大孔吸附树脂对莲子心中有效成分的分离纯化研究

目的研究大孔吸附树脂吸附分离莲子心中莲心碱、异莲心碱及甲基莲心碱的工艺条件及参数。方法考察了AKS-W、AB-8和H214树脂对莲心碱、异莲心碱及甲基莲心碱的静态及动态吸附性能,并采用HPLC定量分析莲心碱、异莲心碱及甲基莲心碱。结果AKS-W树脂对莲子心中有效成分有较好的吸附分离效果,提取物中莲心碱、异莲心碱及甲基莲心碱的质量分数分别提高到10.2%、6.7%和11.9%。结论大孔型非极性吸附树脂AKS-W对莲子心中有效成分是一种较为理想的分离介质。     

莲心碱及莲心碱高氯酸盐初步稳定性考察及莲子心不同部位中莲心碱的含量测定

目的 考察了莲心碱及莲心碱高氯酸盐的稳定性；并测定了莲子心不同部位（幼叶和胚根）中莲心碱的含量。方法 采用反相离子对HPLC法，通过两种不同流动相，确证了莲心碱及莲心碱高氯酸盐的纯度并考察了莲心碱及莲心碱高氯酸盐的稳定性。采用甲醇-水-冰醋酸-辛烷磺酸钠-乙酸钠（55：45：0.6:10mmol/L:5mmol/L)为流动相，以莲心碱高氯酸盐为对照品测定了莲子心不同部位（幼叶和胚根）中莲心碱的含量。结果 莲心碱在各种条件下均不稳定，对光照尤其敏感，而莲心碱高氯酸盐除对光照稍显不稳定外，在其他各种条件下均较稳定，莲子心幼叶中莲心碱的含量约为胚根中莲心碱的含量的4-5倍。结论 在含量测定时应采用莲心碱高氯酸盐作对照品；莲子心幼叶中莲心碱的含量显著高于胚根中莲心碱的含量。     

双波长薄层扫描法测定莲心碱注射液含量

应用薄层扫描法测定莲心碱注射液中莲心碱的含量。结果证明,本方法结果可靠,可作为莲心碱注射液的质量控制方法。     

小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道表达的影响

目的:利用免疫荧光化学染色法和Western blot法分别定性、定量地检测不同浓度的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道表达的影响,以及不同浓度的小檗碱对大鼠心肌组织Ikr通道蛋白表达的影响,探讨小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱的抗心律失常机制.方法:Western blot法检测HERG-HEK细胞上HERG通道蛋白的表达;免疫荧光化学染色法并利用共聚焦显微镜定性测定不同浓度的小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达的影响;Western blot法定量检测不同浓度的小檗碱对大鼠心肌组织Ikr通道蛋白表达的影响以及小檗碱、莲心碱和甲基莲心碱对稳定转染在HEK-293细胞中HERG钾通道蛋白表达的影响.结果:Western blot法检测稳定转染有HERG基因的HEK293细胞能高水平的表达HERG通道蛋白.10,30μmol· L-1的小檗碱明显抑制HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达(P＜0.0l).10,20 mg·kg-1的小檗碱抑制大鼠心肌组织Ikr通道蛋白的表达(P＜0.05).3,10,30μmol·L-1的莲心碱促进HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达(P＜0.05).甲基莲心碱不影响HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达.结论:稳定转染的HERG-HEK细胞能高水平的表达HERG通道蛋白;小檗碱对体外HERG-HEK细胞和大鼠心肌组织Ikr通道的蛋白表达均有抑制作用;莲心碱促进HERG-HEK细胞中HERG通道蛋白的表达;甲基莲心碱对HERG通道蛋白表达无影响.     

RP-HPLC同时测定莲心总碱中的3种生物碱含量

目的：建立同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱含量的反相高效液相色谱法。方法：以Hypsil C₁₈(4.6 mm×250 mm,5 μm)为固定相,甲醇-磷酸盐缓冲液(73∶27,pH 9.0)为流动相,检测波长为286 nm及230 nm,流速1 mL·min^-1。结果：3种生物碱分离良好,在20～700 μg·mL^-1线性关系良好,日内、日间RSD在0.24%～4.83%,3种生物碱的加样回收率分别为97.9%,98.4%,98.1%。利用该方法测定了不同批次不同方法提取的莲心总碱中3种生物碱含量,结果显示莲心总碱的甲醇提取方法优于乙醇提取方法。结论：本法简单、快捷、适合于测定莲子心中莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱的含量。     

