黄芪甲苷对哮喘模型小鼠呼吸道炎症及氧化应激反应的影响

目的 观察黄芪甲苷对哮喘模型小鼠呼吸道炎症及氧化应激反应的影响,探讨其作用机制.方法 按随机数字表法将50只小鼠随机分为正常对照组,模型组,黄芪甲苷低、中、高剂量组,每组10只.除正常对照组外,其余各组小鼠用卵蛋白致敏和雾化激发的方式建立哮喘模型.于造模第14天开始给药,于雾化吸入鸡卵白蛋白溶液之前1h,低、中、高剂量组分别灌胃黄芪甲苷溶液25、50、100mg/kg,正常对照组与模型组灌胃等体积生理盐水,1次/d,连续给药14d.造模第27天,进行气道高反应性激发试验.造模第28天取材,采用瑞氏染色检测小鼠支气管肺泡灌洗液中的细胞总数、嗜酸粒细胞计数及百分比,采用ELISA法检测小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-6、IL-13含量;检测肺组织MDA、GSH-Px、SOD活性.结果 与模型组比较,黄芪甲苷中、高剂量组支气管肺泡灌洗液中白细胞总数[(8.58±0.92)×105个/ml、(2.10±0.25)×105个/ml比(17.28±2.34)×105个/ml]、嗜酸粒细胞数[(3.17±0.37)×105个/ml、(0.36±0.03)×105个/ml比(10.35±1.06)×105个/ml]及百分比[(36.67±3.96)%、(14.71±2.04)%比(60.82±5.88)%]减少(P<0.01);IL-6[(80.81±13.42)pg/ml、(77.14±12.73)pg/ml比(118.08±20.41)pg/ml]、IL-13[(120.59±18.38)pg/ml、(65.12±13.81)pg/ml比(168.11±26.43)pg/ml]含量降低(P<0.01);肺组织MDA含量[(53.04±5.08)nmol/mg、(42.90±3.91)nmol/mg比(69.03±7.01)nmol/mg]降低,GSH-Px[(4.59±0.41)μmol/g、(6.24±0.58)μmol/g比(2.71±0.26)μmol/g]、SOD活性[(5.98±0.56)U/g、(8.29±0.81)U/g比(3.88±0.39)U/g]升高(P<0.01).结论 黄芪甲苷可有效改善小鼠的哮喘状态,其作用机制与抑制气道内炎症反应及氧化应激反应有关.     

姜黄素对血管紧张素Ⅱ刺激大鼠肾小管上皮细胞TGF-β1及smad7表达的影响

目的：观察姜黄素对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)刺激大鼠肾小管上皮细胞TGF-β1及smad7表达的影响,探讨姜黄素改善肾间质纤维化的作用机制。方法培养大鼠肾小管上皮细胞,按随机数字表法分为空白组,AngⅡ对照组,姜黄素低、中、高剂量组。除空白组外,于其余各组细胞培养液中加入10-8mol/L的AngⅡ溶液进行干预;姜黄素低、中、高剂量组分别加入2.5、5.0、10.0μmol/L姜黄素溶液进行干预。干预48 h后,采用Western blot检测各组肾小管上皮细胞TGF-β1、smad7蛋白表达,采用RT-PCR检测肾小管上皮细胞TGF-β1、smad7 mRNA表达。结果与空白组比较,AngⅡ对照组肾小管上皮细胞TGF-β1蛋白[(0.23±0.03)比(0.16±0.01)]、TGF-β1 mRNA[(1.89±0.20)比(1.00±0.00)]表达升高(P＜0.05),smad7蛋白[(0.19±0.03)比(0.24±0.02)]、smad7 mRNA[(0.48±0.05)比(1.00±0.00)]表达降低(P＜0.05);与 AngⅡ对照组比较,姜黄素低、中、高剂量组 TGF-β1蛋白[(0.18±0.02)、(0.17±0.02)、(0.16±0.03)比(0.23±0.03)]、TGF-β1 mRNA[(1.58±0.11)、(1.34±0.16)、(0.97±0.19)比(1.89±0.20)]表达下降(P＜0.05),smad7蛋白[(0.28±0.04)、(0.31±0.03)、(0.34±0.04)比(0.19±0.03)]、smad7 mRNA[(0.68±0.07)、(0.80±0.06)、(0.98±0.09)比(0.48±0.05)]表达升高(P＜0.05)。结论姜黄素可对抗AngⅡ介导的肾间质纤维化从而发挥肾脏保护作用,其作用机制可能与降低TGF-β1蛋白及其mRNA表达、上调smad7蛋白及其mRNA表达有关。     

