六味地黄丸含药血清减低高糖诱导的肾小管上皮细胞的氧化损伤和凋亡的研究

目的观察六味地黄丸含药血清对高糖环境下培养的肾小管上皮细胞的保护作用,以及对高糖诱导的线粒体氧化损伤和凋亡的影响。方法制备不同剂量大鼠六味地黄丸含药血清,并培养高糖诱导的肾小管上皮细胞(HK-2),采用四甲基偶氮唑盐法和乳酸脱氢酶释放实验确定药物最适作用浓度。六味地黄丸含药血清处理高糖诱导的HK-2细胞24和48h后,2,7-二氯氢化荧光素二酯染色检测细胞内ROS含量,流式细胞仪测定线粒体膜电位变化,real-time PCR方法检测线粒体DNA的拷贝数,Hoechst 33258染色检测细胞凋亡,以及使用分光光度法检测细裂解液中Caspase-3和Caspase-9酶的活性。结果与正常对照组比较,高糖组在培养的24、48 h内HK-2细胞的ROS含量、线粒体膜电位、mt DNA拷贝数、细胞凋亡率、Caspase-3和Caspase-9酶活性显著上调(P0.01)。与高糖组比较,10%六味地黄丸含药血清均能逆转上述变化(P0.05),且抑制作用呈一定的时间依赖关系。结论六味地黄丸可能通过调控高糖环境下肾小管上皮细胞的线粒体ROS生成、改善线粒体膜电位和mt DNA拷贝数、抑制Caspase蛋白的级联激活反应,降低肾小管上皮细胞的氧化损伤和细胞凋亡,从而有利于延缓糖尿病肾病的间质纤维化的进展。     

去甲斑蝥素诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡作用

目的探讨去甲斑蝥素(Norcantharidin,NCTD)诱导人皮肤鳞状细胞癌A431细胞凋亡作用及其相关分子机制。方法体外培养A431细胞,分为对照组和NCTD低、高剂量组(20,40μmol·L~(-1))。采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用;Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡;试剂盒检测细胞活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量、线粒体膜电位(MMP)变化、Caspase-3及Caspase-9酶活性变化;Western Blot法检测对细胞Bcl-2及Bax蛋白表达水平的影响。结果采用NTCD处理A431细胞48 h,与对照组相比,NCTD低、高剂量组均能抑制细胞增殖能力(P0.05),并明显诱导细胞凋亡(P0.05),提高细胞内的ROS水平(P0.05,P0.01)和MDA含量(P0.05,P0.01),降低细胞MMP(P0.05,P0.01)。同时,NTCD可以抑制Bcl-2蛋白表达及上调Bax蛋白表达,并能够明显升高细胞的Caspase-3及Caspase-9酶活性。结论 NCTD可能通过提高细胞内ROS水平的途径诱导A431细胞发生凋亡。     

氧化苦参碱对高糖引起的H9C2细胞氧化应激损伤的影响

目的:研究氧化苦参碱对高糖诱导H9C2细胞氧化应激损伤的保护机制。方法:分组培养H9C2心肌细胞并分为空白组,高糖组,氧化苦参碱低、高剂量组(50,100 mg·L^-1),阳性药维生素E组(1×10^-4 mol·L^-1),甘露醇等渗组。通过乳酸脱氢酶外漏法检测细胞损伤,检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量变化,通过荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)含量和细胞线粒体功能的完整性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白的表达。结果:与空白组比较,模型组细胞内MDA,ROS含量,Bax蛋白表达水平显著升高(P<0.01),而SOD活性、线粒体膜电位和Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与高糖组比较,氧化苦参碱显著降低乳酸脱氢酶的外泄、显著抑制细胞内ROS的产生(P<0.01),明显降低MDA的含量和Bax蛋白的表达(P<0.05),增加SOD活性、线粒体膜电位和Bcl-2蛋白的表达(P<0.01)。结论:氧化苦参碱通过改善线粒体功能来调节氧化应激从而抑制由高糖引起的H9C2心肌细胞凋亡。     

