复方斑蝥胶囊抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和诱导凋亡的实验研究

复方斑蝥胶囊是以斑蝥为君药,内含多种中药组分,根据部颁标准(第17册)生产的纯中药胶囊制剂,临床上用于治疗多种癌症,以原发性肝癌为主,显示出了较好的疗效。其抗肝癌作用的机制目前在国内外尚未见报道。本课题采用血清药理学方法,观察复方斑蝥胶囊对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和细胞周期、细胞凋亡以及凋亡相关蛋白的影响,探讨复方斑蝥胶囊抗肝癌的作用以及可能的机制,以期为临床应用提供理论依据。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株和实验动物人肝癌细胞SMMC-7721由本校基础医学院病理生理教研室惠赠。新西兰大耳白兔6只,体重为(2.5±0.2…     

应用蛋白质组学技术筛选金银花抗流感病毒血清标志物

目的:比较不同实验组的小鼠血清蛋白的差异以寻找金银花抗流感病毒候选血清标志物,为阐明金银花抗流感病毒作用的途径及机制提供依据.方法:用双向电泳(2-DE)分离不同实验组的小鼠血清蛋白并比较差异,选取血清中明显差异表达蛋白点,进行质谱鉴定和生物信息学分析.结果:经2-DE找出了不同实验组间较为典型的具明显差异的蛋白质点15个,并通过MALDI-TOF-MS进行了结构鉴定,检索得到其中的12个功能蛋白的成分归属.结论:不同实验组的小鼠血清蛋白之间存在明显差异,通过蛋白质组学方法筛选并鉴定出这些血清标志物,为阐明金银花抗流感病毒作用途径及机制提供依据.     

双向电泳-质谱法探索实验性重症肌无力大鼠疾病相关蛋白

目的：分离和鉴定实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清差异表达蛋白，寻找并比较疾病相关蛋白，以进一步阐明重症肌无力的发病机制。方法：采用二维蛋白电泳技术分离正常组和模型组大鼠血清差异表达蛋白，凝胶经银染显色后，Bio—Rad凝胶扫描仪扫描，Imagemaster图像软件分析，差异蛋白点用基质辅助激光解析电离-两级飞行时间串联质谱法进行鉴定。结果：通过双向电泳，建立血清蛋白质双向电泳图谱，重症肌无力组血清双向电泳图谱可见678个蛋白点，而正常对照组可见702个蛋白点。选取9个具有明显差异的蛋白点进行质谱鉴定，共鉴定出5种蛋白质。结论：正常组和模型组大鼠间存在一定的差异表达蛋白。该类蛋白为一些与机体免疫应答、信息调控相关的蛋白质。     

双向电泳-质谱法探索实验性重症肌无力大鼠疾病相关蛋白

目的:分离和鉴定实验性自身免疫性重症肌无力大鼠血清差异表达蛋白,寻找并比较疾病相关蛋白,以进一步阐明重症肌无力的发病机制。方法:采用二维蛋白电泳技术分离正常组和模型组大鼠血清差异表达蛋白,凝胶经银染显色后,Bio-Rad凝胶扫描仪扫描,Imagemaster图像软件分析,差异蛋白点用基质辅助激光解析电离-两级飞行时间串联质谱法进行鉴定。结果:通过双向电泳,建立血清蛋白质双向电泳图谱,重症肌无力组血清双向电泳图谱可见678个蛋白点,而正常对照组可见702个蛋白点。选取9个具有明显差异的蛋白点进行质谱鉴定,共鉴定出5种蛋白质。结论:正常组和模型组大鼠间存在一定的差异表达蛋白,该类蛋白为一些与机体免疫应答、信息调控相关的蛋白质。     