槲皮素对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响

目的 研究槲皮素对人结肠癌HT-29细胞凋亡的影响,并探讨其对肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor factor 6,Traf6)/转化生长因子β激活酶1(transforming growth factor-βactivated kinase-1,TAK1)信号通路的调控作用.方法 将细胞按随机数字表法分为对照组、16μg/ml槲皮素组、Traf6抑制剂组、16μg/ml槲皮素+Traf6抑制剂组,对照组常规培养,其余各组加入16μg/ml槲皮素和/或Traf6抑制剂20 nmol/L进行干预.培养24 h,采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,采用免疫印迹法检测Traf6/TAK1信号通路蛋白及caspase-3、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)及Bcl-2表达,采用RT-PCR技术检测Traf6 mRNA表达.结果 与16μg/ml槲皮素组比较,16μg/ml槲皮素+Traf6抑制剂组Traf6[(0.59±0.03)比(0.96±0.04)]、p-TAK1[(0.43±0.02)比(0.72±0.04)]、caspase-3[(0.59±0.03)比(0.70±0.04)]、Bax[(0.48±0.03)比(0.67±0.04)]表达降低,Bcl-2[(0.54±0.03)比(0.44±0.02)]表达升高(P<0.05),Traf6 mRNA[(0.38±0.24)比(0.82±0.08)]表达降低(P<0.05).结论 槲皮素可诱导人结肠癌HT-29细胞凋亡,其作用机制可能与激活Traf6/TAK1信号通路有关.     

益气健脾解毒方含药血清对奥沙利铂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

目的 探讨益气健脾解毒方含药血清对奥沙利铂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡及凋亡抑制基因(Survivin)、caspase-3及caspase-9表达的影响.方法 运用血清药理学方法制备大鼠益气健脾解毒方含药血清,将人肝癌HepG2细胞按随机数字表法分为中药组、化疗组、联合组和空白组,空白组加入10%空白血清;化疗组加入2μg奥沙利铂和10%空白血清;联合组加入2μg奥沙利铂和10%益气健脾解毒方含药血清;中药组加入10%益气健脾解毒方含药血清.采用MTT法检测细胞抑制率,采用Western blot法及RT-PCR法检测各组细胞Survivin、caspase-3、caspase-9蛋白及基因表达.结果 与空白组比较,中药组、化疗组及联合组人肝癌HepG2细胞抑制率明显增高(P<0.05).与化疗组及中药组比较,联合组Survivin[(0.151±0.054)比(0.288±0.089)、(0.375±0.063)]蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01),Survivin mRNA[(0.205±0.091)比(0.487±0.073)、(0.725±0.092)]表达下调(P<0.05或P<0.01);caspase-3[(0.821±0.079)比(0.634±0.098)、(0.487±0.102)]、caspase-9蛋白[(0.901±0.047)比(0.709±0.054)、(0.402±0.012)]表达上调(P<0.05或P<0.01),caspase-3 mRNA[(1.928±0.226)比(1.564±0.195)、(1.287±0.312)]、caspase-9 mRNA[(2.063±0.517)比(1.536±0.084)、(1.019±0.182)]表达均上调(P<0.05或P<0.01).结论 益气健脾解毒方对奥沙利铂诱导HepG2细胞凋亡机制可能通过增强抑制Survivin及促进Caspase-3及caspase-9蛋白表达发挥作用.     