西红花酸对阿霉素诱导大鼠心肌细胞损伤的影响

目的观察西红花酸对阿霉素诱导的大鼠心肌细胞损伤的影响,从线粒体角度探讨其作用机制。方法培养H9c2大鼠心肌细胞,阿霉素诱导建立心肌细胞损伤模型。细胞分为正常组、模型组(阿霉素10μmol/L)、西红花酸高剂量组(阿霉素10μmol/L+西红花酸20μmol/L)、西红花酸低剂量组(阿霉素10μmol/L+西红花酸10μmol/L),给药6 h后CCK-8法检测细胞存活率,DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot检测Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达,免疫荧光检测Caspase-8蛋白表达。结果与正常组比较,模型组H9c2细胞存活率降低(P0.01),细胞内ROS水平升高(P0.001),线粒体膜电位降低(P0.001),细胞凋亡率升高(P0.001),cleaved Caspase-3蛋白表达升高,cleavedCaspase-3/proCaspase-3比值升高(P0.01),Bcl-2蛋白表达降低,Bax蛋白表达升高,Bcl-2/Bax比值显著降低(P0.001),Caspase-8蛋白表达明显升高(P0.001);与模型组比较,西红花酸高、低剂量组H9c2细胞存活率显著升高(P0.01,P0.05),ROS水平显著降低(P0.001),线粒体膜电位升高(P0.001),细胞凋亡率降低(P0.01),cleaved Caspase-3蛋白表达降低,cleaved Caspase-3/pro Caspase-3比值降低(P0.001,P0.05),Caspase-8蛋白表达显著降低(P0.001),西红花酸高剂量组Bcl-2蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,Bcl-2/Bax比值显著升高(P0.01)。结论西红花酸可保护阿霉素致心肌细胞损伤,其机制可能与保护线粒体、抑制细胞凋亡相关。     

竹节香附素A对人结肠癌细胞HCT-116增殖、凋亡、迁移及侵袭活性的影响

目的研究竹节香附素A(Raddeanin A,RA)对人结肠癌细胞HCT-116增殖、凋亡、迁移及侵袭活性的影响,并初步探讨其作用机制。方法采用不同浓度的RA(0.125~50.0μmol·L~(-1))处理HCT-116细胞24,48 h,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖能力。RA(1.0,2.0,4.0μmol·L~(-1))干预后,采用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率;JC-1染色法检测线粒体膜电位变化;DCFH-DA法检测细胞内活性氧簇(ROS)水平;采用Western Blot法检测细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达。选择低于凋亡浓度的RA(0.25,0.5,1.0μmol·L~(-1))作用于HCT-116细胞,采用细胞划痕实验和Transwell穿膜实验观察不同浓度RA对HCT-116细胞迁移的影响;采用铺有Matrigel胶的Transwell实验检测RA对HCT-116细胞侵袭能力的影响;采用RT-PCR法和Western Blot法检测RA对HCT-116细胞中MMP-2、MMP-9 m RNA及蛋白表达的影响。结果 RA干预24,48 h后的IC50值分别为5.967μmol·L~(-1)和4.797μmol·L~(-1),且呈现浓度与时间依赖性。与空白对照组比较,RA1.0,2.0,4.0μmol·L~(-1)浓度组凋亡、坏死的HCT-116细胞明显增多(P0.05,P0.01);线粒体膜电位坍塌率分别为70.2%,74.4%和91.6%,差异均有统计学意义(P0.01);细胞内ROS含量均显著增加(P0.01),且呈现浓度依赖性;Cleaved caspase-3蛋白的表达水平随RA浓度的增加而显著提高(P0.01)。RA干预后与空白对照组比较,0.5,1.0μmol·L~(-1)浓度组的细胞愈合率显著降低(P0.01);RA 0.25,0.5,1.0μmol·L~(-1)浓度组均能显著抑制HCT-116细胞的迁徙能力(P0.01),均能显著抑制HCT-116细胞体外侵袭能力(P0.05,P0.01);RA 0.5,1.0μmol·L~(-1)浓度组MMP-2、MMP-9 m RNA及蛋白相对表达水平均显著降低(P0.05,P0.01)。结论 RA既能够有效抑制人结肠癌HCT-116细胞增殖,又能诱导该细胞的凋亡,可能与诱导细胞内ROS产生,导致线粒体膜电位坍塌,激活caspase信号通路有关。低于凋亡浓度的RA(0.25,0.5,1.0μmol·L~(-1))能明显抑制HCT-116细胞的迁移与侵袭活性,可能与通过下调HCT-116细胞MMP-2、MMP-9m RNA及蛋白表达有关。     

