宽体金线蛭5种提取方法的比较

宽体金线蛭５种提取方法的比较中国中医研究院基础理论研究所（北京１００７００）丁家欣，欧兴长，张秋海，张玲，刘振丽ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎａｍｏｎｇＦｉｖｅＤｉｆｆｅｒｅｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｎｇＭｅｔｈｏｄｓｏｆＷｈｉｔｍａｎｉａＰｉｇｒａＷｈｉｔｍａｎ￥...     

宽体金线蛭室内产茧、孵化及仔蛭饥饿研究

目的：建立宽体金线蛭室内网箱湿土养殖新模式,为中药材生产质量管理规范及规模化繁养殖提供参考依据。方法：以野外采捕的具有生殖环带的宽体金线蛭为试验材料,在室内采用网箱湿土法养殖,进行宽体金线蛭产茧、卵茧孵化及仔蛭饥饿试验研究。结果：亲蛭采用网箱湿土法养殖17d,其平均成活率为90％;产茧前具有生殖环带（土黄色）,产茧后生殖环带消失;亲蛭产卵茧后平均体重下降率达（29．94±0．01）％;产卵茧期间共收获卵茧79枚,平均产茧量为1．8枚／条,卯茧平均重量为（0．50±0．21）g／枚,平均长径和短径分别为（1．75±0．31）cm／枚和（1．10±0．18）cm／枚;卵茧在室温下（14—33℃）孵育34d,共孵出仔蛭865条,每枚卵茧孵出（11．4±2．0）条仔蛭,卵茧孵化率达92．57％。初孵仔蛭平均个体体重为（0．0205±0．0084）g。饥饿试验表明,在140d时,对照组存活11条水蛭,成活率仅22％,其平均个体体重为（0．1084±0．0877）g,仔蛭个体体重有随日龄的增加而增加趋势;饥饿组仔蛭在140d时全部死亡。结论：在适宜的条件下,采用网箱湿土养殖法,宽体金线蛭可在室内产茧,卵茧集中孵育及亲蛭和仔蛭分开饲养。     

宽体金线蛭有效成分分子量分布和纯化工艺考察

目的:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行不同分子量的含量测定和物质分离,获得最优条件。方法:采用不同分子通透性的透析膜对宽体金线蛭活性溶液进行分子量的含量测定。再分别采用大孔树脂、Q Sepharose FF、SP Sepharose FF对宽体金线蛭活性溶液进行纯化。通过考察不同纯化条件以达到分离有效物质的目的,并结合体外抗凝实验对最佳组分进行活性检测。结果:分别采用500 Da、1000 Da、3000 Da的透析膜对活性溶液进行分子量含量测定,得出500 Da的物质占37.6%;500 Da~1000 Da的物质占到18.5%;1000 Da~3000 Da的物质占28.1%;3000 Da物质占到15.7%。采用大孔树脂DA201-C处理得出50%乙醇洗脱液具有很好的活性。再采用Q Sepharose FF、SP Sepharose FF分别对宽体金线蛭活性溶液进行处理,采用不同洗脱剂进行洗脱然后进行活性验证得出1.0%Na Cl的p H值=8.5的Tris缓冲溶液洗脱组分活性比较强。结论:采用不同方法对宽体金线蛭活性溶液进行研究,获得较纯的活性组分,为后期的继续研究做好基础。     

宽体金线蛭的特异性PCR分子鉴定

[目的] 实验旨在通过寻找宽体金线蛭单核苷酸多态性（SNP）位点,设计宽体金线蛭的特异性鉴别引物,建立宽体金线蛭特异性聚合酶链式反应（PCR）检测方法,实现对宽体金线蛭及其常见混伪品的快速鉴别。[方法] 通过比对宽体金线蛭与其常见混伪品的细胞色素C氧化酶亚基I（COI）序列,寻找宽体金线蛭COI基因序列内SNP位点,设计特异性鉴别引物。[结果] 进行PCR后仅宽体金线蛭能够扩增得到149 bp的条带,混伪品不能扩增出明显目的条带。向扩增产物中加入SYBR Green I核酸染料染色,宽体金线蛭样品在紫外灯下显黄绿色荧光,混伪品不显荧光。[结论] 该方法能够准确快速鉴别宽体金线蛭与其常见混伪品,为中药材市场上宽体金线蛭的快速鉴别提供技术支持。     