HCV核心蛋白对肝癌细胞系SMMC-7721增殖作用的研究

目的探讨HCV核心蛋白对肝癌细胞系SMMC-7721的增殖作用。方法将空载质粒(对照组)和HCV核心蛋白重组质粒(实验组)分别转染肝癌细胞系SMMC-7721,提取转染后细胞RNA、蛋白质,比较2组细胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白表达水平,收集转染细胞上清液,ELLSA检测2组细胞上清液HCV核心蛋白表达差异,采用MTT检测2组细胞增殖率,并采用transwell检测2组细胞侵袭和迁移情况。结果实验组细胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白表达水平均明显高于对照组(P均0.05),同时实验组细胞上清液HCV核心蛋白表达水平明显高于对照组(P0.05);实验组细胞增殖率明显高于对照组(P0.05);实验组细胞侵袭细、迁移细胞数均明显高于对照组(P均0.05)。结论 HCV核心蛋白能够显著提高肝癌细胞系SMMC-7721增殖、侵袭及迁移。     

复方斑蝥胶囊抑制血管新生的体内体外研究

目的:通过体内和体外实验研究复方斑蝥胶囊对肿瘤血管新生相关因子的作用及可能机制。方法:通过免疫印迹试验检测复方斑蝥胶囊对Hep G2细胞中血管内皮生长因子(VEGF)蛋白表达的影响;选择裸鼠移植性肝癌(H-22)荷瘤模型,观察药物对荷瘤小鼠的抑癌作用,并通过免疫印迹试验检测肿瘤组织中VEGF蛋白的表达情况。结果:复方斑蝥胶囊对Hep G2细胞中VEGF的表达呈浓度和时间依赖性;复方斑蝥胶囊能够抑制H-22荷瘤小鼠肿瘤的生长,并且肿瘤组织中VEGF的表达水平随着药物浓度升高而降低。结论:复方斑蝥胶囊可能通过抑制肿瘤细胞VEGF的表达起到抑制肿瘤血管新生的作用。     

健脾化瘀方抑制肝癌SMMC-7721细胞ERK和c-fos表达的研究

目的：从基因和蛋白水平探讨健脾化瘀方抑制肝癌SMMC-7721细胞ERK和c—fos表达的影响。方法：分别采用RT—PCR和Westemblot方法检测不同浓度健脾化瘀方处理SMMC-7721细胞前后ERK、C—fosmRNA和蛋白水平的改变。结果：健脾化瘀方能抑制肝癌SMMC-7721细胞ERK、c—fosmRNA和蛋白表达。结论：健脾化瘀方的作用机制之一可能是抑制肝癌SMMC-7721细胞ERK和c—fos的基因表达。     

红芪多糖对S_(180)瘤细胞化疗协同增效作用的蛋白质组学分析

目的:分析红芪多糖(Radix Hedysari polysaccharides,HPS)对S180瘤细胞化疗协同增效作用的差异蛋白质。方法:以环磷酰胺(Cyclophsphamide,Cy)和HPS联合Cy治疗荷瘤小鼠后提取瘤细胞总蛋白,用双向电泳对蛋白质进行分离,使用PDQuest 8.0软件对双向电泳图谱进行差异分析,通过质谱技术鉴定差异明显的蛋白点,并用蛋白免疫印迹方法对其中1个蛋白质进行验证。结果:HPS联合Cy组中有24个蛋白点发生明显改变,经质谱和Mascot软件分析,成功鉴定了5个蛋白质,分别为热休克蛋白84(HSP90β)、载脂蛋白A、白蛋白、热休克蛋白β1(HSP27)、未命名蛋白,其中1个高表达,4个低表达。蛋白印迹验证与蛋白质组结果一致。结论:通过蛋白质组学技术,发现了HPS对S180小鼠瘤细胞化疗增效作用的靶标蛋白,这些蛋白质涉及能量代谢、氧化应激反应和凋亡信号转导。     

透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡及凋亡相关因子的影响

[目的]观察透骨草提取物对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,探讨透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的分子机制。[方法]流式细胞术检测透骨草提取物诱导SMMC-7721细胞凋亡的影响;免疫组化法检测透骨草提取物对SMMC-7721细胞caspase-9、-3、-7和x连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）表达的影响。[结果]40．91μg／mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞凋亡率为（26．84±1．23）％,明显高于对照组（P〈0．05）。40．9μg／mL透骨草提取物处理的SMMC-7721细胞Caspase-9、-3、-7蛋白表达明显低于与对照组（P〈0．05）,而XIAP蛋白表达明显高于对照组（P〈0．05）。瞄论]透骨草提取物能通过XIAP／Caspase信号通路抑制SMMC-7721细胞凋亡。关键词：透骨草提取物;SMMC-7721细胞;凋亡;Caspase-9中图分类号：R285．5文献标识码：A文章编号：1672—1519（2013）10—0612—03     

