滇重楼无公害栽培关键技术

滇重楼产区由于长期缺乏系统、科学的种植技术规范,规范化生产程度较低、病虫害严重、滥用化肥和农药等情况普遍存在,严重制约了滇重楼的可持续利用和区域经济的发展。开展滇重楼的无公害栽培是解决该问题的关键。本研究针对滇重楼的无公害栽培技术进行探讨,包括GMPGIS-II指导基地选址、田间管理、病虫害综合防治技术等,该体系可为滇重楼无公害精细化栽培提供参考。     

滇重楼腐烂程度与4种皂苷含量的关系

目的:测定滇重楼健康、病健交界部分、完全腐烂部分、药材及人工种植滇重楼1级到6级腐烂的样品中4种皂苷的含量。方法:采集云南白药集团武定滇重楼种植基地样品,腐烂等级分类参照植病研究方法,采用HPLC测定其4种重楼皂苷VI、VII、PA和H。结果:不同腐烂程度重楼皂苷含量差异较大。结论:腐烂部分占整个重楼根茎的21%⁴0%的样品重楼皂苷Ⅶ、PA和H含量最高,完全健康和完全腐烂的滇重楼根茎重楼皂苷含量较低。     

接种时期对丛枝菌根真菌侵染的滇重楼幼苗生长发育及甾体皂苷含量的影响

目的研究不同接种时期对丛枝菌根(AM)真菌侵染的滇重楼幼苗生长发育及重楼皂苷含量的影响,为栽培驯化出高品质的滇重楼奠定基础。方法采用HPLC测定不同接种时期滇重楼中重楼皂苷I、II、VI、VII的含量;采用曲利苯蓝染色法、紫外分光光度法等方法对不同接种时期及不同AM真菌组合的滇重楼的侵染率、生理指标、根茎生物量等进行分析。结果不同接种时期的AM真菌侵染率较强,保护酶活性、光合色素和可溶性糖含量提高,可溶性蛋白无明显变化,丙二醛含量降低,滇重楼幼苗的抗逆性提高,生长发育良好;栽培种源1年实生苗(2015年8月采收,T7时期)的品质相对较低,栽培种源1年实生苗(2015年6月、7月采收,T5、T6时期)的与栽培种源2年实生苗(2015年8月采收,T8时期)的品质最佳;不同的AM真菌混合组中,S2、S3和S6处理组的效果更佳。结论接种时期对AMF侵染的滇重楼幼苗生长发育及重楼皂苷含量存在一定的影响。     

滇重楼林下规范化种植生产标准操作规程(SOP)

目的通过前期多年的滇重楼规范化种植实验研究,制定了滇重楼林下规范化种植生产标准操作规程(SOP)。方法以《中药材生产质量管理规范》(GAP)为指导原则,对滇重楼林下栽培生产的区划、生态环境、栽培技术、采收加工及包装、储运等一系列过程开展研究。结果该规程已被云南省弥渡县中药材种植专业合作社所采用,实践证明,按本规程生产出的滇重楼药材完全可以达到滇重楼的法定质量标准。生产出的滇重楼药材产品质量安全、有效、稳定和可控。     

野生滇重楼和露天栽培滇重楼叶的显微结构初步研究

目的 利用显微方法了解生态环境对滇重楼叶的生长的影响.方法 对产自云南省元江县的野生滇重楼和露天栽培滇重楼的叶表皮和横切面进行观察.结果 露地栽培重楼较野生重楼下表皮气孔密度较大,气孔大小变化不大.野生重楼维管束导管数比家种重楼多,草酸钙针晶束较家种重楼明显,主脉上下表皮内的厚角组织较家种明显.结论 野生滇重楼比露地栽培重楼生长速度快,导致其气孔密度和内部结构有量上的差异.     

滇重楼根际微生物分布与甾体皂苷含量的相关性

观察了滇重楼栽培中根际土壤细菌、真菌、放线菌和3类促生细菌数量的变化规律,探讨了根际土壤微生物数量与滇重楼品质的关系。结果表明,滇重楼植物根际土壤微生物资源丰富,不同产地滇重楼根际土壤细菌、真菌、放线菌、解钾细菌、解无机磷细菌和解有机磷细菌数量具有显著性差异(P<0.05),根际土壤微生物数量的分布规律是:细菌数量>放线菌数量>真菌数量。随着种植年限的增加,真菌与解钾细菌数量呈逐年增加,细菌、放线菌、解无机磷细菌与解有机磷细菌数量呈逐年减小的变化趋势,土壤微生物类型由"细菌型"向"真菌型"过渡。不同产地滇重楼根茎的药用品质具有生境依赖性,种植年限的增加造成滇重楼药用品质下降作用明显。由此可见,种植年限增加会引起土壤微生态区系的变化,降低了滇重楼对营养物质的吸收利用,进而造成滇重楼药用品质下降。     