高效液相色谱法同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱的含量

目的:建立同时测定莲子心中四种异喹啉生物碱--莲心季铵碱、莲心碱、异莲心碱、甲基莲心碱含量的离子对反相高效液相色谱(RP-HPLC)法。方法:用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂,色谱柱:H ibarTR,5μm,250 mm×4.6 mm;流动相:乙腈-水-冰醋酸(55∶45∶1,每1 000 m l中加入4 g十二烷基磺酸钠);流速:1.2 m l/m in;检测波长:282 nm;柱温:30℃。结果:莲心季铵碱在0.94~2.82μg,莲心碱在1.14~3.42μg,异莲心碱在0.7~2.1μg,甲基莲心碱在0.96~2.88μg范围内均呈良好线性关系;并均具有较好的加样回收率(>95%)。结论:该分析方法快速、准确、灵敏度高,重复性好,可用于同时对药材莲子心中四种异喹啉生物碱的含量测定。     

正交试验法优选莲子心中甲基莲心碱提取工艺的研究

目的:从莲子心中提取分离甲基莲心碱。方法:采用正交试验法,以甲基莲心碱含量、得率为指标,多指标综合评分,优选甲基莲心碱提取分离工艺条件。结果:最佳分离方法为:浓度为2.5%的氢氧化钠溶液以体积比1∶1与三氯甲烷进行萃取,由三氯甲烷层得到甲基莲心碱,含量为91.6%,得率为45.6%。结论:该工艺能够有效、快速的从莲子心中提取分离甲基莲心碱。     

HPLC测定建莲莲子心生物碱的含量

目的:建立同时测定莲子心中莲心碱、异莲心碱及甲基莲心碱含量的HPLC方法,并测定了10个不同产地、批次的建莲莲子心生物碱的含量。方法:Platisil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相乙腈-水(55∶45),乙二胺调pH 9.80;检测波长282 nm,流速1 mL·min-1。结果:莲心碱在3.9～115.9 mg·L-1(r=0.999 8)、异莲心碱在4.0～120.7 mg·L-1(r=0.999 8)、甲基莲心碱9.7～290.2 mg·L-1(r=0.999 8)呈现良好的线性关系。平均回收率分别为100.24%,99.17%,100.10%,RSD分别为0.78%,1.31%,1.40%。福建产的10个不同产地、批次的建莲莲子心的莲心总碱的含量多数在1.50%～2.00%。结论:该方法简便、灵敏、准确、可靠。测定的10个产地批次的建莲莲子心中,以产自福建建宁的几何莲子芯茶样品中莲心总碱含量最高,可达2.28%。     

应用均匀设计筛选莲心碱注射液的处方

采用均匀设计，以莲心碱的分解产物的紫外吸收值为指标，对莲心碱注射液的处方进行优选，从而确定莲心碱注射液的最佳处方。     

莲心碱固体分散体的表征及体外溶出度的测定

目的对莲心碱固体分散体的溶出度进行测定,并探明莲心碱在固体分散体中存在的状态。方法以PVP-K30为载体材料,溶剂法制备莲心碱固体分散体,通过显微电镜扫描法、红外光谱法、差示量热扫描法及X-ray衍射法对莲心碱固体分散体的结构进行鉴定,并进行体外溶出度测定。结果将药物制成固体分散体后,莲心碱以无定形状态分散在PVP-K30载体材料中;与原料药及物理混合物相比,固体分散体的溶出度、溶出速率均有明显提高。结论将莲心碱制备成固体分散体后,可显著提高莲心碱的溶出度及溶出速率,为莲心碱相关制剂的研发及临床应用奠定了基础。     