宽体金线蛭不同炮制品抗炎作用及使用方法的药理研究

比较了宽体金线蛭3种炮制品,对小鼠急性炎症模型的抗炎作用、免疫吞噬能力。以体内、外抗凝及体内抗栓作用为指标,比较了供试品不同使用方法的活血作用,为全面认识宽体金线蛭的药理作用及合理使用方法,提供了初步实验依据。     

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的：采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法：利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果：经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为–427.506 kJ·mol^–1。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论：利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,...     

蚂蟥与螺蛳耗氧率、窒息点相关性及最适投喂方式的研究

采用静水呼吸室法测定不同质量蚂蟥和螺蛳的耗氧量、耗氧率和窒息点,生物量测定法研究不同投喂方式对蚂蟥生长的影响。结果表明:25℃条件下,蚂蟥和螺蛳耗氧量与质量呈正相关(P0.05),窒息点随质量增大而增大(P0.05)。蚂蟥耗氧率与质量呈负相关,螺蛳耗氧率随质量增大呈先增大后减小趋势。投喂方式对蚂蟥终末质量、SGR,WGR和死亡率影响不显著,对进食比例影响显著(P0.05)。蚂蟥最适投喂频率为3 d投喂1次,应根据蚂蟥和螺蛳各阶段耗氧量及窒息点,结合养殖密度、水体面积以及换水频率,科学合理计算出螺蛳的投喂量。     

不同基质和亲本密度对宽体金线蛭繁殖性能的影响北大核心

目的:探明不同基质和亲本密度对宽体金线蛭繁殖性能的影响,为促进宽体金线蛭规模化人工繁殖提供参考依据。方法:分别设置5种基质处理组:土壤组(A)、稻草组(B)、牛粪组(C)、土壤与稻草混合组(体积1∶1,D)、土壤与牛粪混合组(体积1∶1,E)和6个亲本密度处理组:30、60、90、120、150、180尾/m^(2),经过25 d的繁殖以及15 d的卵茧孵化后,观察其亲本存活率、产茧率、卵茧规格、卵茧的孵化率和孵化量等指标的变化。结果:不同基质对宽体金线蛭亲本存活率、产茧率、卵茧的孵化量有显著性影响(P<0.05),但对卵茧规格和卵茧的孵化率无显著性影响(P>0.05),其中基质D组亲本存活率(100.00%)和产茧率(3.70枚/尾)最高,基质B组卵茧的孵化量(32.2尾)最高。不同亲本密度对宽体金线蛭亲本存活率、产茧率有显著性影响,但对卵茧规格无显著性影响,其中,亲本密度30、60尾/m^(2)时,亲本存活率、产茧率最高(P<0.05)。结论:土壤与稻草(体积1∶1)混合基质是宽体金线蛭最适合的繁殖基质,稻草是其卵茧最适合的孵化基质。从经济效益角度考虑,宽体金线蛭亲本放养密度应以60尾/m^(2)较为适宜其人工繁殖。     

宽体金线蛭仿生酶解液物质基础分析

目的 对宽体金线蛭仿生酶解液进行物质基础分析。方法 采用化学定性和定量的方法,对固形物、无机盐、肽、氨基酸等物质进行含量测定,并进行核苷特征图谱及肽特征图谱研究。结果 通过对15批宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱研究,确定固形物、无机盐、肽、游离氨基酸、总氨基酸的质量浓度分别为75.5～79.7、10.7～12.7、42.6～49.4、1.9～3.1、49.4～51.6 mg·mL^–1。建立宽体金线蛭仿生酶解液核苷特征图谱,共标定和归属了4个特征峰;建立宽体金线蛭仿生酶解液肽特征图谱,共标定6个特征峰。结论 建立了宽体金线蛭仿生酶解液中各物质含量测定及特征图谱的研究方法,简便快捷、重复性好,可用于对其进行质量控制。     