珍珠梅黄酮纳米粒通过抑制Akt/mTOR信号通路诱导肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨珍珠梅黄酮纳米粒对人肝癌SMMC-7721细胞体外生长的抑制作用及其作用机制。方法不同浓度的珍珠梅黄酮纳米粒(40,80,120μmol·L-1)处理SMMC-7721细胞后,采用MTT法检测珍珠梅黄酮纳米粒对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用;Hoechst染色法观察SMMC-7721细胞凋亡的形态学变化;利用Annexin/PI双标记法检测细胞凋亡率;Western blot检测SMMC-7721细胞中Akt,m TOR,p-Akt,p-m TOR及active-caspase3蛋白表达。结果珍珠梅黄酮纳米粒能显著抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞凋亡,具有剂量依赖性;显著降低p-Akt和p-m TOR蛋白表达。结论珍珠梅黄酮纳米粒具有抑制人肝癌SMMC-7721细胞增殖及诱导凋亡的作用,其作用机制可能与抑制Akt/m TOR信号通路有关。     

雷氏大疣蛛毒素对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖及细胞周期的影响

目的 探讨雷氏大疣蛛Macrothele raveni毒素对人肝癌细胞SMMC-7721增殖及细胞周期的抑制作用，进一步探讨其作用的分子机制。方法 采用MTT法测定雷氏大疣蛛毒素对SMMC一7721细胞增殖作用的影响；采用[^3H]TdR掺入法检测雷氏大疣蛛毒素作用前后SMMC7721细胞DNA合成的变化；采用流式细胞术（FCM）探讨雷氏大疣蛛毒素对SMMC-7721细胞凋亡率和细胞周期的影响；采用Western Blot方法研究雷氏大疣蛛毒素对细胞周期相关c-myc蛋白表达的影响。结果 MTT方法表明雷氏大疣蛛毒素对SMMC-7721细胞增殖有较强的抑制作用（P〈0．05），时效和量效关系良好。雷氏大疣蛛毒素可以抑制SMMC-7721细胞DNA的合成。流式细胞仪检测结果发现雷氏大疣蛛毒素作用后SMMC-7721细胞凋亡率增加，细胞周期阻滞在G2／M期。Western Blot方法进一步检测到雷氏大疣蛛毒素作用SMMC7721细胞72h后，c-myc蛋白表达减弱。结论 雷氏大疣蛛毒素可以抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和DNA的合成，其机制可能是诱导细胞凋亡，使细胞周期相关c-myc蛋白表达减弱，导致细胞周期的变化。     

消癌解毒方含药血清诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的实验研究

目的 探讨消癌解毒方的抗肿瘤作用机理.方法 消癌解毒方含药血清作用人肝癌SMMC-7721细胞后,采用电镜技术观察细胞的形态改变,流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡情况.结果 消癌解毒方能明显促进肝癌细胞的凋亡.电镜下SMMC-7721细胞出现明显的细胞凋亡的形态学改变;凋亡作用以高剂量组效果最佳,凋亡率与顺铂组相似(P＞0.05).结论 消癌解毒方通过诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡抑制其生长.     

红花多糖对人肝癌SMMC-7721细胞Bcl-2与 Bax基因转录及蛋白表达的影响

目的:研究红花多糖(SPS)体外抑制人肝癌细胞株SMMC-7721增殖、诱导凋亡及对凋亡调控基因Bax,Bcl-2基因转录和蛋白表达的影响,探讨SPS诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制.方法:不同剂量的SPS(0,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28 g·L-1)分别作用于体外培养的SMMC-7721细胞,采用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞的抑制率;用Ca2+依赖性磷脂结合蛋白( Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双染法观察细胞凋亡的形态学改变;通过罗丹明123( Rho123)荧光显微镜检测线粒体膜电位(△Ψm);以实时荧光定量PCR技术(real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)法检测细胞凋亡相关因子Bcl-2及Bax mRNA水平和蛋白水平的表达情况.结果:SPS对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞具有抑制增殖作用,且具有明显的时间和剂量相关性;荧光显微镜下SPS作用的细胞呈现典型的凋亡细胞形态;肝癌细胞内Rho123荧光强度明显减弱.SPS作用后细胞内Bcl-2蛋白和mRNA表达水平均降低,Bax蛋白和mRNA的表达水平均升高,二者的变化趋势均呈一定的时间依赖关系;而且,Bcl-2/Bax比值随SPS时间的延长显著降低且变化趋势均呈一定的时间依赖关系.结论:SPS能够显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖,诱导SMMC-7721细胞凋亡,其作用机制可能与上调Bax的表达及下调Bcl-2的表达和降低线粒体膜电位有关.     