云南省不同地区滇重楼4种皂苷含量的比较

目的:研究云南省不同产地滇重楼中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ4种皂苷的含量。方法:采用Waters C18柱(4.6mm×150mm,5μm),乙腈-水梯度洗脱,流速1mL/min,柱温30℃,检测波长203nm。结果:4种甾体皂苷在0.384-8.16μg范围内线性良好,R=0.9994-0.9998,平均加样回收率97.7%-99.1%;云南省不同产地的滇重楼中4种皂苷含量差异较大,依次为Ⅰ(0.979%)Ⅱ(0.492%)Ⅶ(0.097%)Ⅵ(0.004%);野生滇重楼皂苷的总含量(1.52%)高于人工栽培滇重楼(1.26%)。结论:该方法准确、简捷,可用于重楼中4种皂苷的含量测定。     

西双版纳野生重楼资源的分布概况

目的:摸清西双版纳野生重楼资源的种类、分布区域及资源现状等,为开展重楼人工种植,进行合理保护和开发研究提供依据。方法:通过走访调查、实地调查和样本采集鉴定相结合的方法,对全州26个乡镇的野生重楼资源进行了调查。结果:所调查的26个乡镇全部有野生重楼分布,但居群内个体多在20株以下。主要分布于海拔1 000～1 500 m的南亚热带季风常绿阔叶林下和竹林下,喜生长于箐沟、山谷等小环境中。分布的种类有滇重楼、七叶一枝花、南重楼3种,其中以滇重楼数量最多。结论:西双版纳地区海拔800 m以上、水源丰富的地域均适宜重楼生长,但野生重楼资源正在急剧减少,迫切需要开展重楼人工种植,并对野生资源进行合理保护和利用。     

多茎滇重楼地上叶和茎中主要次生代谢产物的积累

目的:探讨不同居群多茎滇重楼叶和茎中主要次生代谢产物的积累规律。方法:采用HPLC测定不同居群多茎滇重楼叶和茎中主要活性成分重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ的含量,流动相水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0~40 min,30%~60%B;40~50 min,60%~30%B),检测波长203 nm,运用单因素方差分析、聚类分析和HPLC图谱分析探讨其次生代谢产物的积累规律。结果:不同居群多茎滇重楼叶中重楼皂苷Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ含量及总含量具有显著差异;除个别居群外,不同居群多茎滇重楼茎中重楼皂苷Ⅶ含量差异较小。叶中主要检测到重楼皂苷Ⅱ和Ⅶ,茎中只检测到重楼皂苷Ⅶ。多茎滇重楼和滇重楼比较的地上部分叶和茎HPLC图谱相似度均较低,6个居群叶中重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅶ总质量分数达到了2015年版《中国药典》规定的限量标准。结论:多茎滇重楼与滇重楼地上部分叶和茎存在一定差异,但多茎滇重楼叶中有效物质成分较高,该研究为多茎滇重楼地上部分叶和茎的开发利用提供了一定的参考依据。     

重楼道地性研究进展

从重楼的本草考证、植物学、药材性状、遗传变异、化学成分、药理作用等方面,对重楼道地性研究现状进行了综述。研究发现历代本草所记载的“蚤休”为七叶一枝花Paris polyphylla var.chinensis(华重楼),各产地质量差异不明显;本草记载的“重楼”为云南重楼P.polyphylla var.yunnanensis(滇重楼),其道地产区为西南地区,尤以云南为佳。鉴于植物形态、遗传学和相关文献研究结果,建议将重楼的植物基原的中文学名修订为滇重楼和华重楼;不同产地的滇重楼及华重楼在皂苷成分、脂溶性成分、氨基酸、无机元素含量和遗传上均显示出一定的差异,重楼药材质量受产地和种质的影响较大,筛选优质重楼品种并在适宜产区规范栽培,是实现重楼品质稳定的基础。     