血根碱通过调控PI3K/Akt信号通路诱导胰腺癌细胞凋亡的机制

目的:探讨血根碱对胰腺癌细胞凋亡的影响及其信号通路调控机制。方法:不同浓度血根碱(2,4,6μmol·L~(-1))处理小鼠胰腺癌Panc02细胞不同时间(24,48,72 h)后,采用噻唑蓝(MTT)比色法检测血根碱对细胞生长抑制作用的影响;采用磷脂结合蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染色试剂盒通过流式细胞仪检测血根碱对Panc02细胞凋亡影响;采用花青染料(JC-1)探针试剂盒荧光染料分析检测线粒体膜电位的变化;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),总蛋白激酶B(Akt),磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),总磷脂酰肌醇3激酶(PI3K),磷酸化磷脂酰肌醇3激酶(p-PI3K)的表达情况。结果:与空白组比较,不同浓度的血根碱作用同一时间后,随着药物浓度的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P0.05),与空白组比较,同一浓度作用不同时间后,随着时间的增加细胞生长抑制率逐渐升高(P0.05);与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组的细胞凋亡率无明显升高,与空白组比较,血根碱4,6μmol·L~(-1)组的细胞凋亡率均明显升高(P0.05);与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组时红绿荧光无变化,血根碱4,6μmol·L~(-1)组红色荧光减弱,绿色荧光增强,Panc02细胞线粒体膜电位降低;与空白组比较,血根碱2μmol·L~(-1)组处理的Bax,Bcl-2,p-PI3K,p-Akt,Akt和PI3K蛋白表达均无变化,血根碱6μmol·L~(-1)组Bax蛋白表达增高,Bcl-2及PI3K/Akt信号通路中关键蛋白p-PI3K,p-Akt表达降低(P0.05)。结论:血根碱通过抑制PI3K/Akt信号通路有效地诱导小鼠胰腺癌Panc02细胞经线粒体凋亡途径发生凋亡。     

香青兰总黄酮对阿霉素心肌毒性的保护机制研究

目的 探讨香青兰总黄酮（TFDM）对阿霉素心脏毒性的保护作用及相关机制。方法 大鼠心肌细胞H9c2细胞随机分为对照组、模型组和TFDM治疗组（5、25、50、100 μg/mL）。药物干预后,除对照组外,其余各组细胞采用阿霉素1 μmol/L作用24 h制备心脏毒性模型。采用CCK-8法测定TFDM干预后阿霉素损伤对H9c2细胞活力的影响;采用试剂盒法测定各组细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放情况及细胞内超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）水平;采用Annexin-V FITC/PI双染法通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率;采用DCFH-DA、JC-1探针检测细胞内活性氧（ROS）和线粒体膜电位;采用Western blotting检测各组细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）、细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,阿霉素诱导的模型组细胞活力下降,LDH、MDA水平升高,SOD活性降低,细胞凋亡率升高,ROS释放显著增多,线粒体膜电位显著下降,而TFDM则剂量依赖性地使细胞活力升高,LDH、MDA水平下降,SOD活性升高,细胞凋亡率降低,ROS释放显著减少,线粒体膜电位显著升高;Western blotting结果显示,与对照组比较,模型组细胞p-PI3K、p-Akt、p-ERK、Bcl-2蛋白表达水平降低,p-p38MAPK、Bax、Caspase-3蛋白表达水平显著升高;与模型组比较,TFDM使细胞中p-PI3K、p-Akt、p-ERK、Bcl-2蛋白表达水平升高,p-p38MAPK、Bax、Caspase-3蛋白表达水平降低。结论 TFDM能够保护心肌细胞,可能通过抗氧化应激,保护心肌细胞线粒体,调节MAPK、PI3K/Akt凋亡通路及其下游凋亡分子的表达抑制细胞凋亡。     

二参颗粒对氯化钴诱导的H9C2细胞氧化应激介导的细胞凋亡的保护作用

目的:通过观察二参颗粒对氯化钴(CoCl_2)诱导的缺氧损伤和大鼠心肌细胞H9C2凋亡的影响,阐明二参颗粒对心脏的保护作用。方法:以500μmol/L的CoCl_2与H9C2细胞共同作用24 h,建立心肌细胞缺氧缺血模型。将H9C2细胞分为空白对照组、模型对照组、二参颗粒50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL组。酶联免疫法检测胞外培养液中乳酸脱氢酶(LDH)的含量,流式细胞术检测胞内活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位(MMP)和凋亡水平,蛋白质印迹分析法检测细胞内Bcl-2/Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的表达水平。结果:与空白对照组比较,模型对照组细胞活力下降、活性氧(ROS)荧光表达值升高、线粒体膜电位JC-1单体阳性细胞显著升高以及细胞培养液中LDH含量升高,凋亡率显著升高,凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达上调,Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,二参颗粒能有效改善细胞活力,降低LDH的含量,显著降低胞内ROS荧光表达值,改善线粒体膜电位和凋亡水平,下调凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和Cleaved PARP的蛋白表达,升高Bcl-2/Bax的比值(P<0.05或P<0.01)。结论:二参颗粒可以抑制CoCl_2诱导的心肌细胞ROS水平,减少氧化应激发生,进而改善氧化应激介导的心肌细胞的细胞凋亡。     