松脂醇二葡萄糖苷对人皮肤成纤维细胞胶原蛋白分泌机制的研究

目的：观察松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside, PDG)对人皮肤成纤维细胞ESF-1细胞胶原蛋白分泌的基因调控作用,探讨PDG对烧伤皮肤的修复机制。方法体外培养细胞按随机数字表法分为空白组,雌二醇组,PDG高、中、低剂量组。PDG高、中、低剂量组分别加入100、10、1μmol/L的PDG溶液,雌二醇组加入10-3μmol/L的雌二醇。采用MTT法检测细胞增殖活性。采用RT-PCR技术测定细胞中Ⅰ型胶原蛋白(collagen I, Col I)、Ⅲ型胶原蛋白(ColⅢ)、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase, TIMP)-1、TIMP-2、MMP-1mRNA表达水平。结果与空白组比较,雌二醇组、PDG 中剂量组ESF-1细胞增殖率[(0.559±0.027)、(0.552±0.034)比(0.489±0.027)]升高(P＜0.05);雌二醇组与PDG中、低剂量组细胞ColⅠ[(0.958±0.021)、(0.929±0.031)、(0.916±0.015)比(0.844±0.022)]、Col Ⅲ[(0.783±0.038)、(0.918±0.021)、(0.855±0.017)比(0.678±0.024)]、TIMP-1[(0.939±0.025)、(0.889±0.036)、(0.853±0.015)比(0.780±0.023)]、TIMP-2[(0.507±0.024)、(0.655±0.037)、(0.572±0.025)比(0.405±0.062)]mRNA 表达水平升高(P＜0.05或 P＜0.01), MMP-1[(0.343±0.038)、(0.407±0.046)、(0.435±0.037)比(0.519±0.041)]mRNA表达水平下降(P＜0.05或P＜0.01)。结论 PDG可提高ESF-1细胞的增殖活性,促进相关胶原蛋白和TIMP的表达,抑制MMP的表达,减少胶原的降解,从而发挥修复烧伤皮肤的作用。     

祖师麻主要成分抗炎活性的体外研究

目的 观察祖师麻主要成分的抗炎活性.方法 分离提取祖师麻化学成分川木香醇D、左旋松脂酚、瑞香新素、西瑞香素、黄瑞香苷A、瑞香素、黄瑞香苷B,采用CCK-8实验进行细胞毒性评价.将细胞按随机数字表法分为对照组、模型组和化合物组.对照组和模型组各加入50μl培养液,化合物组分别加入50.00、25.00、12.50、6.25、3.12μg/ml西瑞香素、黄瑞香苷A、黄瑞香苷B溶液,模型组和化合物组再加入4μg/ml脂多糖50μl,刺激24 h.采用Griess试剂法测定NO释放量,采用ELISA法检测TNF-α分泌量.结果 西瑞香素、黄瑞香苷A、黄瑞香苷B在50μg/ml下对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞具有较弱的细胞毒性,而其他化合物细胞毒性作用较明显.与模型组比较,12.50、25.00、50.00μg/ml黄瑞香苷B可抑制RAW264.7细胞NO[(271.86±20.92)%、(256.48±20.92)%、(199.31±15.16)%比(358.62±28.64)%]、TNF-α[(647.87±115.79)%、(618.42±87.52)%、(588.33±87.94)%比(1035.06±58.29)%]生成(P<0.05或P<0.01);25.00、50.00μg/ml黄瑞香苷A可抑制RAW264.7细胞NO[(234.99±34.28)%、(167.36±25.76)%比(358.62±28.64)%]、TNF-α[(691.76±60.37)%、(534.01±41.60)%比(1035.06±58.29)%]生成(P<0.05或P<0.01);12.50、25.00、50.00μg/ml西瑞香素可抑制RAW264.7细胞NO[(283.89±36.69)%、(243.08±48.19)%、(225.92±33.67)%比(358.62±28.64)%]、TNF-α[(713.77±121.96)%、(670.62±18.70)%、(599.62±68.62)%比(1035.06±58.29)%]生成(P<0.05或P<0.01).结论 黄瑞香苷A、黄瑞香苷B和西瑞香素具有抗炎作用,可降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞NO释放量和TNF-α分泌量,发挥抗炎作用.     

