR蛋白与野茶树(Camelliasinensis)的DXR蛋白序列相似性最高。结论在山茱萸果实和叶片转录组测序的基础上成功克隆了山茱萸萜类合成途径中的关键酶基因CoDXR,对其进行相关的生物信息学分析,为深入研究CoDXR基因在山茱萸萜类合成途径中的功能奠定了基础。     

华细辛苯丙氨酸解氨酶基因的克隆与生物信息学分析

目的:克隆华细辛Asarum sieboldii苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)基因(AsPAL),并进行序列特征分析。方法:通过同源克隆的原理,利用RT-PCR和c DNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法,以华细辛叶片总RNA为模板,获得了该基因的c DNA全长,并通过DNAMAN软件和Ex PASy在线分析等对其进行了生物信息学分析。结果:获得AsPAL全长cDNA,Genbank登录号为KY428932,序列分析表明,所克隆的c DNA含有1个2 157 bp的完整开放阅读框,编码718个氨基酸,预测蛋白质相对分子质量为78 758 Da,理论等电点为6.24,没有跨膜区,含有PAL酶活性中心序列GTITASGDLVPLSYVAG,不含信号肽;氨基酸序列多重比较发现,AsPAL与土肉桂、葡萄、当归和杏的同源性达到80%以上。结论:获得了AsPAL c DNA全长序列,对其进行初步生物信息学分析,为进一步探究AsPAL的功能和华细辛甲基丁香酚生物合成的调控机制奠定了必要的基础。     

濒危药用植物茅苍术法呢基焦磷酸合酶基因克隆及其表达分析

目的克隆茅苍术Atractylodes lancea倍半萜类成分生物合成关键酶法呢基焦磷酸合酶(FPPS)基因全长并分析其表达规律。方法以茅苍术总RNA为模板,运用同源克隆法和RACE技术克隆茅苍术FPPS基因(Al FPPS)的c DNA全长,并进行生物信息学分析;用q RT-PCR和GC-MS分析不同生长阶段FPPS在茅苍术根茎中的表达及倍半萜类成分量变化,并分析二者的相关性。结果获得Al FPPS基因全长c DNA为1 320 bp(Gen Bank accession no.KX443242),含一个长1 029 bp的开放阅读框,编码342个氨基酸,包含5个保守功能域,其中2个富含天冬氨酸(DXXDD)。q RT-PCR及GC-MS结果显示不同时期茅苍术Al FPPS基因表达量与倍半萜类成分量呈显著正相关。结论首次克隆获得Al FPPS基因的全长c DNA,初步证明Al FPPS基因是茅苍术倍半萜类成分生物合成途径中的重要调控位点,为茅苍术倍半萜类成分生物合成途径阐明与生物工程应用提供科学依据。     

长柄石杉L-赖氨酸脱羧酶基因克隆及序列分析

目的在对长柄石杉Huperzia serrata、闽浙马尾杉Phlegariurus minchegensis、华南马尾杉Phlegariurus austrosinicus和有柄马尾杉Phlegariurus petiolatus 4种石杉科植物的L-赖氨酸脱羧酶(L-lysine decarboxylase,LDC)基因编码区进行克隆的基础上,对长柄石杉的LDC基因全长序列进行分析并预测其蛋白结构。方法采用RT-PCR技术,以石杉科植物叶片提取的总RNA为模板克隆得到LDC基因编码区序列,通过BLAST比对和MEGA5.0软件对克隆的序列进行分析。采用RACE技术获得石杉科广布种长柄石杉的LDC基因全长序列,并对其蛋白的二级结构及三维结构进行预测分析。结果克隆的4种石杉科植物LDC基因序列与数据库中被注释为编码LDC的基因序列保持高度的相似性,长柄石杉LDC蛋白与NCBI中的蛇足石杉LDC氨基酸序列相似度很高,与蕨类植物江南卷柏的同源性也较高。长柄石杉LDC基因编码区全长为1 266 bp,编码403个氨基酸,Gen Bank登录号KF040056。结论克隆得到4种石杉科植物的LDC基因,分析了长柄石杉LDC基因的全长序列并预测其蛋白结构,为进一步阐明石杉科植物石杉碱甲生物合成途径奠定基础。