微山湖地区宽体金线蛭的群体考察与产茧后药材质量评价

目的:建立科学的宽体金线蛭种蛭筛选原则,并对产茧后药材进行质量评价。方法:从微山湖地区采集野生宽体金线蛭1193条,对体质量和生殖环带发育等群体特征进行考察。将种蛭分为10、15、20 g 3个试验组,建立卵茧成熟度观察方法以判断适宜的挖茧时机,通过产茧数、茧体积、出苗数等指标考察体质量对宽体金线蛭繁殖性能的影响。依照2015年版《中华人民共和国药典》对产茧后水蛭药材的性状和抗凝血酶活性进行质量评价。结果:微山湖地区宽体金线蛭野生种群的体质量普遍较小,15 g及以上的种蛭仅占样本群体的19.53%;宽体金线蛭的繁殖性能随种蛭体质量的增加而显著提高,20 g试验组的产茧数(5.9个)和出苗数(37.3条)分别是10 g试验组的1.59倍和1.45倍。产茧后种蛭的死亡率和体质量损失率可高达37%和59%,药材厚度仅为产茧前的49%～72%,腥味散失严重、脆度下降,但产茧前后抗凝血酶活性变化不大,均为3～5 U·g~(-1)。结论:微山湖地区野生宽体金线蛭的种群有退化趋势,建议使用15 g及以上的种蛭进行繁殖生产。产茧后药材的商品规格和等级较低,不适宜作为饮片直接用于临床。     

蚂蟥冬眠临界温度的研究

采用生物学观测法、静水法、3,5-二硝基水杨酸比色法、对棕榈酸硝基苯酯(ρ-NPP)比色法、福林-酚法观测和测定不同温度下蚂蟥生物学特征、耗氧量、耗氧率、消化道淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶的活性。结果表明,随着温度的降低,蚂蟥活动减弱、进食减少,4℃后不食不动,头部和尾部弯曲呈"弯月"状;耗氧量、耗氧率以及消化道酶活性随温度下降逐渐下降,10℃后下降趋势减缓,4℃后趋于稳定,不随温度降低而变化;在4℃状态40 d过程中,淀粉酶变化不显著,脂肪酶、蛋白酶活性在20d时有所降低,其中脂肪酶下降后又轻微上升后保持较低水平。结论,4℃为蚂蟥冬眠的临界温度,"弯月"状可作为其冬眠状态的标志。     

水蛭及其养殖基地农药与重金属残留分析

目的：通过对水蛭药材、养殖基地土壤、养殖用水的重金属与农药残留的比较研究,为水蛭的安全规范化生产提供依据和实践。方法:采用等离子发射光谱仪、原子荧光分光光度计和气相色谱仪对水蛭、基地土壤和养殖用水的重金属与农药残留进行了比较分析。结果与结论:除水蛭药材中铅超出国家现行有关标准外,水蛭药材,养殖基地土壤和养殖用水的六六六、DDT和重金属残留各项指标均符合国家标准规定。建议今后在制订国家有关标准时将类似水蛭类等动物的安全限量单独列出。     

温度对蚂蟥生长及摄食规律影响的初步研究

目的：观察蚂蟥在不同温度下的生长情况及其摄食规律。方法：比较在不同温度条件下不同体重蚂蟥生长情况,以及蚂蟥在24 h之内的摄食规律。结果与结论：蚂蟥生长的适宜温度是15～25 ℃,其饱食量随着体重增大和温度的升高而增加。摄食率随个体增大而有所降低。在24 h之内蚂蟥有2个摄食高峰。     