黄芩素对中波紫外线诱导角质形成细胞凋亡及相关细胞因子表达的影响

目的:研究黄芩素对中波紫外线(UVB)诱导角质形成细胞凋亡及相关细胞因子表达的影响。方法:体外培养人皮肤角质形成细胞(HaCaT),取对数生长期的细胞,随机分为空白组、模型组和黄芩素组,并用30 mJ·cm~(-2)的UVB照射模型组和黄芩素组,建立光老化模型。噻唑蓝(MTT)比色法筛选黄芩素的有效安全浓度,并测定黄芩素对光老化HaCaT细胞增殖率的影响;活性氧自由基(ROS)试剂盒测定各组细胞中ROS含量;Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定各组细胞凋亡率;蛋白免疫印迹法(Western blot)测定各组细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),半胱氨酸天冬氨酸-3(Caspase-3)及Caspase-9蛋白表达水平。结果:筛选出1×10~(-7),1×10~(-6),1×10~(-5)mol·L~(-1)黄芩素为最佳有效安全浓度。与空白组比较,模型组ROS含量和细胞凋亡率显著升高(P0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P0.01),Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著升高(P0.01)。与模型组比较,1×10~(-7),1×10~(-6),1×10~(-5)mol·L~(-1)黄芩素组ROS含量和细胞凋亡率显著降低(P0.05,P0.01),Bcl-2蛋白表达水平显著升高(P0.05,P0.01),Caspase-3及Caspase-9蛋白表达水平显著下降(P0.05,P0.01)。结论:黄芩素可以通过降低细胞ROS含量和凋亡率,调控Bcl-2家族中抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表达,降低凋亡相关细胞因子Caspase-3和Caspase-9的表达水平,抑制UVB诱导的细胞凋亡。     

川芎嗪对t-BHP致PC12细胞损伤的保护及机制

目的:研究川芎嗪(TMP)对叔丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路的影响。方法:培养PC12细胞,孵育不同浓度的川芎嗪(10,25,50,100,200μmol·L~(-1)),12 h后采用细胞增殖毒性检测试剂盒(CCK-8)确定川芎嗪的保护浓度。随后将PC12细胞分为空白组,t-BHP组,TMP组。空白组加入培养基,t-BHP组加入t-BHP(200μmol·L~(-1)),TMP组加入TMP(25,50,100μmol·L~(-1))预处理12 h后加入t-BHP(200μmol·L~(-1))。共作用6 h后采用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测乳酸脱氢酶(LDH)漏出量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性、活性氧(ROS)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2),Bcl-2相关X蛋白(Bax),Akt,磷酸化Akt(p-Akt)及m TOR,p-mTOR的表达情况。结果:与空白组比较,t-BHP组细胞生存率降低(P0.01),与t-BHP组比较,25,50,100μmol·L~(-1)的川芎嗪促进细胞增殖(P0.05,P0.01),其中50μmol·L~(-1)组的细胞增殖率最高(P0.01);与空白组比较,t-BHP组LDH的释放量,ROS和MDA含量显著增加(P0.01),SOD和GSH-Px的活性显著降低(P0.01),与t-BHP组比较,TMP组LDH的释放量,ROS和MDA含量显著降低(P0.05,P0.01),SOD和GSH-Px的活性显著升高(P0.05,P0.01);Western blot表明与空白组比较,t-BHP组中p-Akt,p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P0.01),Bcl-2/Bax值明显降低(P0.01),与t-BHP组比较,TMP(50μmol·L~(-1))组中p-Akt,p-mTOR蛋白表达水平明显上升(P0.05),Bcl-2/Bax值明显上升(P0.05)。另外LY294002(PI3K蛋白抑制剂)处理减弱了这些变化。结论:川芎嗪通过激活PI3K/Akt/m TOR信号通路保护t-BHP诱导的PC12细胞损伤。