基于DNA barcoding（条形码）技术的中药材鉴定

DNA条形码（DNA barcoding）是根据对一段标准的DNA序列的分析来鉴定物种,已成为生物物种鉴定的新方向,受到世界40多个国家130多个组织中传统生物分类学家、分子生物学家和生物信息学家等多学科专家的关注。本文通过介绍DNA条形码的产生、发展和研究现状,探讨其在中药材鉴定中应用的技术方法、技术路线、关键问题以及应用范围,并展望了DNA条形码在中药材鉴定中的应用前景。     

DNA条形码技术在中药鉴定中的应用进展

DNA条形码(DNA barcoding)技术利用标准的一个或多个DNA片段对物种进行鉴定,是近年来生物学研究的热点领域,也是生物学发展最迅速的方向之一。总结了植物DNA条形码研究的发展历程及最新进展,重点讨论了超级条形码在近缘物种鉴别中的应用前景,以及DNA条形码在中药材基原物种鉴定、道地药材鉴别以及中药材溯源系统研究中的应用,并强调了植物DNA条形码在中药资源评价、保护和可持续利用中的重要地位和作用,为药用植物DNA条形码研究提供新的思路。     

中药材DNA条形码鉴定研究进展

DNA条形码技术给中药鉴定学发展带来新的机遇,中药材DNA条形码鉴定数据库及中草药DNA条形码生物鉴定体系的创建有利于推进中药鉴定标准化和国际化。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则已纳入《中华人民共和国药典》2010版第三增补本,为中药材基原物种鉴定提供强有力的科技支撑,将在中药材及中成药流通监管、道地药材鉴别、保健食品和食品质量安全控制等领域发挥重要作用。将中药材DNA条形码分子鉴定法与中国药典规定的其他鉴别方法相结合,能够对药品质量进行综合评价与有效监控。     

基于DNA条形码的中药材种子种苗鉴定研究——以重楼为例

目的:以重楼为例,探讨DNA条形码技术在中药材种子种苗鉴定中的应用,为中药材种子种苗基原物种鉴定提供技术参考。方法:采用DNA条形码技术,建立重楼中国药典物种标准条形码数据库,通过序列比对、遗传距离比较和系统NJ树构建,研究DNA条形码在种子种苗鉴定中的应用。结果:云南重楼和七叶一枝花种内遗传距离分别小于种间遗传距离,ITS条形码可有效鉴别正品重楼及其混伪品的种子种苗。结论:DNA条形码技术是中药材种子种苗鉴定的有效手段,应用前景广阔。     

DNA条形码技术在动物类中药鉴定中的应用研究进展

DNA条形码鉴定技术可以实现对物种进行快速鉴定,本文从肌肉类中药材、贝壳类中药材、角骨类中药材等方面对DNA条形码技术在动物类中药鉴定中的应用研究现状与展望展开综述,DNA条形码数据库是动物类中药材分子鉴定的重要参考依据,应完善基础数据库建设以及相关标准的制定,推动动物类中药材分子鉴定和产业化的深入发展。     

DNA条形码等分子鉴定技术与动植物类中药材的鉴定

中药材鉴定是控制中药质量、确保用药安全与效果的首要环节。DNA分子鉴定是从基因层面上进行中药材鉴别的手段,准确率高。DNA分子鉴定包括电泳技术、免疫技术、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(ISSR)及DNA条形码等,以DNA条形码应用最为广泛。DNA条形码是基因组中相对较短的、可用于物种鉴定的特异性基因片段。植物类中药材的条形码多选用核基因和叶绿体基因DNA片段,如叶绿体psbA-trnH基因、内转录间隔区(ITS)、叶绿体核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基(rbcL)和RNA转录体Ⅱ型内含子剪切酶基因(matK)等;动物类中药材的条形码多来自核基因和线粒体基因DNA,主要有线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COⅠ)、核糖体RNA(rRNA)和线粒体细胞色素b基因(CytB)等。综述动植物类中药材DNA分子标记与鉴定技术应用进展,并探讨DNA条形码在药用动植物类中药材鉴定中存在的局限性及发展前景,为中药质量控制提供参考。     

通用中药DNA条形码鉴定系统的研究及应用

为了对特殊身份的物种或品种进行保护、检测转基因生物，以及追踪生物的扩散，对所采集生物样本的来源物种进行准确地识别是非常必要的。简而言之，条形码物种鉴定技术即通过大范围地对一个或多个参考基因进行筛选，从而达到将未知个体归属于某个分类单元的目的，其使用通用的PCR引物对物种特异性的DNA条形码识别区进行扩增，将扩增产物的测序结果与数据库进行比较即可确定物种的身份。此项技术的推广尚面临2个关键问题：①如何进一步使用和分析DNA条形码数据；②如何建立起DNA条形码与经典分类方法之间的关联。本文结合上述问题对DNA条形码技术的原理和应用进行了综述。     