云南重楼种子育苗技术研究

目的：缩短云南重楼种子萌发和出苗所需时间,提高其出苗率；提出在生产中切实可行的云南重楼种子有性繁殖育苗方法。方法：考察不同温度、不同播种方式(播种时间、覆土厚度、地膜覆盖)等因素对云南重楼种子萌发和出苗的影响。结果：云南重楼种子胚后熟和萌发的最适温度在18～20 ℃,在此温度下处理3～4个月以后,转至0～10 ℃低温处理2～4个月,可在翌年4月出苗；适宜的播种时间是4月份以前,育苗土覆盖厚度为1 cm左右,播种后用黑色地膜进行覆盖,可提高出苗率。结论：上述试验结果可为云南重楼种子育苗提供操作参考。     

不同生境滇重楼根际解磷菌的筛选与鉴定

二级濒危药用植物滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis野生资源严重匮乏,引种栽培可缓解市场需求,筛选滇重楼根际土壤解磷菌,为开发高效微生物菌肥提供数据支撑。该研究从云南、四川和贵州3个地区10个不同地点的野生和移栽品种的滇重楼根际土壤中分离筛选具有矿化有机磷能力的根际解磷菌,经分离纯化后定性定量分析解磷能力,结合生理生化实验,运用16S rDNA测序分析进行菌株鉴定。从10个不同生境滇重楼根际土壤中筛选41株解有机磷菌株,其中野生品种滇重楼根际土壤中获得21株,移栽品种根际土壤中获得20株。显著性分析发现,41株解有机磷菌株的解磷能力存在明显差异,溶磷量为0.08~67.61 mg·L^-1,pH 4.27~6.82。其中菌株Y3-5的溶磷量为67.61 mg·L^-1,增磷量为57.57 mg·L^-1。经鉴定41株均为革兰阳性芽孢杆菌。结合生理生化和系统进化树,最终筛选运动芽孢杆菌Y3-5为候选滇重楼根际解磷菌。不同生境滇重楼根际土中解磷菌的分布不同,解磷能力存在差异,解有机磷菌株Y3-5可望作为滇重楼微生物菌肥的候选菌种。     

不同丛枝菌根真菌组合对滇重楼光合生理和化学成分的影响

目的:研究接种不同丛枝菌根(AM)真菌组合对滇重楼幼苗的生长发育和入药品质的影响,为培育优质滇重楼药材提供参考。方法:通过室温盆栽接种试验方法,在灭菌栽培土壤中分别接种9组不同AM真菌组合,以不接种为空白组,观察不同AM真菌组合对滇重楼幼苗的根系侵染率、光合参数、生理指标及化学成分等的影响。结果:接种外源AM真菌组合显著增加滇重楼根际土壤中的孢子密度、根系AM真菌的侵染率和侵染强度,以及根内琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸酶活性;与空白组相比,不同AM真菌处理组对滇重楼叶片叶绿素含量、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量、抗氧化酶活性等均有不同程度的提高;接种混合AM真菌可以诱导滇重楼次生代谢过程的变化,总皂苷含量在T1至T2时期呈上升趋势,T2至T4时期急速减少,到T5时期有所提高。结论:不同混合AM真菌能与滇重楼根系形成良好的共生关系,提高菌根生活力,增强滇重楼对外界不利环境的抗逆性,促进滇重楼的生长发育以及提高根茎品质。从综合接种效应来看S5,S8,S9组AM真菌组合效果最佳,为滇重楼菌根生物技术的运用提供了参考价值。     