UPLC-MS背景扣除法联合代谢组学技术分析柴胡-白芍药对配伍前后化学成分变化

目的探究柴胡-白芍药对配伍前后化学成分的整体变化情况。方法 UPLC-MS背景扣除法联合代谢组学技术对柴胡-白芍配伍前后的化学成分进行整体分析,采用UPLC-MS分析柴胡、白芍及柴胡-白芍药对各8批提取物的化学成分,并用质谱背景扣除法将柴胡-白芍药对合提物的质谱数据分别扣除白芍、柴胡单提物的质谱数据得配伍后柴胡、白芍的单提物的质谱数据,将柴胡、白芍配伍后的化学成分分别与配伍前各自的化学成分进行主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA),分析柴胡-白芍药对组成药味柴胡、白芍配伍前后整体化学成分的变化情况。结果 UPLC-MS检测柴胡-白芍药对共提物、柴胡及白芍单提物化学成分共57个,结合文献报道指认出其中32个。多元统计结果显示,柴胡-白芍药对配伍前后柴胡中含量发生显著变化的成分有6个,鉴定其中3个成分;白芍中含量发生显著变化的成分有3个,鉴定其中2个成分。分别为柴胡中柴胡皂苷a、3″-O-乙酰化柴胡皂苷a、4″-O-乙酰化柴胡皂苷a配伍后含量降低;白芍中芍药苷、没食子酰基芍药苷或其异构体配伍后含量升高。结论从整体化学组成上比较了柴胡-白芍药对配伍前后的差异,为其配伍机制的阐释奠定了基础。     

丹参NAC基因家族全基因组鉴定及表达研究

目的 基于基因组数据鉴定丹参NAC家族转录因子（SmNACs）基因,并对其进行生物信息学与表达模式分析,为进一步深入阐明其基因功能提供依据。方法 从丹参基因组数据库中鉴定出SmNACs基因,运用生物信息学方法及在线工具分析其结构特征,启动子顺式作用元件,编码蛋白的理化性质、亚细胞定位等,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）测定SmNACs基因在丹参受到茉莉酸甲酯（MeJA）胁迫时的表达模式。结果 从丹参的基因组中共确定了84个SmNACs基因（SmNAC01~SmNAC84）,不均等分布于8条染色体上,编码蛋白的氨基酸长度为120~794 aa,等电点为4.27~10.28;基因结构显示SmNACs基因基本都含有1~10个内含子;上游启动子含有与激素、逆境胁迫应激相关的ABRE、MBS、ARE、LTR、CGTCA-motif、TGACG-motif等顺式作用元件;构建丹参、南丹参与拟南芥的NAC家族成员的系统发育树,将84个SmNACs基因分为23个亚族。转录组数据显示SmNACs基因在丹参不同组织中差异表达,其中7个SmNACs基因在根中的表达水平较高;MeJA处理后,17个SmNACs基因表达水平明显上调,20个SmNACs基因表达水平明显下调。qRT-PCR表达分析发现,MeJA处理后,12个SmNACs基因的表达模式随着激素处理时间的增加呈现上调或下调的趋势,SmNAC09、SmNAC15、SmNAC16受MeJA诱导后48 h表达水平显著上调,SmNAC20、SmNAC77、SmNAC78受MeJA诱导表达水平下调。结论 研究结果为进一步解析SmNACs基因在丹参逆境响应及次生代谢产物生物合成中的调控机制提供了参考。     

基于COI与SRY序列建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的分子鉴别方法

为了建立梅花鹿、马鹿及其杂交鹿茸的特异性PCR鉴别方法。采集不同来源的梅花鹿、马鹿鹿及其杂交鹿的鹿角或鹿茸样品共48份,其中24份为市场流通的待测样品。分别利用COI与SRY基因序列作为其父母本的鉴别标记,对已知样品的COI与SRY基因进行扩增、测序,进行同源比对后根据其变异位点设计特异鉴别引物,分别基于COI与SRY基因建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的特异PCR鉴定方法,并随机对市场流通的24份待测鹿茸样品进行鉴别分析。该实验所构建双位点特异PCR体系,基于COI的鉴别位点,可通过PCR扩增获得232 bp的梅花鹿特异片段,而产生518 bp的马鹿特异片段;而基于SRY的鉴别位点,通过PCR扩增获得803 bp的梅花鹿特异片段,而产生425 bp的马鹿特异片段。随机抽取市场流通中的24个待测鹿茸样品,经鉴定有3个样品属于马·花杂交的鹿茸样品。该实验建立对梅花鹿、马鹿及其杂交鹿的鹿茸的PCR鉴别方法简便、可靠。     

泽泻不同种质资源特性比较研究

目的:探讨不同泽泻种质资源的种质特性,为泽泻地道性研究及实施泽泻GAP生产提供理论与实践依据.方法:在对不同来源的种质进行引种栽培的基础上,观察研究其生物学特性与植株特征及其品质,连续3年品质试验及专题研究.结果:建泽泻、川泽泻和江西泽泻3种泽泻种质问的生物学性状、植株特征及药材品质等具有显著差别.结论:建泽泻与江泽泻是同种植物,原植物都是东方泽泻Alisma orientalis,而与川泽泻属同属不同种的植物,川泽泻原植物是泽泻A.plantagoaquatica.     