中药材DNA条形码鉴定技术应用进展

总结中药材DNA条形码技术的研究进展及其优缺点;从植物类药材、动物类药材及与其他鉴定技术联用3个方面,对中药材DNA条形码鉴定技术的研究进行总结,总结该技术的应用前景,以期为中药材鉴定研究及DNA条形码技术的应用提供参考。     

中药材种子DNA条形码鉴定研究进展

种子是中药产业的源头,中药材种子的准确鉴定不仅关系到中药材的真伪,更关系到中药的安全性和有效性。由于多数中药材种子体积较小、内含物丰富、形态特征易受种子成熟度和环境条件的影响,难以通过传统方法进行有效鉴定。DNA条形码技术利用一段标准的DNA序列从基因层面对物种进行鉴定,不受环境等外部因素影响,具有通用、快速、准确等特点,逐渐成为中药材种子鉴定的研究热点。简述了DNA条形码技术在中药材种子鉴定中的研究现状,分析了中药材种子DNA条形码鉴定的技术要点,总结了不同类型中药材种子进行DNA条形码鉴定的原则,并提出了利用宏条形码技术鉴定市售混合中药材种子的研究方法,为中药材种子鉴定提供新的研究思路。     

中药DNA条形码分子鉴定技术的应用与展望

中药材品种广泛,存在多基原的情况,质量差异较大,使临床用药安全性和有效性难以得到保证。因传统中药鉴定方法的局限性,对准确鉴别多基原中药材带来了一定的挑战。为了保证中药临床用药安全有效可控,中药鉴定学已成为最重要的研究课题之一,也是当前中医药事业急需解决的关键技术要求。DNA基因鉴别是从基因层面对中药材进行快速、准确的鉴定,包括DNA分子标记法、核酸探针杂交法和DNA条形码技术,其中DNA条形码技术应用最为广泛。DNA条形码是利用标准的DNA片段对物种进行鉴定的技术,2015年版《中国药典》收载了DNA条形码技术指导原则,建立了动物类采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)序列为主,转录间隔区间(ITS)2为辅;植物类采用ITS2/ITS为主,叶绿体psb A-trn H为辅的中药材鉴定体系。该技术的广泛应用为中药鉴别提供更高效快速的方法,并且有效地应用于多基原中药材的鉴别中,使中药品种混乱现象得到极大改观。文章首先对DNA条形码技术的原理、目的及意义、标准片段的选择进行介绍,着重阐述该技术在中药鉴定中的应用以及存在的局限性,并提出展望,以期为中药材的鉴定研究提供参考。     

中药材DNA条形码鉴定的基因序列比较

该文综述了中药材DNA条形码的研究现状,在此基础上分析了叶绿体基因和核基因在中药材系统进化及鉴定中的优缺点。ITS序列在植物中进化速率较快,适合属、种等较低分类阶元的系统关系研究,而ITS2更适合于中药材的鉴定。因此,中药材系统进化与鉴定研究应当根据研究问题选择相应DNA条形码序列。随着测序成本不断下降,叶绿体全基因组条形码在药用植物鉴定中的应用将更卓有成效。     

动物类中药DNA条形码鉴定研究进展

DNA基因鉴定是近年来应用在中药鉴定中较为重要的分子生物技术,该技术能够很好地从基因层面上鉴别药材,具有较高的准确性。DNA基因鉴定包括DNA分子遗传标记,核酸探针杂交,DNA条形码分子鉴定法等,其中发展最快的为DNA条形码分子鉴定法。DNA条形码分子鉴定法是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术,是传统形态鉴别方法的有效补充。由于不同物种的DNA序列是由腺嘌呤(A),鸟嘌呤(G),胞嘧啶(C),胸腺嘧啶(T)4种碱基以不同顺序排列组成,因此对某一特定DNA片段序列进行分析即能够区分不同物种。Hebert等在2003年提出了通过测定线粒体细胞色素C氧化亚基I(COI)基因序列来鉴定动物的种类。陈士林等则在大量实验的基础上提出了鉴别动物的基因以COI基因为主,ITS2基因为辅的动物类药材DNA条形码鉴定体系。大量的实验表明,通过DNA条形码来鉴别动物具有准确性、可行性、简便性、通用性,为鉴别动物物种及发现新物种提供了新的方法,为鉴别动物药材的真伪提供了科学的依据。但由于该技术是通过基因进行鉴定,对实验材料及提取方法有较高要求,对一些年代较久的动物药材,其DNA降解较为严重,为DNA提取技术提出了较高的要求;该技术只能鉴别其来源是否准确却不能鉴别其药用部位是否准确,这就需要结合其他鉴别方法来准确鉴别其药用部位。本文通过综合国内外对DNA条形码的研究,为日后的研究和应用提供理论依据。     