大豆素对尿毒症大鼠肾组织TGF-β1蛋白及mRNA表达的影响

目的：观察大豆素对尿毒症大鼠肾组织细胞外基质的影响,并探讨其作用机制。方法采用随机数字表法将26只大鼠分为假手术组8只、模型组8只、大豆素组10只。除假手术组外,其余各组采用5/6肾切除术制备尿毒症大鼠模型。大豆素组于造模后次日灌胃15 mg/kg大豆素溶液,假手术组、模型组灌胃等体积生理盐水。1次/d,连续给药8周。检测各组造模前、造模后第4、8周尿蛋白及生化指标。第8周观察各组大鼠肾组织病理改变。采用免疫组化法检测肾组织Ⅳ型胶原蛋白、纤连蛋白表达。采用RT-PCR法、Western blot法检测肾组织TGF-β1蛋白及mRNA表达。结果造模后第8周,与模型组比较,大豆素组尿蛋白排泄量[(22.54±3.47)mg/24 h比(31.28±3.78)mg/24 h]减少(P＜0.01),血清BUN[(12.09±0.59)mmol/L比(14.26±0.71)mmol/L]、SCr[(75.20±3.39)μmol/L比(90.25±2.71)μmol/L]水平降低(P＜0.01)。肾小球Ⅳ型胶原蛋白[(16.33±2.14)%比(24.68±3.97)%]、纤连蛋白[(19.17±2.68)比(29.35±4.15)]表达降低(P＜0.01),肾小球硬化明显减轻。肾组织TGF-β1 mRNA[(0.37±0.06)比(0.64±0.08)]、TGF-β1蛋白[(0.28±0.09)比(1.40±0.13)]表达降低(P＜0.05)。结论大豆素可减少尿毒症大鼠细胞细胞外基质的蓄积,对肾脏具有保护作用,其机制可能与下调TGF-β1表达有关。     

川芎嗪与黄芪甲苷配伍对人脐静脉内皮细胞血管生成的作用及机制探讨

目的研究川芎嗪与黄芪甲苷配伍对缺氧诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖的影响及机制。方法建立HUVECs缺氧损伤模型,将细胞分为5组,对照组、模型组、川芎嗪(80μg/mL)组、黄芪甲苷(40μg/mL)组及川芎嗪(80μg/mL)+黄芪甲苷(40μg/mL)组,MTT法检测川芎嗪、黄芪甲苷及其配伍对缺氧损伤HUVECs增殖的影响;免疫组化法检测缺氧损伤HUVECs细胞VEGF、Ang-II蛋白表达,Western blotting检测VEGF和Ang-II蛋白的表达,RT-PCR检测VEGF和Ang-II mR NA表达。结果与模型组相比,川芎嗪与黄芪甲苷均能提高细胞存活率,川芎嗪与黄芪甲苷配伍组具有极显著差异(P0.001);川芎嗪与黄芪甲苷配伍提高VEGF、Ang-II蛋白表达。同时,川芎嗪与黄芪甲苷配伍组能上调VEGF和Ang-II mR NA的表达(P0.001)。结论川芎嗪与黄芪甲苷配伍可能通过增加血管生成靶向因子VEGF和Ang-II的表达发挥促进血管生成的作用。     