温度和体重对蚂蟥人工繁殖影响的研究

目的：确定蚂蟥的最佳产卵温度、体重以及孵化的最适温度。方法：在不同温度、体重条件下观察蚂蟥产卵和孵化。结果与结论：蚂蟥产卵和孵化的最适温度是25 ℃,产卵的最佳体重为20 g左右；温度能影响蚂蟥产卵前后的体重,而体重对其的影响不明显；当卵重在0.1～2.0 g时与孵出量成正比,当卵重大于2.0 g时孵出量反而有所下降。     

不同月龄蚂蟥内在品质及最佳采收期研究

目的:比较不同月龄蚂蟥内在品质及生长的差异,为其药材质量控制及最佳采收期的确定提供理论依据.方法:水分、醇溶性浸出物、总灰分、酸不溶性灰分、抗凝血酶活性测定都参考20HD5年版<中国药典>;结果:各月龄采集的蚂蟥其品质均符合国家药典标准,其中醇溶性浸出物含量以9月龄蚂蟥最高,6月龄的其次,而且9月龄蚂蟥与4月龄、7月龄、11月龄的蚂蟥有显著性差异(P＜0.05);抗凝血酶活性含量以6月龄蚂蟥最高,10月龄其次,而且6月龄与4月龄、5月龄有显著性差异(P＜0.05),与其他月龄无显著性差异;6月龄的蚂蟥干重最高,与其他月份采集的有显著性差异(P＜0.05).结论:江浙一带人工养殖的蚂蟥最佳采收期为11月份(即6月龄).     

蚂蟥内脏器官和皮肤的组织结构观察

目的：通过解剖观察蚂蟥主要内脏器官组织和皮肤结构,为蚂蟥类品种鉴别及其生理功能等方面研究提供依据。方法：通过石蜡组织切片和显微摄影的方法,对蚂蟥内脏器官,包括口、咽、食管、嗉囊、肠、直肠、侧盲囊、精巢、储精囊、输精管、射精球、前列腺、皮肤等进行解剖观察分析。结果和结论：明确其消化系统、生殖系统的器官和皮肤的组织结构和作用以及皮肤黏液细胞的类型与分布。为进一步研究蚂蟥的生活习性、繁殖习性和人工养殖环境提供参考依据。     

蚂蟥酶解工艺研究

目的确定蚂蟥的最佳酶解工艺。方法选取活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)3种抗凝活性指标,以外翻肠囊实验筛选蚂蟥酶解物在肠吸收前后最佳活性测定指标。采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、复合酶(先胃蛋白酶后胰蛋白酶)对蚂蟥进行酶解,以筛选得到的最佳活性指标考察酶的种类、酶底比、酶解时间以及酶解温度对蚂蟥酶解工艺的影响。结果 TT是测定蚂蟥酶解物抗凝活性的最佳指标,采用胰蛋白酶对蚂蟥酶解可获得高活性的酶解产物,最佳的酶解条件为温度73℃,酶底比10%,酶解时间8 h。结论 TT作为抗凝指标进行酶解工艺考察,可反映整个凝血过程,结果更可靠,且该法操作简便,灵敏度高。所优选的酶解工艺简单可行,可为蚂蟥合理提取提供依据。     

水蛭的化学成分研究

[目的]研究中药水蛭的化学成分。[方法]采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20等色谱方法进行分离纯化,依据理化性质及波谱数据进行结构鉴定。[结果]从中药水蛭的95%乙醇提取物中分离得到9个化合物,分别鉴定为:吲哚-3-甲酸-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)、3-吲哚-甲醛(2)、腺苷(3)、2-羟基嘌呤核苷(4)、尿嘧啶核苷(5)、腺嘌呤(6)、尿嘧啶(7)、黄嘌呤(8)和2-哌啶酮(9)。[结论]首次从该药材中分离得到9种化合物。