重楼药材和混伪品中5种皂苷的含量及对《中国药典》2015年版重楼含量测定修订的探讨

重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphylla var.yunnanensis或七叶一枝花P.polyphylla var.chinensis的干燥根茎。针对现行重楼药材标准存在的问题,前期研究提出"删除重楼皂苷Ⅵ,增补重楼皂苷H,以重楼皂苷Ⅰ,Ⅱ,H和Ⅶ的总量进行限度控制"。为了考察更广范围内重楼样品中重楼皂苷H的含量以及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷H和重楼皂苷Ⅶ的总量,该研究基于2015年版《中国药典》重楼标准定量方法的色谱条件,进行了同步测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷H和重楼皂苷Ⅶ含量的方法学验证,测定了69批不同来源重楼样品的含量;同时,测定了易混伪药材头顶一颗珠以及重楼属7种近缘植物根茎中5种重楼皂苷的含量。结果表明重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷H和重楼皂苷Ⅶ分别在0.006 48~0.828,0.006 52~0.834,0.006 17~0.790,0.006 31~0.808 g·L-1线性关系良好,平均加样回收率在100.2%~101.4%,RSD均小于3.5%。方法学验证均符合含量测定要求。36批不同产地的七叶一枝花样品中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷H和重楼皂苷Ⅶ的总量在0.050 9%~3.99%(不含3批未检出);33批不同产地的云南重楼样品中4种成分总量在0.115%~3.23%。同属近缘植物中,球药隔重楼和长柱重楼中甾体皂苷含量较高,狭叶重楼、金线重楼、黑籽重楼含量较低,毛重楼几乎不含皂苷。饮片易混伪品头顶一颗珠中重楼皂苷Ⅵ在0.526%~1.55%,并且不含重楼皂苷H。建议以干燥品计,含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷H和重楼皂苷Ⅶ的总量不得少于0.80%进行限度控制,以提升商品重楼药材质量,遏制低含量的重楼属近缘种(比如毛重楼、黑籽重楼和狭叶重楼等)以及头顶一颗珠的混伪现象。     

植物粗提物杀灭滇重楼根茎线虫的研究

目的：研究黄柏、雷公藤等16种植物粗提液对课题组分离、鉴定和培养的与滇重楼Paris polyphylla Smith var．yunnansensis（Franch．）Hand．-Mazz．根茎腐烂有密切关系的主要害虫小杆线虫Rhabditissp．的毒杀作用。方法：各种植物汁液原液配成10倍、50倍、100倍、500倍的浓度梯度,用浸液法测试杀线效果。结果：药效试验显示16种植物粗提液均有毒杀效果;马缨丹花叶、万寿菊、杜鹃粗提液在72h后,对小杆线虫的致死率分别为71．4％-92．0％、83．7％～91．4％、73．3—89．0％。结论：植物杀线虫物质的成份和活性不仅与提取的植物种类、部位有关,也与植物新鲜度、粉碎度、提取时间、提取温度、提取液浓度及其作用线虫时间等因素也不同程度地影响着植物杀线虫物质的作用。     

滇重楼糖基转移酶基因的克隆和原核表达

目的:克隆滇重楼皂苷类成分生物合成途径中关键酶糖基转移酶基因(PpUGT1,PpUGT7),并对其进行生物信息学分析、相对表达量分析和原核表达。方法:试剂盒法提取滇重楼RNA并反转录,根据滇重楼转录组数据设计特异性引物,克隆基因全长,使用软件对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测基因相对表达量,构建原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白。结果:PpUGT1和PpUGT7分别长1 827 bp和1 380 bp,分别编码608和459个氨基酸,相对分子质量分别为67.6 kDa和51.3 kDa,其中PpUGT1预测为甾体类糖基转移酶,PpUGT7预测为三萜类糖基转移酶。两蛋白均为亲水性蛋白,无跨膜结构,无信号肽,均与同类蛋白具有较高的保守性。实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)结果显示,PpUGT1的表达量由高到低依次为根>叶>花>茎,PpUGT7的表达量由高到低依次为茎>叶>花>根。此外,成功在大肠埃希菌中以可溶形式表达目的蛋白。结论:克隆得到PpUGT1和PpUGT7基因,证明其在不同植物器官中存在差异表达,并在大肠埃希菌中成功表达其重组蛋白,为进一步鉴定PpUGTs功能、解析滇重楼中皂苷类成分生物合成途径奠定基础。     

变温层积对解除滇重楼种子休眠及其内源激素变化的研究

目的研究滇重楼种子破休眠的方法及其内源激素水平变化规律。方法以变温层积处理的滇重楼种子为材料,利用高效液相色谱法(HPLC)测定种胚发育过程中植物激素赤霉素(GA)、吲哚乙酸(IAA)、脱落酸(ABA)量的变化与种子胚率的关系。结果变温层积处理可在3个月内打破滇重楼种子休眠,其GA量显著升高,ABA量显著下降。结论内源激素ABA和GA在滇重楼种子休眠与萌发过程中起着重要的作用。     

重楼药理作用的研究进展

重楼(Rhizoma Paridis)为常用中药,种类众多,资源丰富,有清热解毒,消肿止痛,凉肝定惊的功效。现代药理研究表明,重楼具有抗肿瘤、消炎、抑菌、镇静、镇痛、止血等作用等多种药理作用。近年来对重楼药理作用的研究主要集中在其抗肿瘤和肾脏保护作用上,作者就重楼的药理作用国内外最新研究现状作一综述。