青天葵中SKP1同源基因的克隆及原核表达

目的从青天葵Nervilia fordii克隆SKP1的同源基因NSKs,并对编码的蛋白进行生物信息学分析及原核表达,为了深入研究青天葵中SCF复合体的功能奠定基础。方法从青天葵转录组中筛选得到5条SKP1同源基因序列(NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11),构建pGEX-4T-NSKs原核表达载体于大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达GST-NSKs融合蛋白并进行纯化。结果 NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11的开放阅读框(ORF)分别为495、483、489、498和486 bp,编码164、160、162、165和161个氨基酸,蛋白相似性达到73.65%,均属于SKP1蛋白家族,具F-box和Cullin蛋白结合位点。亚细胞定位预测NSK2、NSK3和NSK5定位于细胞核,而NSK7和NSK11定位于细胞质和细胞核。系统进化树结果表明,NSK2、NSK3和NSK5聚为一簇,与小麦和玉米等的同源性较高;NSK7和NSK11聚为一簇,与多头绒泡菌的同源性较高。通过构建原核表达载体,确定了在大肠杆菌Rosetta (DE3)中的有利诱导条件,成功诱导表达并纯化得到5个GST-NSKs重组蛋白。结论成功克隆5个SKP1同源基因NSKs,获得NSKs蛋白,为深入研究青天葵中SCF复合体的功能提供了一定的基础。     

基于miRNA测序技术探讨黄芪-丹参药对干预自发性高血压大鼠肾损害的机制研究

目的基于微小RNA (microRNA,miRNA)高通量测序技术,探讨黄芪-丹参药对通过调控miRNA改善高血压肾损害的作用机制。方法以9只WKY大鼠作为对照组,将自发性高血压大鼠随机分为模型组和黄芪-丹参药对(3.4 g/kg)组,每组9只;黄芪-丹参药对组给予黄芪-丹参药对进行干预,观察各组大鼠血压及肾组织病理变化,并对各组大鼠肾组织进行miRNA测序。结果经黄芪-丹参药对干预4周后,与模型组比较,大鼠血压显著降低(P0.01),大鼠肾小球分叶不明显,系膜区增生减轻。与对照组相比,模型组共筛选出115个差异表达miRNA,其中68个差异表达miRNA上调、47个差异表达miRNA下调;与模型组相比,黄芪-丹参药对组筛选得到91个差异表达miRNA,其中67个差异表达miRNA上调、24个差异表达miRNA下调。差异表达miRNA的qRT-PCR验证结果显示,各组大鼠肾组织miRNA-142-5p、miRNA-3585-5p、miRNA-219a-5p、miRNA-122-5p和miRNA-125b-1-3p表达与miRNA测序结果趋势一致。差异表达miRNA的靶基因预测及功能富集结果显示,基因本体(gene ontology,GO)功能主要富集于阴离子跨膜转运、突触前、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性等方面;京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路主要富集于哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、自噬、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)信号通路等途径。结论miR-219a-5p、miR-3585-5p和miR-142-5p可能是黄芪-丹参药对延缓高血压肾损害进程的直接靶点。     

青藏高原地区塞隆骨资源的分子鉴定和地理分布

为了提供塞隆骨药材资源地理分布的准确资料,研究对青藏高原地区的鼢鼠物种进行了分子鉴定。基于线粒体细胞色素B(cytb)基因测序结果,提取单倍型序列,并利用最大似然法(ML)和贝叶斯法(BI)构建系统发育树,以此判定每个个体的物种类型。共对35个种群的503个样品进行了测序,得到了1 140 bp长度的cytb基因全序列,从中检测到150个单倍型。其中有20个单倍型属于甘肃鼢鼠,有4个单倍型属于斯氏鼢鼠构成单系群,其余126个单倍型属于高原鼢鼠。在35个种群中,有28个全部为高原鼢鼠,有5个种群全部为甘肃鼢鼠,另有2个种群分别由高原鼢鼠+甘肃鼢鼠(DT2)、高原鼢鼠+斯氏鼢鼠(ZN3)混合而成。结果表明,青海湖周边地区和黄河贵德段上游附近地区可以作为塞隆骨药材的正宗来源地,而利用cytb基因可以准确鉴定鼢鼠物种,从而精确判定塞隆骨正宗药材资源的地理分布。     