中药DNA条形码鉴定体系及研究方向

近年来,中药DNA条形码分子鉴定得到快速发展,加快了中药鉴定标准化的进程。通过中药DNA条形码鉴定研究,我国首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列,并建立以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系和以COI序列为核心、ITS2为辅助序列的动物类药材DNA条形码鉴定体系,为中药DNA条形码鉴定的发展奠定了坚实基础。本文结合课题组研究工作就构建中药DNA条形码鉴定体系进行了综述,包括中药DNA条形码序列的筛选确定、中药DNA条形码鉴定流程和中药DNA条形码鉴定数据库系统构建,并介绍了中药DNA条形码鉴定的研究方向。     

地龙及其混淆品原动物的形态及DNA双重条形码鉴定

目的基于线粒体cytochrome coxidase I(CO I)和16 S rRNA基因开发DNA双重条形码鉴定方法,由此验证并补充形态鉴定,以期建立一种准确、有效地鉴定地龙及混淆品原动物的方法。方法对收集到的66份样品依据形态特征进行初步鉴定,使用优化后的引物同时扩增CO I和16 S rRNA序列。优化一步法双重PCR实验条件。用MEGA 5.1计算地龙及其混淆品的种内、种间遗传距离,基于K2P模型构建NJ树。结果 CO I和16 S rRNA双重DNA条形码鉴定与形态鉴定结合,可准确鉴别地龙及混淆品原动物。结论形态鉴定是分子鉴定的基础,分子鉴定是形态鉴定的有力补充。二者结合可最大程度地实现地龙及其混淆品原动物的准确鉴定。DNA双重条形码鉴定方法也可为地龙药材鉴定以及其他动物药材的分子鉴定提供参考。     

蒲黄、松花粉等花粉类药材及其混伪品的DNA条形码鉴定

目前市场上花粉类药材品种较多,由于在外观形态均呈粉末状,很难区分,加之市场价格较高等因素,故混用和掺伪的情况时有发生,因此花粉类药材的准确鉴定对公众的用药安全显得尤为重要。该研究采用DNA条形码技术,对蒲黄、松花粉及其混伪品的基原植物及药材共60份样本进行研究。通过primer premier 6.0设计出蒲黄ITS2特异性引物PhF-R,其扩增效率高达100%,实验结果表明蒲黄药材的ITS2序列长度为234~249 bp,种内K2P平均距离与同属种间K2P平均距离十分接近,但远小于其与混伪品的种间K2P平均距离;松花粉药材的ITS2序列长度均为247 bp,ITS2序列种内平均K2P遗传距离远小于其与混伪品种间平均K2P距离。利用ITS2序列构建的邻接（NJ）树表明蒲黄、松花粉及其混伪品可明显区分,并呈现出良好的单系性。因此,DNA条形码可对该实验材料准确鉴定,有助于花粉类药材的监管及市场流通。     

利用DNA条形码检验中药制剂中的羚羊角药材

目的 研究以线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角的可行性.方法 以不同厂家生产的8种含羚羊角中药制剂为材料,经充分研磨后,采用DNA提取试剂盒提取样品中DNA,以引物LCO1490和HCO2198或特异性引物0703扩增线粒体COI基因片段序列,PCR产物直接双向测序,将测序结果在GenBank中进行BLAST比对,并以DNAMAN和MEGA5.2软件构建同源树和NJ树,以赛加羚羊(gb|JN632700.1)和羚羊角标准药材序列为对照,判定制剂中羚羊角的真实性,并以Kimura-2-parameter模型计算种内、种间遗传距离.结果 8种中药制剂中羚羊角的COI基因序列长度均为658 bp,在同源树和NJ树中可与赛加羚羊和羚羊角标准药材聚成一支,并与outgroup完全分开.种内遗传距离为0～0.064,平均遗传距离为0.020,种间遗传距离为0.167～0.195.结论 以线粒体COI基因作为DNA条形码检验中药制剂中羚羊角方法是可行的,但因羚羊其他器官也含有相同基因,为保证检验结果的准确性,还需配合使用其他检验方法.     

基于ITS2序列的中药材桔梗种子DNA条形码鉴定

目的：桔梗为中国常用大宗药食兼用中药材,种植面积广,建立基于DNA 条形码技术的桔梗种子鉴定方法具有重要意义。方法：本研究共收集29份中药材桔梗基原植物和种子样品;利用体式显微镜、X射线影像工作站观察种子的形态特征及种子成熟度;优化DNA提取方法;基于中药材DNA条形码鉴定系统（http://www.tcmbarcode.cn）和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》对种子物种进行鉴定。结果：不同群体来源或同一群体来源桔梗种子形态特征存在较大差异,识别困难;本实验可以实现单粒桔梗种子（约1mg）的DNA提取、PCR扩增和序列测定;5份样品同一群体内种子ITS2序列存在差异;中药材DNA条形码鉴定系统和《中国药典中药材DNA条形码标准序列》可以作为种子物种鉴定的依据。结论：DNA条形码分子鉴定法可以对中药材桔梗种子进行鉴定,同时为中药材种质资源鉴定提供了新方法,对中药材种子质量标准的建立提供依据。