Induction of apoptosis in human hepatocarcinoma SMMC-7721 cells in vitro by flavonoids from Astragalus complanatus

Aim of the study

Flavonoids extracted from the seeds of Astragalus complanatus R.Br. reduce the proliferation of many cancer cells. The present study was carried out to evaluate the effects of these flavonoids from Astragalus complanatus (FAC) on human hepatocarcinoma cell viability and apoptosis and to investigate its mechanisms of action in SMMC-7721 cells.

Materials and methods

Cell viability was measured using the MTT assay. To detect apoptotic cells, SMMC-7721 cells treated with FAC were stained with Hoechst 33258 and subjected to agarose gel electrophoresis. Quantitative detection of apoptotic cells was performed by flow cytometry. The effects of FAC on apoptosis and cell cycle regulatory genes and proteins in SMMC-7721 cells were examined using an S series apoptosis and cell cycle gene array and Western blot analysis.

Results

The growth of SMMC-7721 and HepG2 cells was inhibited by treatment with FAC. Cell death induced by FAC was characterized by nuclear condensation and DNA fragmentation. Moreover, the cell cycle was arrested in the G0/G1 and S phases in FAC-treated SMMC-7721 cells. A sub-G1 peak with reduced DNA content was also formed. The activity of caspase-3 was significantly increased following FAC treatment. Microarray data indicated that the expression levels of 76 genes were changed in SMMC-7721 cells treated with FAC: 35 genes were up-regulated and 41 were down-regulated. Western blot analysis showed that caspase-3, caspase-8, Bax, P21, and P27 protein levels in SMMC-7721 cells were increased after 48 h of FAC treatment, while cyclinB1, cyclinD1, CDK1, and CDK4 protein levels were decreased.

Conclusions

These results suggest that FAC may play an important role in tumor growth suppression by inducing apoptosis in human hepatocarcinoma cells via mitochondria-dependent and death receptor-dependent apoptotic pathways.     

镰形棘豆对SMMC-7721肝癌细胞增殖及MMP-2表达的影响

目的:观察镰形棘豆对人肝癌细胞SMMC-7721的增殖及其基质金属蛋白酶-2(MMP-2)分泌量的影响.方法:以不同质量浓度(25,50,100,250,500 mg·L-1)的镰形棘豆挥发油、总多糖、总黄酮、总生物碱和总皂苷部位处理SMMC-7721细胞24 h后,采用MTT法检测各部位对SMMC-7721细胞增殖的抑制作用;采用ELISA法测定挥发油部位和总黄酮部位处理SMMC-7721肝癌细胞24 h后细胞上清中MMP-2的分泌量;Real-time PCR法检测处理24 h后MMP-2 mRNA的转录情况.结果:MTT实验结果表明,挥发油和总黄酮部位抑制SMMC-7721细胞的增殖,并表现出一定的浓度依赖性.ELISA实验表明挥发油部位显著性地抑制MMP-2分泌量;Real-time PCR实验表明挥发油和总黄酮均显著抑制MMP-2 mRNA的表达.结论:镰形棘豆挥发油和总黄酮部位抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖活性,可能与其下调MMP-2的分泌量和转录水平有关.     