虎杖苷对脑缺血再灌注大鼠海马凋亡相关蛋白表达的影响

目的 观察虎杖苷对脑缺血再灌注大鼠海马caspase-8、Fas相关死亡域样白细胞介素1β转化酶抑制蛋白(Fas-associated death domain-like IL-1 beta converting enzyme inhibitory protein,FLIP)表达的影响,探讨虎杖苷对脑缺血再灌注损伤的保护机制.方法 将30只大鼠随机分为假手术组、模型组、虎杖苷组,每组10只.适应性喂养后7 d开始给药,虎杖苷组大鼠灌胃虎杖苷溶液15 mg/kg,假手术组、模型组灌胃等体积生理盐水,1次/d.连续给药后7 d,采用线栓法建立大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血模型.造模后继续给药3 d.脑缺血再灌注后72 h,采用TUNEL法观察各组大鼠脑组织神经细胞凋亡情况;采用免疫组化染色法观察各组大鼠海马caspase-8、FLIP蛋白表达.结果 缺血再灌注72 h,与模型组比较,虎杖苷组海马CA1区凋亡细胞[(23.87±3.14)个比(56.69±9.21)个]减少(P<0.01);caspase-8蛋白[平均灰度值为(148.78±6.82)比(89.61±7.76)]表达降低、FLIP蛋白[平均灰度值为(127.60±8.52)比(150.22±8.53)]表达增高(P<0.01).结论 虎杖苷可减少脑缺血再灌注大鼠海马神经细胞凋亡,其机制可能与抑制caspase-8蛋白表达,促进FLIP蛋白表达有关.     

藏药十八味党参丸提取物对脂多糖诱导的RAW264.7细胞Akt/p38MAPK信号通路及M1/M2极化影响的探究

目的探究藏药十八味党参丸(TEP)的提取物调控脂多糖(LPS)诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7的炎性反应及M1/M2极化分型的探究。方法 Alarmarblue法评价RAW 264.7活力;荧光酶标定量分析细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平;Griess法检测上清液中细胞一氧化氮(NO)的分泌情况;流式细胞术检测表面标志物CD206和CCR7蛋白的表达;RT-qPCR法检测细胞白介素(IL)-1β、IL-6、趋化因子2(CCL2)、一氧化氮合酶(iNOS)、精氨酸酶(ARG)-1和肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因表达的情况;Western blot法检测TEP调控细胞合成iNOS、蛋白激酶B(Akt)和p38丝裂原活化激酶(p38MAPK)信号通路相关蛋白的表达情况。结果与模型组相比,TEP组一定程度上提高了RAW 264.7的细胞活性,同时抑制了LPS诱导的细胞内ROS水平的升高。经过LPS刺激后,模型组NO表达量显著升高,在24 h后表达量达到最高,而TEP组NO表达显著降低。模型组的CCR7表达升高,CD206表达下降,TEP干预后CCR7表达下降,CD206表达升高,且趋势呈现浓度依赖。与模型组相比,TEP组的IL-1β、IL-6、CCL2、iNOS、ARG和TNF-α基因表达以及iNOS、Akt和p38MAPK蛋白表达水平均显著降低。结论 TEP能够抑制细胞内ROS水平,降低NO分泌和炎性基因的表达水平,抑制细胞的M1表型,促进M2表型,其机制可能与细胞内iNOS、Akt和p38MAPK信号通路蛋白表达被抑制有关。     

活性多酚化合物LM49对RAW264.7巨噬细胞极化的影响

目的初步探讨LM49(2,4'三羟基-5,2'-二溴二苯甲酮)对脂多糖(LPS)联合干扰素γ(IFN-γ)诱导的小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)M1/M2极化的影响及其调控机制。方法四曱基偶氮唑蓝(MTT)法测定LM49对细胞活力的影响;流式细胞术、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Westem-blot法测定LM49(5,10,20μmol·L^-1)与LPS/INF-γ共同作用于RAW264.7细胞后,巨噬细胞亚型标志物的表达情况及对核因子(NF)-κB和JAK/STAT信号通路的影响。结果与LPS/INF-γ造模组相比,LM49显著抑制CD16/32^+细胞数及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素(IL)4和肿瘤坏死因子(TNF)-αmRNA的表达,升高CD206^+细胞数及Arg-1和IL-10 mRNA的表达,且降低巨噬细胞M1/M2的比值;Westem-blot法验证LM49可显著降低TLR4、Myd88、NF-κB和STAT1蛋白的表达量,同时抑制p-JAK2和p-STATl蛋白磷酸化水平。结论LM49通过抑制TLR4-Myd88-NF-κB和JAK2-STAT1信号通路,抑制巨噬细胞Ml型极化及促进巨噬细胞M2型极化,调节巨噬细胞M1/M2的平衡。     