不同植物基原金线莲生药鉴别

目的对福建金线莲Anoectochilus roxburghii、台湾金线莲A.formosanus和滇越金线莲A.chapaensis进行生药学鉴别。方法采用徒手切片、显微观察和数码照相方法,比较分析不同植物基原金线莲的植物形态特征、根、茎、叶的横切面组织构造及其组织特征,金线莲干燥药材粉末特征。结果福建金线莲和台湾金线莲较滇越金线莲植株小,三者叶脉颜色分别为金黄色、银白色和淡红色,是外观鉴别的依据之一;滇越金线莲根木质部束数量较多,且髓部宽广,茎外韧型维管束数量较多;上表皮细胞形状、中脉上下表面形状与细胞色素分布特点是叶横切面的鉴别点;台湾金线莲上表皮细胞形状为类三角形,其他2种植物为类椭圆形;滇越金线莲中脉上表面较平整,其他2种植物微凹;福建金线莲中脉下表面呈半圆形凸出,其他2种植物微凸,福建金线莲红色物质稀少且位于上表面,台湾金线莲红色物质较多且散在,滇越金线莲有红色物质位于上表皮且集中排一列。结论不同植物基原金线莲植物形态和显微存在差异,为建立金线莲质量标准提供依据。     

过路黄和广金钱草的HPLC指纹图谱比较研究

目的比较过路黄Lysimachia christinae和广金钱草Desmodium styracifolium的化学成分异同,为阐明二者药效异同提供参考。方法采用RP-HPLC建立过路黄和广金钱草的HPLC-UV指纹图谱和HPLC-ELSD指纹图谱,比较二者2种指纹图谱的差异。结果过路黄的HPLC-UV指纹图谱和其HPLC-ELSD指纹图谱的差异很大,UV检测到的强峰并非ELSD检测到的强峰,广金钱草亦然;过路黄的HPLC-UV指纹图谱有14个共有峰,HPLC-ELSD指纹图谱有5个共有峰;而广金钱草的HPLC-UV指纹图谱有28个共有峰,HPLC-ELSD指纹图谱有18个共有峰;13批过路黄的指纹图谱相似度较13批广金钱草的相似度差;过路黄和广金钱草的HPLC-UV指纹图谱有4个共有峰,二者的HPLC-ELSD指纹图谱有2个共有峰。结论 HPLC-ELSD指纹图谱能更好地反映过路黄和广金钱草中量较高的非挥发性成分组成的全貌;市售过路黄的质量差异大,而市售广金钱草的质量稳定;过路黄和广金钱草可能含有2种量较高的相同成分,作为二者治疗相同病症的物质基础,但该2种药材应该各具偏性,各有独特的治疗功用,应明确区分。     

基于指纹图谱和多成分含量测定的关黄柏及川黄柏差异性研究

目的 采用HPLC法建立关黄柏及川黄柏药材指纹图谱,并同时测定5种有效成分的含量,评价关黄柏及川黄柏药材的质量差异。方法 运用HPLC法分别建立10批关黄柏药材和10批川黄柏药材指纹图谱,通过对照品比对,对共有峰进行指认,并测定5种有效成分的含量;对关黄柏及川黄柏药材指纹图谱进行相似度评价,并利用主成分分析（principal component analysis,PCA）和正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA）方法对关黄柏及川黄柏中差异性成分进行分析。结果 关黄柏和川黄柏药材指纹图谱有6个共有峰,指认出其中5个峰,分别是木兰花碱、盐酸药根碱、小檗红碱、巴马汀、小檗碱。通过PCA和OPLS-DA分析筛得关黄柏与川黄柏的3个差异性标志物,分别为木兰花碱、巴马汀和小檗碱,其中巴马汀的含量差异最显著。结论 该方法能有效分析关黄柏及川黄柏质量的差异性,为关黄柏及川黄柏的质量评价与控制提供参考。