镰形棘豆诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及初步的机制研究

目的:观察镰形棘豆总黄酮对人肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响及初步的机制探讨.方法:不同剂量的镰形棘豆总黄酮处理SMMC-7721细胞24 h后,MTT法观察总黄酮对细胞增殖的抑制作用;应用光学和荧光显微镜观察总黄酮对SMMC-7721细胞形态的影响;应用流式细胞仪检测SMMC-7721细胞周期的变化;Annexin V-FITC/PI双染法检测总黄酮对SMMC-7721细胞凋亡的影响.结果:MTT实验结果表明,镰形棘豆总黄酮抑制SMMC-7721细胞的增殖,并呈现出一定的浓度依赖性.Hoechst33258染色结果显示,经镰形棘豆总黄酮处理的细胞出现了多种凋亡特征和超微结构的变化.镰形棘豆总黄酮作用SMMC-7721细胞后可观察到G1期细胞明显增多,凋亡细胞的比例升高,并且呈浓度依赖性.结论:镰形棘豆总黄酮抑制SMMC-7721细胞的增殖,与其诱导细胞周期阻滞和使细胞形态发生变化而引起细胞凋亡的活性有关.值得进一步深入研究和阐述镰形棘豆抗肿瘤的作用机制.     

蜂王浆冻干粉对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响

目的观察蜂王浆冻干粉对人肝癌细胞系SMMC-7721增殖的影响。方法体外培养人肝癌细胞系SMMC-7721,MTT比色法观察蜂王浆冻干粉水溶液及蜂王浆冻干粉含药血清对其增殖的影响。结果蜂王浆冻干粉水溶液能促进人肝癌细胞系SMMC-7721增殖,呈剂量依赖性。而蜂王浆冻干粉含药血清则能抑制该细胞的增殖,其抑制效应亦呈剂量依赖性。结论蜂王浆冻干粉的抗癌效应可能是其代谢产物或刺激机体产生的活性物质所致。     

p53途径在氯化两面针碱抑制SMMC-7721细胞增殖中的作用

目的 研究氯化两面针碱(nitidine chloride,NC)处理后p53通路的分子水平变化,以说明p53途径在NC抑制人肝癌细胞SMMC-7721增殖中的作用。方法 应用MTT比色法测定NC对SMMC-7721细胞存活率的影响,细胞克隆集落形成实验测定NC对细胞增殖的抑制作用;实时荧光定量PCR检测不同剂量NC对p53、p21mRNA表达的影响;酶联免疫吸附法测定p53、p21蛋白含量的变化。结果 NC (0.15,0.30,0.60,1.20,2.40,4.80 mg·L-1)浓度依赖性地降低SMMC-7721的存活率,作用48 h时IC50值为(1.03±0.18)mg·L-1;NC可明显抑制细胞集落形成,剂量为0.15,0.30 ng·L-1时,抑制率分别是74.65％、88.48％,剂量为0.60 mg·L-1时,抑制率达到了100％; NC可明显提高癌细胞中p53、p21 mRNA和蛋白的表达,并呈浓度依赖性。结论 p53通路可能在NC诱导的SMMC-7721细胞增殖抑制中起重要作用。     

红花多糖对肝癌细胞增殖阻滞的机制探讨

目的： 通过研究红花多糖（safflower polysaccharide,SPS）对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响,探讨SPS抗肿瘤作用的分子机制。 方法： 体外培养人肝癌SMMC-7721细胞,加入含不同质量浓度SPS（0,0.02,0.04,0.08,0.16,0.32,0.64,1.28 g·L^-1）的培养液,分别培养24,48 h,用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT法）检测SPS对细胞增殖的影响;用免疫组化法检测0.16,0.32,0.64 g·L^-1SPS作用肝癌细胞48 h,细胞的细胞周期素B₁（cyclin B₁）蛋白表达;采用实时荧光定量PCR技术（realtime PCR,RT-PCR）和蛋白免疫印迹（Western blot）法检测细胞分裂周期25B（Cdc25B）基因的表达。 结果： 肝癌细胞的生存率随SPS浓度和作用时间的增加而降低,而1.28 g·L^-1SPS组除外。SPS作用48 h后SMMC-7721细胞的cyclin B₁蛋白、Cdc25B蛋白和mRNA表达降低,并具有剂量依赖性。 结论： SPS可能通过抑制细胞周期相关基因的表达,诱导肝癌细胞增殖阻滞,进而起到抗肿瘤作用。