青心酮抑制脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞凋亡的机制探讨

目的阐明青心酮对脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞凋亡抑制作用的可能机制。方法采用LPS刺激小鼠RAW264.7巨噬细胞株为炎症模型,采用RT-PCR检测血红素氧合酶-1(HO-1)mRNA,血红蛋白结合法测定一氧化碳(CO)的相对水平,流式细胞仪结合细胞形态学检测观察细胞凋亡。结果1×10-5mol/L青心酮作用24h,在增加细胞HO-1mRNA及CO水平的同时,可使LPS诱导的巨噬细胞凋亡率显著下降(P<0.01);加入牛血红蛋白清除CO后,青心酮对LPS所致细胞凋亡的抑制率由(63.2±3.8)%降低为(45.1±5.3)%,差异显著(P<0.01)。结论青心酮可抑制LPS所致的小鼠RAW264.7巨噬细胞的凋亡,此作用部分由HO-1/CO系统所介导。     

Effects of taraxasterol on iNOS and COX-2 expression in LPS-induced RAW 264.7 macrophages

Ethnopharmacological relevance

Taraxasterol was isolated from the Chinese medicinal herb Taraxacum officinale which has been frequently used as a remedy for inflammatory diseases. Our previous study has shown that taraxasterol inhibited lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) and prostaglandin E₂ (PGE₂) production in RAW 264.7 macrophages. To elucidate the underlying mechanism responsible for these effects, in the present study, we investigated the effects of taraxasterol on inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase-2 (COX-2) expression, and mitogen-activated protein kinases (MAPKs) signaling pathway in LPS-induced RAW 264.7 macrophages.

Materials and methods

RAW 264.7 cells were pretreated with 2.5, 5 and 12.5 μg/ml of taraxasterol 1 h prior to treatment with 1 μg/ml of LPS. The mRNA expression levels of iNOS and COX-2 were examined by RT-PCR. The protein expression levels of iNOS and COX-2, and the phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), p38 and c-Jun N-terminal kinase (JNK) MAPKs were measured by Western blot.

Results

The mRNA and protein expression levels of iNOS and COX-2 were inhibited by taraxasterol in a concentration-dependent manner. Further studies revealed that taraxasterol suppressed the phosphorylation of ERK1/2 and p38 in LPS-induced RAW 264.7 macrophages.

Conclusions

These results indicate that taraxasterol inhibits iNOS and COX-2 expression by blocking ERK1/2 and p38 MAPKs signaling pathway.     

金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染RAW264.7细胞Toll样受体3表达的调控作用

目的:通过研究金欣口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)活化诱导的Toll样受体3(TLR3)的干预作用,探讨其治疗RSV肺炎可能的免疫学机制。方法:RSV感染体外培养的RAW264.7细胞,采用金欣口服液含药血清进行干预,并设利巴韦林阳性对照,24h后收集细胞,Real time RT-PCR法测定TLR3 mRNA的表达变化;激光共聚焦显微镜观察免疫荧光细胞化学染色法处理的各组细胞TLR3表达水平;ELISA法检测各组细胞培养上清中白细胞介素-6(IL-6)含量,在核酸及蛋白水平探讨金欣口服液含药血清抗RSV感染的作用机制。结果:RSV感染RAW264.7细胞后24h,细胞中TLR3 mRNA和蛋白表达水平以及细胞培养上清中IL-6表达明显升高(P0.01),而金欣组TLR3及IL-6表达均显著低于RSV感染组(P0.01,P0.05),且效果优于利巴韦林组(P0.01,P0.05)。结论:金欣口服液含药血清能下调RSV活化诱导的TLR3及其下游炎症因子IL-6的高表达,推测其为金欣口服液抗RSV感染的机制之一。